Bioszervetlen kémia


2010


Table of Contents

1. 1. MI A BIOSZERVETLEN KÉMIA?
Magyar nyelvű könyvek
Angol nyelvű könyvek
Ellenőrző kérdések
2. 2. FÉMIONOK A BIOLÓGIAI RENDSZEREKBEN
2.1. A létfontosságú elemek eloszlása a természetben és az élő szervezetekben
2.2. Az elemek biológiai funkciója
2.3. A elemek kémiai és biológiai evolúciója
Ellenőrző kérdések
3. 3. BIOMOLEKULÁK KÖLCSÖNHATÁSA FÉMIONOKKAL
3.1. A fehérjék és alkotóik fémkomplexei
3.1.1. Az aminosavak fémkötő tulajdonságai
3.1.2. A peptidek, mint fehérjemodellek
3.1.3. A fehérjék, mint ligandumok, metalloproteinek
3.2. A nukleinsavak és alkotóik fémkomplexei
3.3. Nagy szelektivitást eredményező biomolekulák fémkomplexei
3.3.1. Az ionofórok és sziderofórok
3.3.2. A prosztetikus csoportok
3.4. Egyéb biomolekulák fémkomplexei
Ellenőrző kérdések és feladatok
4. 4. A BIOLÓGIAI RENDSZEREK KATALIZÁTORAI, AZ ENZIMEK
4.1. Az enzimekről általában
4.2. Az enzimek kialakulása
4.3. Az enzimek általános működési mechanizmusa
4.4. Az enzimek kinetikai sajátságai
4.5. Az enzimek gátlása (az inhibíció), az enzimek működésének szabályozása
Ellenőrző kérdések és feladatok
5. 5. FÉMIONOK FELVÉTELE, SZÁLLÍTÁSA ÉS TÁROLÁSA. BIOMINERALIZÁCIÓ
5.1. A fémionok szelektív felvétele
5.2. A vas szállítása és tárolása az emberi szervezetben
5.2.1. A transzferrin
5.2.2. A ferritin és a hemosziderin
5.3. A réz felvétele, szállítása és tárolása
5.4. A metallotioneinek
5.5. Biomineralizáció
5.5.1. A kalcium-foszfát a csontokban
5.5.2. A kalcium-karbonát, mint héjképző anyag
5.5.3. Amorf kovasav/szilícium-dioxid
5.5.4. A vas bioásványok
Ellenőrző kérdések és feladatok
6. 6. EGYENLŐTLEN ELEKTROLITMEGOSZLÁS: AZ ALKÁLI- ÉS ALKÁLIFÖLDFÉM-KATIONOK FUNKCIÓJA ÉS TRANSZPORTJA
6.1. A Na+-, K+-, Ca2+- és Mg2+-ionok szelektív felismerése
6.2. Membrántranszport folyamatok, ionpumpák
6.3. A Na+-, K+-, Ca2+- és Mg2+-ionok biológiai szerepe
6.3.1. Az ingerület terjedése
6.3.2. Az izomműködés
Ellenőrző kérdések és feladatok
7. 7. ELEKTRONSZÁLLÍTÓ FEHÉRJÉK
7.1. A vas-kén fehérjék
7.1.1. A rubredoxinok
7.1.2. A [2Fe-2S] ferredoxinok
7.1.3. A [4Fe-4S] ferredoxinok
7.2. A citokrómok
7.3. Az 1-es típusú, ún. kék réz fehérjék
7.4. A nagy távolságú ('long-range') elektrontranszfer és az elektronszállító rendszerek
Ellenőrző kérdések
8. 8. A FOTOSZINTETIKUS EGYSÉG MŰKÖDÉSE, FÉMIONJAI: A MAGNÉZIUM ÉS A MANGÁN
8.1. A napfény elnyelődése és továbbítása a fotoszintetikus rendszerben
8.2. A fotoszintetikus reakcióközpontok
8.2.1. A víz fotolízise
8.2.2. A két fotorendszert összekötő elektronszállító lánc
8.2.3. Fotorendszer I.
8.2.4. A CO2 redukciója
Ellenőrző kérdések és feladatok
9. 9. A DIOXIGÉN, O2 BIOLÓGIAI SZEREPE, FELVÉTELE ÉS SZÁLLÍTÁSA
9.1. Az oxigén tulajdonságai, előfordulása és szerepe biológiai rendszerekben
9.2. Oxigénhordozó komplexek
9.2.1. A hemoglobin és a mioglobin
9.2.2. A hemeritrin
9.2.3. A hemocianin
Ellenőrző kérdések és feladatok
10. 10. KISMOLEKULÁK AKTIVÁLÁSA AZ ÉLŐ SZERVEZETBEN
10.1. Az O2 aktiválása és metabolizmusa
10.1.1. Vastartalmú oxigenázok
10.1.2. Réztartalmú enzimek: oxidázok és oxigenázok
10.1.3. A citokróm c oxidáz; a légzési lánc és az oxidatív foszforiláció
10.1.4. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) enzimek
10.1.4.1. Vas- és mangán- és nikkeltartalmú SOD-ok
10.1.4.2. A Cu/Zn-tartalmú SOD
10.1.5. A peroxidázok és a kataláz
10.1.6. A vanádiumtartalmú haloperoxidázok
10.1.7. A glutation peroxidáz
10.2. A nitrogén körforgás metalloenzimei
10.3. A hidrogenázok
10.4. A CO, CO2 és CH4 bioszervetlen kémiája
10.4.1. A metil-koenzim M reduktáz
10.4.2. CO dehidrogenáz = CO oxidoreduktáz = Acetil CoA szintáz
Ellenőrző kérdések és feladatok
11. 11. EGYÉB REDOXI ENZIMEK A BIOLÓGIAI FOLYAMATOKBAN
11.1. A nukleotidok átalakítása: a ribonukleinsav reduktáz enzimek
11.2. A metán monooxigenáz
11.3. Oxotranszferáz enzimek
11.4. Az alkohol dehidrogenáz enzimek
Ellenőrző kérdések és feladatok
12. 12. A METALLOHIDROLÁZOK
12.1. A szénsavanhidráz
12.2. Foszforsavészterek enzimatikus hidrolízise
12.2.1. Foszforsav-monoészterázok
12.2.2. Foszforsavdiészterázok
12.3. Peptidek, fehérjék enzimatikus hidrolízise
12.4. Egyéb metallohidrolázok
12.4.1. Az ureáz
12.4.2. A β-laktamáz
12.5. A ribozimok
Ellenőrző kérdések és feladatok
13. 13. CSOPORTTRANSZFER ENZIMEK
13.1 Az ATP és a foszforiltranszfer reakciók
13.2 A metilkobalamin és a B12 koenzim
Ellenőrző kérdések és feladatok
14. 14. A FÉMIONOK ÖSSZETETT FIZIOLÓGIÁS HATÁSAI
14.1. A fémionok szerkezetépítő szerepe
14.2. A fémionok fiziológiás szabályzó szerepe
14.2.1. A Zn(II) szerepe a genetikus információátadásban
14.2.2. A Ca2+-ion, mint a sejten belüli jelátviteli rendszer egyik meghatározó eleme
14.3 Az aktív centrum finomhangolásával elérhető speciális sajátságok
Ellenőrző kérdések és feladatok
15. 15. A FÉMIOHÁZTARTÁS ZAVARAI. TOXIKUS FÉMIONOK
15.1. Fémionok hiánya és fölöslege
Vas
Réz
Cink
Szelén
Kalcium
Egyéb fémionok
15.2. Toxikus fémionok
Ólom
Kadmium
Higany
Tallium
A berillium és az alumínium
Króm
Ellenőrző kérdések és feladatok
16. 16. FÉMKOMPLEXEK GYÓGYÁSZATI JELENTŐSÉGE: DIAGNOSZTIKAI ÉS TERÁPIÁS SZEREK
16.1. Rákellenes szerek
16.2. Radioaktív diagnosztikai és terápiás szerek (nukleáris medicina)
16.3. Kontrasztanyagok
16.4. Fertőzésgátló szerek
16.5. Gyulladásgátló aranykomplexek
16.6. Bizmutvegyületek, mint gyomorsavmegkötő és fekélyellenes szerek
16.7. Idegrendszerre ható fémvegyületek
16.8. Inzulinutánzó fémkomplexek
16.9. Szív- és érrendszerre ható szerek.
Ellenőrző kérdések és feladatok
17. 17. TÁVLATOK
17.1. A genomika és a proteomika kora
17.2. Gyakorlati alkalmazások
Ellenőrző kérdések és feladatok
18. M1. KOORDINÁCIÓS KÉMIAI ALAPOK
M1.1.Termodinamikai aspektus
M1.1.1. A hard-szoft sav-bázis elmélet
M1.1.2. A kelát effektus és a makrociklusos effektus
M1.1.3. A ligandumtér stabilizáció és az Irving-Williams sor
M1.1.4. Biológiailag fontos fémionok koordinációs geometriája
M1.1.5. A redoxipotenciál szabályzása
M1.2. Kinetikai aspektus
M1.2.1. A ligandumcsere reakciók sebessége
M1.2.2. Elektrontranszfer reakciók
M1.2.3. Koordinált ligandumok reakciói
19. M2. A BIOSZERVETLEN KÉMIA FIZIKAI ÉS BIOLÓGIAI VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI
M2.1. Az elektromágneses sugárzás és az anyag kölcsönhatása
M2.2. A molekulaszerkezet tanulmányozása röntgensugárzást alkalmazó módszerekkel
M2.2.1. Röntgen krisztallográfia
M2.2.2. Röntgensugár abszorpciós módszerek.
M2.3. Mágneses rezonancia módszerek.
M2.3.1. Az ESR spektroszkópia
M2.3.2. Az NMR spektroszkópia
M2.4. A Mössbauer spektroszkópia
M2.5. Optikai módszerek
M2.5.1. Az UV/látható spektroszkópia
M2.5.2. Az infravörös sugárzást felhasználó spektroszkópiai módszerek
M2.5.3. A CD spektroszkópia
M2.6. A fehérjemolekulák azonosítása
M2.6.1. A fehérjék gélelektroforézise
M2.6.2. A fehérjék aminosav-sorrendjének meghatározása
M2.6.2.1. Tömegspektrometria.
M2.6.2.2. A polimeráz láncreakció és a DNS szekvenciájának meghatározása.
20. M3. A LÉTFONTOSSÁGÚ NYOMELEMEK FONTOSABB BIOLÓGIAI FUNKCIÓI ELEMCSOPORTOK SZERINT
Alkáli fémek, Na+, K+, (Li+)
Alkáli földfémek, Mg2+, Ca2+ Ba2+
Átmeneti fémek
Vanádium
Króm
Mangán
Vas
Kobalt
Nikkel
Réz
Cink
Molibdén
A p-mező elemei

Gyurcsik Béla, Kiss Tamás, Sóvágó Imre, Várnagy Katalin

Elektronikus tananyag, 2010

Készült a TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0030 támogatásával

Chapter 1. 1. MI A BIOSZERVETLEN KÉMIA?

Kulcsszavak: koordinációs kémia, biológiai kémia, szervetlen kémia, biokémia, határtudományok, a bioszervetlen kémia tárgya

A bioszervetlen kémia választ keres arra, hogy a fémionok milyen hatást fejtenek ki a biomolekulák egészére, milyen módon befolyásolják, ill. alakítják ki azok funkcióit. A bioszervetlen kémiai nézőpont a biológiai rendszereket a szervetlen elemek, a fémionok oldaláról vizsgálja, és jól kiegészíti a biológiai, ill. a biokémiai szemléletet. A bioszervetlen kémiai tárgyalásnak ott van létjogosultsága, ahol molekuláris szintű ismeretekkel rendelkezünk az illető biológiai-biokémiai-fiziológiai folyamatról.

A bioszervetlen kémia az 1960-as években kialakult új határtudomány, amely a szervetlen kémiának olyan klasszikusnak számító tudományágakkal való kapcsolatából és átnövéseiből alakult ki, mint a fizika, a biológia, a mezőgazdasági és élelmezési tudományok, a farmakológia, a toxikológia, a fiziológia, a gyógyászat és a környezeti tudományok.

1.1. ábra: A bioszervetlen kémia interdiszciplináris jellge.

Önálló tudományként való elkülönülése számos a kémia különböző területein bekövetkezett felfedezésnek, jelentős fejlődésnek volt köszönhető, Ilyenek:

  • A szervetlen kémián belül kialakult a koordinációs kémia, és a fémkomplexek szerkezeti felépítését és képződésük egyensúlyi és kinetikai viszonyait illetően jelentős eredmények születtek. Olyan kölcsönhatásokat írtak le, melyek biológiai viszonyok között is szerepet játszhatnak.

  • Az analitikai kémia fejlődése, a nagyhatékonyságú kromatográfiás elválasztási módszerek kifejlesztése, a nyomnyi mennyiségű fémek biztonságos kimutatása biológiai mintákban is.

  • Spektroszkópiás és diffrakciós technikák sikeres alkalmazása a (metallo)enzimek szerkezetének felderítésében.

  • Hatékony preparatív technikák kidolgozása. Szervetlen komplexek szintézise; a biológiai molekulák modellezésében való alkalmazásuk.

  • Egyes fémionoknak, mint környezeti veszélyforrásoknak a felismerése.

  • Fémionok és fémkomplexeik gyógyászati alkalmazásának elterjedése.

  • A nyomelemek fontossá válása a növényi, állati és emberi táplálék kiegészítőkben.

Leíró ismereteket adunk, elsősorban az élő szervezetben betöltött funkciók szerint és nem elemenként csoportosítva.

Elemek eloszlása a biológiai rendszerekben, evolúciójuk.

Biomolekulák és fémionok kölcsönhatásai.

Enzimek, metalloenzimek.

Fémionok anyagcseréje, felvétel, szállítás, raktározás.

A fémionok szerepe a biológiai folyamatokban (egyenlőtlen eloszlás következményei, elektronszállítás, enzimek, kismolekulák aktiválása).

Fémionok összetett fiziológiai hatásai (fémionháztartás zavarai, toxikus fémionok, gyógyászati alkalmazások).

Koordinációs kémiai alapok, vizsgálómódszerek.

A tananyag feldolgozása során további információkat szerezhet a következő tan- és kézikönyvekből, ill. egyéb irodalmakból:

Magyar nyelvű könyvek

  1. Kiss T, Gajda T, Gyurcsik B: Bevezetés a bioszervetlen kémiába, Nemzeti Tankönyvkiadó, Budapest, 2007

  2. Körös Endre: Bioszervetlen kémia; Gondolat, Budapest, 1980

  3. Gergely P., Erdődi F., Vereb. Gy.: Általános és bioszervetlen kémia; Semmelweis Kiadó, Budapest, 1992

  4. Wagner Ö., Hencsei P.: Bioszervetlen kémia; Műegyetemi Kiadó, Budapest, 2001

  5. Varga M.: Bioszervetlen kémia; ELTE Eötvös Kiadó, Budapest, 2006

  6. P. Karlson: Biokémia, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1972

  7. Bíró E.: Biokémia I-II, (egyetemi jegyzet), Tankönyvkiadó, Budapest, 1979

  8. Elődi P.: Biokémia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1989

Angol nyelvű könyvek

  1. D.R. Williams: The metals of Life, Camelot Press, London, 1971

  2. H. Sigel (ed) Metal ions in biological systems, Vol 1-44, Dekker, 1973-2004, H.Sigel, A.Sigel, R.Sigel (eds) Metal Ion sin Life Sciences, Vol 1-, Wiley, Chichester, 2005-

  3. D.R. Williams (ed) An Introduction to bio-inorganic chemistry, Springfield, Illionis, 1976

  4. A.M. Fiabane, D.R. Williams: The principles of Bio-Inorganic Chemistry, The Chem. Soc., London, 1977

  5. E. Ochiai: Boinorganic chemistry, An introduction, Allyn and Bacon, Boston, 1977

  6. G.I. Eichorn: Inorganic biochemistry I-III, Elsevier, New York, 1973

  7. D.A. Phipps: Metals and metabolism, Clarendon Press, Oxford, 1976

  8. H.A.O. Hill (ed) Inorganic biochemistry 1-2, The Chemical Soc., London, 1977, 1979

  9. R.W. Hay: Bio-inorganic chemistry, Ellis Horwood, Chichester, 1987

  10. Environmental Chemistry and Toxicology of Aluminium, Lewis Publ., Chelsea, 1989

  11. K. Burger (ed) Biocoordination chemistry, Ellis Horwood, Chichester, 1990

  12. M.J. Kendrick, M.T. May, M.J. Plishka, K.D. Robinson, Metals in Biological systems, Ellis Horwood, Chichester, 1992

  13. J.A. Cowan, Inorganic Biochemistry An introduction, VCH, Columbus, 1993

  14. B.K. Keppler (ed) Metal complexes in cancer chemotherapy, VCH, Weinheim, 1993

  15. S.J. Lippard, J.M. Berg: Principles of Bioinorganic chemistry, University Science Book, Mill Valley, 1994

  16. D.M. Taylor, D.R. Williams: Trace element medicine and chelation theraph, The RS C, Cambridge, 1995

  17. W. Kaim, B. Schwedereski: Bioinorganic chemistry: Inorganic elements of chemistry of life, Wiley, New York, 1994

  18. G. Berthon (ed) Handbook of Metal-Ligand Interactions in Biological Fluids I-II Vol 1-2, Marcell Dekker, New York, 1995,

  19. R.J.P. Williams, J.J.R.Frausto da Silva: The natural selection of the elements, Clarendon Press, Oxford, 1996

  20. M.J. Clarke, P.J. Sadler (eds) Metallopharmaceuticals I-II, Topics in biological Inorganic Chemistry, Springer, Berlin 1999

  21. N.P. Farrell (ed) Uses of inorganic chemistry in medicine, RS C, Cambridge, 1999

  22. R.J.P. Williams, J.J.R.Frausto da Silva: Biological chemistry of the elements, 2nd edition, Oxford University Press, New York, 2001

  23. R. Crichton (ed) Inorganic biochemistry of iron metabolism, 2nd ed., Wiley, Chichester, 2001

  24. C.Exley (ed) Aluminium and Alzheimer's disease, Elsevier, Amsterdam, 2001

  25. R.J.P. Williams, J.J.R.Frausto da Silva: Bringing chemistry to life: from matter to man, Oxford University Press, New York, 2001

  26. R. M. Roat-Malone: Bioinorganic chemistry, Wiley, Hoboken, 2002

  27. Comprehensive Coordination Chemistry II; Eds J.A. McCleverty, T.J. Meyer, L. Que, W.B. Tolman, Elsevier, Amsterdam, 2004

  28. M. Gielen, E.R.T. Tiekink (eds) Metallotherapeutic drugs & metal-based diagnostic agents, Wiley, Chichester, 2005

  29. R.H. Holm, E.I. Solomon (eds) Bioinorganic Enzymology, Chem. Rev, 1996, 96

  30. C. Orvig, M.A. Abrams (eds) Medicinal Inorganic Chemistry, Chem Rev., 1999, 99

Ellenőrző kérdések

- A tudományterületek differenciálódása és integrálódása

- A bioszervetlen kémia kialakulásának szükségszerűsége

- A bioszervetlen kémia tárgya

Chapter 2. 2. FÉMIONOK A BIOLÓGIAI RENDSZEREKBEN

Kulcsszavak: létfontosságú elemek, hasznos elemek, mérgező elemek, ajánlott napi dózis, biohozzáférhetőség, elemek kémiai evolúciója, elemek biológiai evolúciója, ősóceán, redukáló atmoszféra, oxidáló atmoszfára.

2.1. A létfontosságú elemek eloszlása a természetben és az élő szervezetekben

Az élet egy olyan összetett folyamat, amely a szervezet energiafogyasztása révén fenntartott szabályozott stacionárius áramló egyensúllyal jellemezhető. Az ilyen rendszerek egymással szorosan csatolt részrendszerekből állnak, melyek egymást követő egyensúlyai, a valódi termodinamikai egyensúlyt a csatolás miatt elérni nem tudják. Ennek a szoros kapcsolatsornak lehet eredménye az is, hogy egyes közbenső lépéseit termodinamikailag kedvezményezetlen (ΔG>0) reakciók is alkothatják. Az ilyen stacionárius egyensúllyal jellemezhető rendszerek nyitottak, számukra a környezettel való anyagcsere alapvető fontosságú, szemben a jobban ismert és matematikailag is könnyebben kezelhető „halott” termodinamikai egyensúllyal.

Az élet nélkülözhetetlen feltételét jelentő környezettel való folyamatos anyagcsere elvben minden elemre kiterjed. Az elemeknek a szervezetben való megjelenése, elterjedése külső és belső feltételek függvénye, jelentősen meghatározza azt az elemek „biohozzáférhetősége” (a biológiai rendszerek számára való hozzáférhetőséget jelenti). Egy felnőtt ember átlagos elemösszetételét és néhány fontosabb elem (bioelem) napi szükségletét a 2.1. táblázat tartalmazza.

2.1. táblázat: Egy felnőtt emberi test (70 kg) átlagos elemösszetétele és néhány fontosabb elem napi szükséglete; a nem létfontosságú; b létfontossága bizonytalan.

A nagy H- és O-tartalomban tükröződik a test igen nagy víztartalma. Ezek mellett a C és N a szerves anyag jelenlétére utal. Az első fémes elem, a kalcium az ötödik a sorban, mint vázképző elem fontos. Ezt követi a K, a Cl, a Na és a Mg, melyek „makro” tápelemek, majd a Fe és Zn jön a sorban, a metalloproteinek a metalloenzimek két legelterjedtebb fémionja. A Rb és a F után jönnek a nyomelemek, (egy definíció szerint azok, melyek napi szükséglete a 25 mg-ot nem haladja meg), mint a Cu, a Mn, a Co és a Mo; ez utóbbiból mindösszesen 5 mg-ot tartalmaz egy emberi szervezet. A 2.1. táblázat elemei közül „hasznosaknak” azokat nevezzük, melyek hiánya súlyos, irrevezibilis elváltozásokat idéz elő a szervezetben. Ha ez a hasznosság több faj esetén is fennáll, az elemeket „létfontosságúaknak” nevezzük. Az optimális működésben zavarokat előidéző elemeket célszerű megkülönböztetni; ezeket „károsaknak” nevezzük. A 2.1. táblázatban nem elhanyagolható számban vannak nem hasznos elemek is, mint a Rb, Zr, Ba, Al vagy a Br. Ezek feltehetőleg valamely létfontosságú elemmel való hasonlóságuk révén dúsultak fel a szervezetben, mint a Li+, Rb+, Cs+vs. Na+, K+; a Sr2+, Ba2+vs. Ca2+, Mg2+; Brvs. Cl; Al3+vs. Fe3+. Vannak elemek, melyeket toxikusnak ismerünk, mint az Hg, Pb, Cd, ezeknek pozitív hatását eddig nem mutatták ki. De nem biztos, hogy ez egyértelműen a káros voltukat bizonyítja, hiszen lehet, hogy a mai analitikai kimutathatósági határnál kisebb koncentrációban mutat az elem hasznos tulajdonságokat. Nem zárható ki, hogy valamilyen fiziológiai funkciója   ha nem is bizonyosan létfontosságú   az evolúció során jóval nagyobb számú elemnek kialakult, mint a ma ismertek.

Nem minden faj számára ugyanazon elemek a létfontosságúak, sőt a faj nem minden egyede számára ugyanolyan mennyiségben létfontosságúak ezek az elemek. A 2.1. ábra dózis-fiziológiai hatás diagramokat mutatja a hasznos elemekre. A „terápiás tartomány szélessége” elemektől függően széles határok között változik, a K+ esetén például igen széles néhány száz mg, míg a csak újabban felismert létfontosságú Se esetén igen szűk, csupán néhány μg. Ennél mind a kisebb koncentráció (hiány) mind a nagyobb koncentráció (fölösleg) betegségek kialakulásához vezethet, amit vagy az elemek pótlásával, vagy a fölösleg eltávolításával (pl. kelátterápiával) szüntethetünk meg (lásd a 15. fejezetet). A ma csak káros hatásúnak ismert elemek, mint a Be, Cd, Hg, esetén a dózis-fiziológiai hatás görbe csak a negatív fiziológiai hatás tartományban van.

2.1. ábra: Sematikus dózis-fiziológiai hatás válasz diagram egy létfontosságú és egy toxikus elem esetén.

2.2. Az elemek biológiai funkciója

A ma létfontosságúnak tartott 20 elem a betöltött funkciójuk alapján a következőképpen csoportosíthatók:

(1) Az ún. vázképző elemek az élő szervezet külső és belső vázának kialakításában vesznek részt, mint a csont, a tojáshéj, a fogak vagy a tüskék. Alapvető fontosságú az élő szervezetek szerkezetének molekuláris szintű stabilizálása. Például azáltal, hogy semlegesítik a DNS negatívan töltött foszfát-csoportjainak vagy a sejtmembránok töltött felületének elektrosztatikus taszító hatását. Ezek az elemek az anionokat alkotó C, O, P, S, N, F, Si és a kationképző K, Ca és Mg.

(2) A főként egyatomos ionok, melyek, mint töltéshordozók az információ átvitelben játszhatnak szerepet az egyenetlen ioneloszlás révén, ill. az ionok hirtelen fluxus változása révén fiziológiai folyamatokat indítanak be. Ezek az ionok a K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HPO4-.

(3) A szerves vegyületek képződésében, metabolizmusában és lebomlásában szerepet játszó Lewis sav/bázis katalizátorok, mint a Zn2+ és Mg2+, ritkábban a Fe és a Mn, ill. redoxi katalizátorok, mint a Fe, Cu, Mn, Mo, Co, Ni, ritkábban a V és a Se.

(4) Az elektrontraszfer folyamatokat végző változó oxidációs állapotokra képes fémionok, mint a Cu, Fe, Ni. Ezen folyamatok révén a redoxi reakciók oxidációs és redukciós lépéseinek elkülönítésére nyílik lehetőség.

(5) A kisméretű, szimmetrikus nagy kötésenergiájú molekulák aktiválásában szerepet játszó fémionok, mint a paramágneses dioxigén esetén a Fe, Cu, Mn; a molekuláris N2 fixálásában a Fe, Mo, V és a CO2 metánná való redukciójában a Ni és a Fe.

(6) Egyéb speciális funkciók, mint a reduktív alkilezésben szerepet játszó kobalamin koenzim (Co); a fényenergia hasznosításában meghatározó klorofil (Mg); vagy a mágneses és gravitációs szenzorok (Fe, Ca vagy Si).

2.3. A elemek kémiai és biológiai evolúciója

A 2.2. ábra logaritmikus skálán mutatja az élő szervezeteket alkotó elemek koncentrációját az emberi testben, a földfelszíni kőzetekben és a tengervízben. Egyértelműbb korreláció figyelhető meg a tengervíz összetételével. Például igen szembetűnő az, hogy a kőzetalkotó elemek, mint a Si, Al, Ti nem létfontosságúak, mennyiségük a Föld szilárd burkában meghatározóan nagy. Ennek oka feltehetően az, hogy ezek az elemek a biológiai rendszerek számára meghatározó körülmények között, semleges vizes oldat, igen rosszul oldódó vegyületek, oxidok, hidroxidok formájában fordulnak elő, így hozzáférhetőségük rossz. Ezzel szemben a Mo, amely ritka elem a földkéregben, semleges vizes oldatban a szervezet számára könnyen felvehető MoO42 oxoanion formájában fordul elő. A bioelemek többsége esetén is jobb korreláció figyelhető meg a tengervízben való előfordulással, mint a földkéregben való mennyiségükkel. Ez alapján elég erős és meggyőző az a nézet, hogy az élet vizes oldatban, az úgynevezett „ősóceánban” alakult ki.

2.2. ábra: Az elemek relatív moláris koncentrációinak logaritmikus ábrázolása különböző környezetben (P.A. Cox, The Elements: Their Origin, Abundance and Distribution, Oxford University Press, Oxford, 1989 alapján).

Az élő szervezetek ?4 milliárd éve kezdődött evolúciójuk során, sokféle változáson mentek át. A Föld szilárd kérge körül kialakult őslégkörben különböző energiaforrások (napsugárzás, elektromos kisülés, vulkáni tevékenység, geotermikus energia) hatására egyszerű szerves molekulák keletkeztek. Ezután a kémiai és az azt követő biológiai evolúció hosszadalmas és rendkívül bonyolult folyamatai révén, amelynek minden részletét ma sem ismerjük, jöttek létre egyebek között a fehérjék, a nukleinsavak, majd kialakult az első sejt, és kifejlődtek a többsejtű szervezetek, a növények, az állatok és az ember. A Földön megtalálható életforma kialakulásánál két fontos szempontot kell figyelembe vennünk, egyrészt, hogy az élet az „ősóceánokban” keletkezett, és így az ott uralkodó feltételekhez kellett alkalmazkodnia, másrészt az élő rendszerek alkalmazkodtak a redukáló hatású ősatmoszféra oxidativ atmoszférává változásához. Az elektrontranszfer funkciót ellátó vas-kén fehérjék például bizonyosan az evolúció korai szakaszában már kialakultak, amikor még redukáló volt az atmoszféra és rendelkezésre állt a kén  2 oxidációs állapotban szulfid formájában (lásd a 7. fejezet). Ezzel szemben a hem-típusú fehérjék, elég csak a hem bonyolult kémiai felépítését felidézni (négy pirrol többé-kevésbé konjugált kettőskötésű rendszerrel gyűrűbe foglalva), bizonyosan a kémiai evolúció későbbi korának terméke. De olyan jól sikerült vegyületnek bizonyult, hogy a természet a biológiai evolúció során kis változtatásokkal sokféle funkció (O2 szállítás és tárolás, oxidációs folyamatokat katalizáló szerep, elektronszállítás) ellátására alkalmazta őket (lásd a 9. fejezet).

Ma az az általános feltételezés, hogy az élet a tengerben, ill. sósvízi lagúnákban keletkezett. Így a tengervíz összetétele ma is rányomja bélyegét a Földön élő összes sejt kémiai összetételére. Az ősóceán kedvező környezetet nyújtott a primitív szervezetek szabad mozgásához, és egyidejűleg olyan oldatot jelentett, amely tartalmazta a fennmaradásukhoz szükséges elemeket. E szervezetek számára a víz elengedhetetlen volt. A szilárd anyag az oldott ionok vagy anyagcseretermékek szabad kicserélődését nagyon akadályozta volna. Csak évmilliárdok elteltével kezdődött meg a lassú átmenet az óceániból a szárazföldi életformák felé. Ez a lépés eredményesen akkor következett be, amikor a szervezetek a tengeri környezetet bizonyos mértékig képesek voltak magukkal vinni, azaz kialakultak a sejtek. A szárazföldi állatok vérsavóinak és szövetnedveinek összetétele emlékeztet az ősi óceáni életformára. A korai fejlődéstörténetben a második nagy alkalmazkodást a légkör megváltozása követelte meg a szervezetektől. A kezdetet egy anaerob korszak jelentette, amikor a légkör jelentős mennyiségű hidrogént, metánt, ammóniát és vízgőzt tartalmazott, és ennek megfelelően a redukáló környezethez alkalmazkodó szervezetek jöttek létre és szaporodtak el. Ezután egy hidrogénszegény periódus következett, majd a következő lépést az jelentette, amikor az anaerob őssejtek a rendelkezésükre álló szerves anyagmennyiséget, amely eddig táplálékul szolgált, kezdték kimeríteni és ez által az élet a napfény segítségével létrehozott fotoszintézistől vált függővé és a légkörben felszaporodott az oxigén. Ez a korszak még ma is tart. Ma az élő szervezetek túlnyomó többsége az energiájukat oxidációs folyamatok révén szerzik be, és az anaerob szervezetek majdnem teljesen kipusztultak, ill. a föld alá vagy tengerek mélyére szorultak vissza.

A légkör redukálóból oxidálóvá alakulása jelentős változásokat idézett elő egyes elemek oxidációs állapotában és így biohozzáférhetőségében is. Ezek közül néhányat a 2.2. táblázatban tüntetünk fel. Egyes esetekben ez az elem hozzáférhetőségének jelentős növekedését (pl. Cu) jelentette, más esetekben éppen fordítva a biohozzáférhetőség drasztikus csökkenése miatt (pl. Fe) az élő szervezeteknek a már létfontosságúvá vált elemek felvétele érdekében speciális mechanizmusokat kellett kifejleszteniük (lásd 5. fejezet).

2.2. táblázat: Egyes elemek kémiai állapotának és biohozzáférhetőségének változása az atmoszféra redukálóból oxidálóba való átalakulása során.

Laboratóriumi kísérletek utalnak arra, hogy miként mehetett át az anaerob létforma az aerobba. 1954-ben találtak egy olyan baktériumtörzset, mely aerob körülmények között jól fejlődik, oxigénnel érintkezve viszont elpusztult, mivel sem a szervezetükben keletkező hidrogén-peroxid elbontásához szükséges mechanizmussal, sem lélegző rendszerrel nem rendelkeztek. Mihelyt azonban a tenyészethez egy egyszerű vas-porfirin komplexet adtak, ezek a baktériumok lassanként levegőben is továbbéltek. A hemkomplexet felvették, szervezetükben levő fehérjéhez kötötték, és így a baktériumok katalázzal és légzési enzimekkel látták el magukat. A megváltozott körülményekhez az élő szervezet tehát alkalmazkodni tudott.

A vas és a réz jelenléte az élő szervezetben különleges jelentőségű. E két fém az aerob anyagcseréhez való alkalmazkodásban közvetlenül részt vett, és döntő szerepet játszanak a légzést katalizáló enzimekben. Az ősföld redukáló atmoszférájában jöttek létre azok a vasat tartalmazó biomolekulák, amelyek az elektronszállításban és a különböző redoxi folyamatokban töltöttek és töltenek be létfontosságú szerepet. Egyebek között ezek a vastartalmú óriásmolekulák tették lehetővé az aerob életforma kialakulását. Az első metalloproteinek valószínűleg a vas-kén fehérjék voltak, melyek később a fotoszintetikus rendszereknek is nélkülözhetetlen részét képezték.

Mind a vas-kén fehérje képződése, mind az óceánok viszonylagos nagy Fe(II) és Mn(II) koncentrációja lehetővé tette, hogy a két fémion más ligandumokkal, pl. a kémiai evolúcióban fontos szerepet játszó templátreakció (lásd a 4. fejezetet) révén képződött porfirinekkel is reakcióba lépjen. Ez vezetett el, végül is a vas esetében a hem-fehérjékhez, a mangán esetében, pedig ahhoz a vegyülethez, amely a kékmoszatok fotoszintézisében játszott fontos szerepet. Elsősorban a kékmoszatok fotoszintetikus tevékenysége révén vált a légkör oxigéntartalma egyre nagyobbá. Az oxigén az első időkben igen mérgező volt a reduktív atmoszféra körülményei között kifejlődött élőlények számára. Hosszú évmilliók kellettek ahhoz, hogy a légköri oxigén redukciójában részt vevő enzimrendszer kialakuljon. Ezek az enzimek az oxigént először hidrogén-peroxiddá, majd vízzé alakítják. A korai aerob sejtekben levő enzimek között volt feltehetőleg a szuperoxid-dizmutáz, a kataláz és a peroxidáz primitív formája is. Ezek katalizálják az oxigén redukciójának rendkívül reaktív köztitermékeinek semlegesítését. A primitív szuperoxid-dizmutáz feltehetőleg mangántartalmú enzim volt, és csak az evolúció későbbi szakaszában kialakult sejtmaggal rendelkező úgynevezett eukarióták sejtjeiben jött létre a rezet tartalmazó metalloenzim. A reduktív atmoszférában a réz az alig oldható, és így alig hozzáférhető Cu(I)-szulfid alakjában volt jelen. A rézionok csak akkor kerültek a hidroszférába, amikor a légkör kezdett oxidálóvá válni, és Cu(II)-ionok keletkeztek. Ezek léptek reakcióba a különböző fehérjékkel, és így alakultak ki a réz-metalloenzimek. A vas és a réz jelentőségét a biológiailag aktív fém-fehérjék széles köre bizonyítja. Ezekkel részletesen foglalkozunk a 7. és 10. fejezetekben.

Nagyon érdekesen tükröződik a környezet változása a különböző fémionok mennyiségének viszonyában. A különböző típusú szervezetek ugyanis nem másolják le hűen a környezet fémion-összetételét, hanem anyagcseréjük evolúciója szabályozza a saját fémion-összetételüket. Ki lehet mutatni, hogy a légkör oxigéntartalmának növekedésével, amely együtt járt a növények redoxifunkcióinak változásával, a bioredoxireakciókban szerepet játszott fémionok aránya számottevően változott. A vastartalom csökkent, a réz-, a cink-, a molibdén- és a mangántartalom nőtt. Feltételezhetően a fémtartalom ilyetén változása ma is tartó folyamat. A növényi evolúcióban a legfontosabb eseménynek a mangánkoncentráció növekedését tekinthetjük, amellyel együtt járt, hogy a növényi anyagcsere-folyamatokban egyre nagyobb szerepet kapott a fotoszintézis.

Ellenőrző kérdések

- Mi a különbség a hasznos és a létfontosságú elemek között?

- Mennyire különböző koncentrációban szükségesek a létfontosságú elemek az emberi szervezet számára?

- Változott-e a létfontosságú elemek csoportja a kémiai és biológiai evolúció során? Példákkal igazolja állítását!

- Milyen kémiai, ill. biológiai folyamat változtatta meg a redukáló ősatmoszférát oxidálóvá?

- Hogyan védekeztek az őssejtek a számukra mérgező oxigén megjelenése ellen?

Chapter 3. 3. BIOMOLEKULÁK KÖLCSÖNHATÁSA FÉMIONOKKAL

Kulcsszavak: komplexképződés, stabilitás, stabilitási állandó, donorcsoport, fehérjék szerkezete, fémionszelektivitás, makrociklus, nukleinsav

Az élő szervezetekben a fémionok számos biomolekulával kerülhetnek gyengébb vagy erősebb kölcsönhatásba, a körülményektől függő módon. A biomolekulák szinte kivétel nélkül tartalmaznak egy vagy több elektronpár-donor funkciós csoportot, amelyek fémion megkötésére alkalmasak. A fiziológiás pH-n még protonált bázikus donorcsoportoknál a proton és a fémionok versengése alakul ki a kötőhelyért. Ilyenek pl. az amino-, az imidazol, a fenolos-OH, a tiol, stb. csoportok. Vannak azonban olyan, erősen bázikus tulajdonsággal bíró funkciós csoportok is, melyek csak különleges körülmények között képesek a protont fémionra cserélni, ilyen csoport pl. a peptidkötés nitrogénje vagy az alkoholos hidroxilcsoportok. A fémion - biomolekula kölcsönhatás erőssége lényegesen függ a donoratomok bázikusságától.

A ligandumok bázikusságát, ill. savasságát a K = 1/KS egyensúlyi állandókkal szokás jellemezni. (K a protonálódási makroállandó, KS pedig a savi disszociációs állandó.) A pKS egyértékű gyenge savak esetében számszerűen azzal a pH értékkel egyezik meg, amelynél a szerves sav   vagy komplexkémiai szempontból ligandum (L)   adott deprotonálódási vagy protonálódási lépése 50%-ban játszódik le (3.1. egyenlet) , vagyis az LH és L forma egyenlő mennyiségben van jelen az oldatban.

A biomolekulák általában több, többnyire egymásra ható funkciós csoportot tartalmaznak. Ilyenkor a különböző donorcsoportok (de)protonálódási folyamatai egymással párhuzamosan játszódhatnak le, vagyis ún. protonálódási izomerek alakulnak ki. Egy aminosav esetében fellépő lehetőségeket a 3.1. ábra szemlélteti.

3.1. ábra: Egy egyszerű aminosav mikro és makro protonálódási folyamatai.

Az ábrán kis kyx jellel (ahol a felső index az adott protonálódási folyamatban résztvevő funkciós csoportot mutatja) az egyes csoportokhoz, különböző körülmények (az egyéb donorcsoportok protonáltsági állapota) között rendelhető ún. mikroállandókat jelöltük. A biomolekulák (de)protonálódási folyamatainak vizsgálata során általában a makroállandókat határozzák meg, melyekről tudnunk kell, hogy nem rendelhetőek szigorúan az egyes funkciós csoportokhoz. Ha azonban ezen KS értékek között legalább két nagyságrend különbség van, a hozzárendelés jó közelítéssel megtehető.

3.1. A fehérjék és alkotóik fémkomplexei

3.1.1. Az aminosavak fémkötő tulajdonságai

A fehérjemolekulákban lévő aminosav-oldalláncok, ill. a fehérjék kisebb alkotóelemei, a peptidek és aminosavak képesek fiziológiás körülmények között fémionokat megkötni. Azonban amíg a makromolekulák fémion-kötő tulajdonságait gyakran egyértelműen meghatározza azok háromdimenziós szerkezete, addig a kis molekulák könnyebben alkalmazkodhatnak a fémionok által meghatározott szerkezeti követelményekhez.

A fehérjék a húsz esszenciális aminosav kombinációjából kialakuló heteropolimer molekulák, melyekben az aminosavak ún. peptidkötéseken keresztül kapcsolódnak össze. A természetes aminosavak többsége (a β-alanin kivételével) az α-aminosavak családjába tartozik. Ez annyit jelent, hogy a karboxilát és az aminocsoportok egyazon szénatom - az α-szénatom - funkciós csoportjai. A glicin a legegyszerűbb aminosav, a többi aminosavban a szénatomon a hidrogénatomon kívül egy további szubsztituens (az aminosav oldallánca) is található, ami megkülönbözteti egymástól az aminosavakat. Alapállapotban pH 7 körül ún. ikerionos forma alakul ki, a karboxilcsoport deprotonált formában található - vagyis, mint karboxilátion negatív töltéssel bír, a bázikus aminocsoport viszont ugyanilyen körülmények között protonált, ammóniumion formában van jelen, és pozitív töltést hordoz. A negyedik szubsztituens sajátságai alapvetően meghatározzák az aminosavak jellegét. Az oldallánctól függően lehet az aminosav savas jellegű (pl. aszparaginsav, glutaminsav), bázikus jellegű (pl. lizin, arginin), apoláris alifás oldalláncokat hordoznak az alanin, valin, leucin és izoleucin aminosavak. A szerin és a treonin alkoholos hidroxilcsoportot, a metionin és a cisztein kén donoratomokat, az aszparagin és glutamin karboxamid csoportot, a fenilanin, tirozin és triptofán aromás gyűrűket a hisztidin pedig imidazogyűrűt tartalmaz az oldalláncában. A prolin azért kivételes α-aminosav, mert a negyedik szubsztituensként szereplő oldallánca az aminocsoport nitrogénjével gyűrűbe záródik, így szekunder aminocsoport alakul ki. A glicin kivételével az α-szénatom körül négy különböző szubsztituens helyezkedik el tetraéderes geometriában, ami ún. királis sajátságot biztosít. A természetes aminosavak α-szénatomja S abszolút konfigurációval rendelkezik. Emiatt a negyedik szubsztituensnek, vagy oldalláncnak nemcsak az aminosavak polaritásának, hidrofób-hidrofil jellegének, oldhatóságának, és egyben fémion-kötésének kialakításában jut alapvető szerep, de a fehérjék térbeli szerkezetét is meghatározzák. Az aminosavak sematikus szerkezetét, elnevezését, valamint a szokványos három, ill. egybetűs rövidítéseket a 3.1. táblázat tartalmazza.

3.1. táblázat: Az aminosavak szerkezete és elnevezési módjai.

Az aminosavak és fémionok kölcsönhatását a donorcsoportok bázikusságán túl az aminosav hidrofób, ill. aromás jellege, a fémion sajátsága, a koncentrációviszonyok és az egyéb külső körülmények befolyásolják. Az aminosav funkciós csoportok közelítő pKS értékeit a 3.2. táblázatban mutatjuk be.

3.2. táblázat: Az aminosav funkciós csoportok közelítő pKS értékei.

Ez alapján egy egyszerű aminosav esetén savas körülmények között elsősorban az α-karboxilcsoport veszíti el protonját elsődleges kötőhelyet nyújtva a legtöbb fémion számára. Stabilis komplexeket azonban csak a hard-jellegű fémionokkal képez (ld. Melléklet), mint pl. az alkáliföldfém-ionok, vagy az Al3+, Fe3+. A karboxilcsoport azonban öttagú kelátképző helyzetben található az aminocsoporttal, ami elősegíti ez utóbbi csoport párhuzamos koordinációját, ezért a karboxilátiont ún. horgony csoportnak nevezzük. A legtöbb átmenetifém-ion semleges közegben a 3.2. ábrán vázolt módon kötődik elsődlegesen az aminosavakhoz. Ezt a kötésmódot aminosav-típusú koordinációnak fogjuk a továbbiakban nevezni.

3.2. ábra: Egy egyszerű királis aminosav "aminosav-típusú" bisz komplexe (Mn+ a fémion).

A fentiekhez képest több információt biztosítva, a 3.2. ábra egy királis aminosav feleslegének jelenlétében kialakuló biszkomplexet mutat. Látható, hogy a két ligandum úgy helyezkedik el a fémion körül, hogy az azonos donorcsoportok kerülnek egymáshoz közeli, azaz cisz helyzetbe. Ez ellentmond annak, hogy a karboxilátionok negatív töltéseinek taszítása miatt az azonos donorcsoportok egymástól távoli, transz helyzetnek kellene a stabilis elrendeződésnek lennie. A glicin komplexében ez valóban így is van, azonban az alifás (Ala, Val, Leu, Ile), ill. egyéb nem, vagy gyengén koordinálódó oldalláncú (Ser, Thr, Asn, Gln, Met, Lys) aminosavak transz komplexeiben az oldalláncok a donorcsoportok síkjának ugyanazon oldalán helyezkednének el, ami térbeli taszítást és ezzel destabilizációt eredményez. Ezért stabilabb a cisz forma, ahol mindkét aminosav oldalláncának bőséges hely jut.

Előfordulhat az is, hogy az oldallánc donorcsoportjai gyengébb-erősebb koordinatív kölcsönhatást létesítenek a fémionokkal egy torzult oktaéderes geometria axiális helyzetében   közvetlenül vagy esetleg már koordinálódott vízmolekulákon keresztül, hidrogénkötéssel  , ami szintén a cisz izomert stabilizálja (3.3. ábra).

3.3. ábra: A szerin biszkomplexének sematikus szerkezete axiális koordinációt is figyelembe véve.

Ezen kölcsönhatások a komplexek stabilitásának kis növekedését okozzák, amit jól szemléltethetünk a bázikussággal korrigált stabilitási állandókkal: K' (3.3. egyenlet). A 3.1, 3.2. és 3.3. egyenletek alapján könnyen belátható, hogy 3.4. egyenlet teljesül.

Ezek az állandók, egy homológ vegyületsor esetében, az azonos módon koordinálódó donorcsoportok (pl. aminosav koordináció) bázikusságának eltéréséből eredő stabilitáskülönbségeket kiküszöbölik, így az eltérés a stabilitásban egy másik kölcsönhatásnak   pl. az axiális koordináció   tulajdonítható. Néhány ilyen állandót mutat be a 3.3. táblázat.

3.3. táblázat: Az aminosavak Ni(II)-komplexeinek stabilitási adatai.

A fentiekből jól látszik, hogy míg pl. az Glu és Lys aminosavak esetében nem, addig a Cys és Asp aminosavak Ni(II) [ML] komplexeinek stabilitását lényegesen növeli az oldallánc koordinációja (a lgK' értéke pozitívabb, azaz jelen esetben kevésbé negatív). Az aromás oldalláncú aminosavak bisz komplexeiben az aromás gyűrűk π-elektronrendszerei közötti hidrofób, ún. stacking kölcsönhatás ismét a transz forma stabilizálódását eredményezheti.

Bonyolódik a helyzet, ha az aminosavak oldalláncában fémionokat nagy stabilitással megkötni képes donorcsoportok is vannak. Ekkor ugyanis a körülményektől, és a fémionok minőségétől függően a donorcsoportok versengéséből adódóan a fentiektől különböző fémkomplexek is kialakulhatnak. Ilyen oldalláncokat tartalmaznak a Asp, Glu (karboxilátion), a Tyr (fenolos-hidroxil), a His (imidazolgyűrű) és a Cys (tiolcsoport). Itt érdemes máris megjegyezni, hogy különösen nagy jelentőséget kap az oldallánc koordinációja a nagyobb tagszámú peptidek és fehérjék fémion-kötése során.

A His és Cys aminosavak oldalláncai erős kölcsönhatást alakítanak ki a legtöbb átmenetifém-ionnal, bár a Cys tiolát ionja inkább a szoft jellegű fémionokat részesíti előnyben. Ebből adódóan a fehérjék fémkötő helyeinek nagy részét ezek az aminosavak szolgáltatják. Mindkét oldallánc képes egyfogúként vagy hídliganumként viselkedni két fémiont összekötve. (3.4. ábra)

3.4. ábra: A cisztein egy bonyolultabb összetételű Ni(II)-komplexe.

A hisztidin fémionmegkötő képessége különösen jelentős, hiszen a Cu(II)-ion egy kis hányada a vérszérumban található hisztidinnel komplexet képezve szállítódik és szívódik fel. A Cu(II) hisztidin komplexét terápiás szerként is alkalmazták a Menkes-kóros pácienseknél a rézhiány pótlására A biszkomplexben savas közegben az imidazolgyűrűk protonáltak (3.5.a ábra), semleges közegben pedig az egyik ligandum imidazol nitrogénje a koordinációs szféra ekvatoriális síkjában kötődik (3.5.b ábra).

3.5. ábra: A Cu(II)-hisztidin biszkomplexek szerkezetének pH függése adott körülmények között nyert kristályok röntgendiffrakciós szerkezetei nyomán; pH = 3,7 (a); pH = 7,0 (b).

3.1.2. A peptidek, mint fehérjemodellek

Az aminosavak egymással savamid kötéseken keresztül kapcsolódnak össze melyeket a kialakuló peptid molekulákban peptidkötéseknek nevezünk. A peptidkötésre jellemző, hogy a benne szereplő atomok egy síkban helyezkednek el. Ennek magyarázata a peptidkötésben résztvevő elektronok részleges delokalizációja a C, O és N donoratomok között (részletesebben ld. Melléklet). A két kapcsolódó α-szénatom egymáshoz képest távoli, transz helyzetben található (3.6. ábra).

3.6. ábra: A peptidkötés sematikus ábrája.

A nitrogénatom erősen bázikus jellegű, protonját csak erősen lúgos közegben adja le (pKS ~ 14). A peptidek N-terminális végét semleges közegben egy ammóniumion, a C-terminális végét pedig egy karboxilátion alkotja, csakúgy, mint az aminosavak esetében. Ugyanakkor a két csoport nem tud ugyanahhoz a fémionhoz kötődni stabilis kelátgyűrűt létrehozva, azaz háttérbe szorul a terminális csoportok együttes koordinációja. Kimondottan hard jellegű fémionokkal való kölcsönhatás során a karboxilátion, míg a többi esetében az N-terminális rész az elsődleges kötőhely.

A peptidmolekulák N-terminális végén a fémionnak lehetősége nyílik öttagú kelátgyűrű kialakítására az amino-nitrogén és az amid oxigén donoratomok részvételével. Vannak olyan fémionok is, melyek képesek az amid nitrogén protonjával eredményesen versengeni, és koordináció közben azt helyettesíteni: pl. a Pd(II) már pH ~ 2, a Cu(II) pH 4-5, a Ni(II) pedig pH 8-9 körül. E folyamat eredményeként általában nagy stabilitást biztosító csatolt öttagú kelátgyűrűs komplex alakul ki az amino, a deprotonálódott amid-nitrogén és dipeptidek esetében a karboxilát (3.7. ábra), oligopeptidek komplexeiben pedig a szomszédos amid-oxigén részvételével.

3.7. ábra: A koordinálódó oldalláncot nem tartalmazó dipeptidek [MLH1] komplexének sematikus ábrája.

A peptid hosszának további növelése lehetővé teszi, hogy lúgos közegben a következő amidnitrogén is kötődjön (3.8. ábra).

3.8. ábra: A koordinálódó oldalláncot nem tartalmazó oligopeptidek [MLH3] komplexének sematikus ábrája.

A fenti kötéstípus, melyet peptidszerű koordinációnak nevezünk nem általános a fémion-kötő fehérjék körében. Sőt már a peptidmolekulákban is lényeges szerep juthat a donorcsoportot tartalmazó aminosav oldalláncoknak a fémionok megkötésében. Amennyiben pl. a peptidszekvencia hisztidint is tartalmaz, ennek az aminosav sorrendben elfoglalt helyétől függően nagyon változatos fémkomplexek alakulnak ki.

A Gly-His-Gly tripeptid esetén pl. lúgos tartományban oligomerizációs folyamat játszódik le az imidazolgyűrű másik nitrogénatomjának deprotonálódása és koordinációja révén, ahol az imidazolgyűrű ligandumhídként köt össze két fémiont (3.9. ábra).

3.9. ábra: A Gly-His-Gly tripeptid [Cu4L4H8] komplexének sematikus ábrája.

Az egyik legismertebb metalloenzim, melyben az imidazolgyűrű szintén hídként szerepel két fémion között a Cu,Zn- szuperoxid dizmutáz enzim, melyről részletesebben a 10. fejezetben esik szó.

A Gly-Gly-His és a hisztidint az N-terminális résztől számított harmadik pozícióban tartalmazó peptidek különlegesen stabilis, telített ekvatoriális koordinációs szférával bíró fémkomplexet alkotnak, amelyben a negyedik koordinációs helyet a karboxilát helyett az imidazol nitrogén foglalja el. A legfontosabb fémionok közül semleges pH-n ilyen komplexet főként a Cu(II)-ion képez, ami fiziológiás körülmények között e molekula fémion-szelektivitását eredményezi. A Cu(II)-ionokat a vérben többek között a szérum albumin fehérjét is szállítja, mely a Gly-Gly-His-hoz hasonló módon köti meg a fémiont (3.10. ábra).

3.10. ábra: A Gly-Gly-His típusú (NH2, N, N, N(Im)) koordináció a humán szérum albuminban, egy axiális COO kötéssel kiegészülve (J-P. Laussac és B. Sarkar, Biochemistry 1984, 23, 2832-2838).

A szelektivitás nagy előnyt jelenthet, pl. a fémionoknak a szervezetből történő eltávolítása esetén is. A Wilson kór kialakulásának az oka a Cu(II)-ionok felhalmozódása a szervezetben, elsősorban az agyban (ld. 15. fejezet). A gyógyításához ezért olyan kelátképzőt használhatunk, mely az egyéb létfontosságú fémionokat nem, a káros felhalmozódott Cu(II)-ionokat pedig eltávolítja az agyból. A Gly-Gly-His és származékai alkalmasak lehetnek erre a célra, és a kutatásnak ebben az irányban komoly erőfeszítések is történtek.

3.1.3. A fehérjék, mint ligandumok, metalloproteinek

A fémionok és fehérjék specifikus kölcsönhatásai alapvetően meghatározzák a metalloproteinek biológiai (katalitikus, jelátadó, szállító-tároló, vagy elektrontranszfer) szerepét.

A fehérjékben a fémionok kötőhelyeit elsősorban a térben megfelelő közelségben és geometria szerint elhelyezkedő aminosav oldalláncok szolgáltatják. A fémion-kötő tulajdonság szempontjából tehát egyik legfontosabb szempont a fehérje térbeli szerkezete.

A fehérjék fémion-kötő folyamataira jellemző, hogy a kismolekulák esetén a stabilitást nagymértékben megnövelő keláteffektus itt lényegesen háttérbe szorul. Némely fémkötő fehérje háromdimenziós szerkezete annyira viszont stabilis, hogy az apo (fémion nélküli) formájában is változatlan marad, esetleg kisebb módosulást szenved. Az ilyen fehérjék szerkezetéből adódóan nem áll minden esetben elegendő számú donoratom rendelkezésre, így a fémkomplexek gyakran telítetlen koordinációs szférával jellemezhetőek, és a további helye(ke)t valamilyen lazán kötődő molekula   mely leggyakrabban vízmolekula   tölti be. Ez a sajátság nélkülözhetetlen pl. a metalloenzimek működéséhez, hiszen az „üres” koordinációs helyre szükség van ahhoz, hogy a szubsztrát molekula megkötődhessen.

A fehérje által kialakított koordinációs geometria is eltér az egyes koordinációs számokhoz rendelhető szabályos tetraéderes, síknégyzetes (n = 4), vagy oktaéderes (n = 6) geometriáktól. A torzult geometria elősegítheti pl. a fémionok oxidációs állapotának megváltozását. Az ilyen fehérjé-fémion komplexek redoxi reakciókat is katalizálhatnak, de még szembetűnőbb a fenti sajátság az ún. elektrontranszport fehérjéknél. Az elektron szállítását nagymértékben elősegíti, hogy a fémion körüli geometria sem annak redukált, sem az oxidált formája számára nem kedvező, így egyik sem tud stabilizálódni a másikkal szemben. Ez pedig könnyű, reverzibilis oxidációs szám változtatást eredményez (7. fejezet).

A fehérjék által kialakított kötőhelyek az aminosav oldalláncok minőségétől függően a hozzájuk kötődő fémionok minőségét is meghatározzák. Vagyis a térszerkezet a fehérje fémion-szelektivitását is nagyban befolyásolja. A 3.4. táblázat az egyes aminosavak oldallánci donorcsoportjaival kötést leggyakrabban kialakító létfontosságú fémionokat sorolja fel.

3.4. táblázat: Az egyes aminosavak oldalláncaihoz leggyakrabban kötődő létfontosságú fémionok.

Mint azt számos metalloprotein példája mutatja, a fémion az esetek többségében nem közvetlenül a fehérje felszínén kötődik meg, hanem annak belsejében, gyakran a kanyarokban, üregekben vagy a domének határfelületén. A fehérjék szerkezetének nemcsak a fémion megkötésében van jelentősége, hanem pl. a szubsztrátoknak a megfelelő katalitikus helyre, ill. a termékeknek az onnan történő elszállításában, a reakciópartnerek megfelelő sztereokémiai elrendezésében, aktiválásában és stabilizálásában, a megfelelő hidrofil és hidrofób környezet biztosításában.

Vannak azonban olyan fehérjék is, melyek a fémionok hatására képesek szerkezetüket jelentősen megváltoztatni. Jó példák erre a cink-ujj fehérjék, melyekben a fémion koordinációja hatására egy jórészt rendezetlen peptidszakasz egy különleges ujjszerű képződménnyé formálódik melynek egyik oldalát helikális, a másikat pedig β-redőzött szerkezet alkotja (3.11. ábra). Ezen fehérjék mai ismereteink szerint génszabályozó szerepet töltenek be az élő szervezetben (14. fejezet).

3.11. ábra: A cink-ujj szerkezet kialakulása.

3.2. A nukleinsavak és alkotóik fémkomplexei

A nukleinsavak (DNS, RNS) nukleotid egységekből felépülő polimermolekulák. A nukleotid egységek három alkotórészből állnak: foszforsavból, pentózokból (ribóz a ribonukleotidokban, dezoxiribóz a dezoxi-ribonukleotidokban) és nitrogéntartalmú szerves bázisokból. Ez utóbbiak purin- vagy pirimidinszármazékok. Purinvázas az adenin (a) és a guanin (g), pirimidinvázas a timin (t), citozin (c) és az uracil (u). A cukormolekula egyes számú szénatomjához kapcsolódik glikozidos kötésen keresztül a szerves bázis egyik nitrogén atomja (pirimidinbázisok esetén az N(1), a purinbázisoknál pedig az N(9)), így jön létre a nukleozid. A nukleotidokban a nukleozid pentózrészének 5-ös szénatomján lévő hidroxilcsoportot észteresíti a foszforsav (3.12. ábra).

3.12. ábra: Egy nukleotid (adenozin-monofoszfát) szerkezeti képlete.

A nukleotidok C(5)-OH-t észteresítő foszfátcsoportja és a szomszédos nukleotid szénhidrátrészének C(3) szénatomján levő hidroxilcsoport között kialakuló foszfodiészter kötésekkel hosszú láncok képződnek, melyeknek iránya e fenti két csoport által meghatározott: 3' és 5' vég (3.13. ábra).

3.13. ábra: A polinukleotid szál felépítése.

A DNS a legtöbb élőlényben két ellentétes lefutású jobbmenetes spirális polinukleotid-láncból áll, melyek közötti összetartó erőt a bázisok között kialakuló hidrogénkötések biztosítják. Az egyszálú RNS konformációja a DNS-től eltérően igen változatos lehet és a nukleinsav szálon belül intramolekuláris bázispárok alakulnak ki.

Egy nagyobb méretű RNS molekulában igen jellegzetes másodlagos és harmadlagos szerkezet alakulhat ki, ami hasonlatos a fehérjék szerkezetéhez. Léteznek olyan ribonukleinsav molekulák is, melyek enzimatikus aktivitással bírnak, ezek a ribozimok, melyek többsége fémion jelenlétében működik optimálisan (bővebben: 12. fejezet).

Fémionok, vagy fémkomplexek is kötődhetnek a nukleinsavakhoz. A szoft és átmeneti jellegű fémionok kötőhelyei a nukleobázisok, melyek sematikus szerkezetét a gyűrűk számozásával és a lehetséges kötőhelyek megjelölésével a 3.14. ábrán mutatjuk be. E donoratomok bázicitása és a fémion-kötő képességük között összefüggés figyelhető meg, bár ez nem minden esetben egyértelmű. A tapasztalatok alapján a képződő komplexek stabilitása az uracil(N3) ~ timin(N3) ~ guanin(N1) ~ citozin(N3) ~ guanin(N7) > adenin(N7) = adenin(N1) sorrendben csökken. A különböző fémionoknak a bázisok nitrogénjeihez való affinitása pedig a koordinációs helytől függetlenül a következő sorrendet mutatja: Pd(II) ~ Pt(II) > MeHg(II) > Ag(I) > Cu(II) > Ni(II) > Co(II) > Zn(II) ~ La(III) > Mn(II) > Mg(II).

3.14. ábra: A nukleobázisok sematikus szerkezete a számozással.

A polinukleotid lánc negatív töltésű foszfátionjai a hard jellegű fémionokat képesek stabilisan megkötni, mint a Na+, K+ (polielektrolit hatás) és Mg2+, melyek a térszerkezetet is stabilizálják. A Mg2+ komplexálás jellemző a szervezetben előforduló mononukleotidokra is, mint pl. az ATP, és a sejtben az ATP ~90%-a Mg2+-komplexként található.

Meg kell említeni, hogy a nukleinsavak és a mononukleotidok szerkezetileg eltérő foszfátcsoportokat tartalmaznak: a nukleinsavak szekunder, míg a nukleotidok primer foszfátokat, melyek bázikussága és így fémkötő képessége az utóbbiak javára kb. egy nagyságrenddel eltér egymástól. Ezt a sejtek fémionjainak megkötésében szerepet játszó biomolekulák értékelésénél feltétlenül figyelembe kell venni.

3.3. Nagy szelektivitást eredményező biomolekulák fémkomplexei

3.3.1. Az ionofórok és sziderofórok

A létfontosságú fémionok szállítása főként aktív transzportjuk esetében, nagy szelektivitású komplexképzőket igényel elsősorban a meglehetősen hasonló tulajdonságú fémionok esetén (ld. 5, 6. fejezet).

A megfelelő mértékű szelektivitást vagy a különböző tulajdonságú donorcsoportok jelenléte vagy a koordinatív sajátságokon túl a méretbeli különbségek - a fémionok számára megfelelő átmérőjű üregekben levő kötőhelyek - eredményezik. Ilyen üregek biztosítják a pl. az ún. makrociklusos ligandumok nagymértékű fémionszelektivitását. (ld. 6. fejezet)

Az ionofórok olyan többfogú természetes ligandum molekulák, melyek a fent említett makrociklusokhoz hasonlóan a fémionok részére kötőhelyet biztosítva azokat beburkolják. Az így képződött komplexek, külső felületük hidrofób tulajdonsága révén a fémionokat a hidrofób membránokon könnyen keresztüljuttatják. Ilyen vegyületek pl. a valinomicin, mely valinból és alaninból álló ciklikus peptid. A makrociklus belső felén az amid-oxigének biztosítanak a hard féminok számára stabilis kötőhelyet, míg a hidrofób aminosav oldalláncok a molekula felszínén helyezkednek el. A valinomicin K+-komplexe 1000-szer nagyobb stabilitású, mint a nagyon hasonló tulajdonságú Na+-ionnal képzett adduktuma. Az ilyen tulajdonságú anyagok természetes antibiotikumokként funkcionálnak, ugyanis a baktériumokat azok ioneloszlásának megváltoztatása révén pusztítják el (6. fejezet).

Az ionofórok egy másik csoportját képezik a sziderofórok, mely ligandumok segítségével a mikroorganizmusok képesek a vasat környezetükből felvenni. Ilyen vegyületek az enterobaktin, ill. deszferrioxamin melyek számos oxigén donoratomjukkal a vasat oldható komplexbe viszik. (3.15. ábra)

3.15. ábra: Az enterobaktin (a), ill. deszferrioxamin (b) sematikus szerkezete.

3.3.2. A prosztetikus csoportok

Bizonyos metalloproteinek, ill. enzimek nem közvetlenül a fémiont, hanem annak fémkomplexét használják fel funkciójuk megvalósítására (3.5. táblázat). Ilyen prosztetikus csoportok fordulnak elő pl. a hemoglobinban és mioglobinban, ahol a hem segítségével történik az oxigénmolekula szállítása és tárolása. A citokrómok szintén hemet használnak elektronszállítás céljára. A fotoszintetikus komplexben a klorofillmolekulák a fényhasznosítási folyamat iniciáló vegyületei. A B12-koenzim számos csoporttranszfer enzim működéséhez szükséges. A metanogén baktériumok F430 koenzime is ide tartozik.

3.5. táblázat: A tetrapirrol vázat tartalmazó prosztetikus csoportok.

A biológiai folyamatokban szerepet játszó tetrapirrolok (részlegesen) telítetlen, szubsztituált makrociklusos ligandumok (3.16. ábra). Láthatjuk, hogy a különbőző vázak esetén jelentős eltérés van a telítetlen kettőskötések számában és helyében.

3.16. ábra: A porfin, a klorin, a korrin és a hidrokorfin tetrapirrol vázak sematikus szerkezete.

Ezek a ligandumok deprotonált (egy- vagy két negatív töltésű) formában különböző fémionokat képesek stabilisan megkötni, síknégyzetes geometriájú, négyfogú, kinetikailag inert kötőhelyet biztosítva. A merev gyűrűs szerkezet meghatározza a fémionok minőségét: az ideális ionsugár 60-70 pm. Ilyen fémionok a Mg(II), Co(II), Ni(II), Fe(II) (kis spinszám), Fe(III) (nagy spinszám). A tetrapirrol típusú molekulák önmagukban is igen stabilisak, ami egyrészt abból adódik, hogy a kötéshosszak és szögek alapján nem feszült a ciklusos szerkezet, másrészt a makrociklus aromás jellege szintén stabilitásnövelő tényező. A konjugált eletronfelhő következtében a komplexek színesek (biológiai festékanyagok), ill. könnyen adnak le vagy vesznek fel elektronokat és a belőlük képződő gyökök viszonylag hosszú ideig stabilisak (10. fejezet). A tetrapirrol komplexekben a fémionok axiális koordinációs helyei alkalmasak egyrészt a szubsztrát megkötésére, másrészt a komplex katalitikus tulajdonságainak hangolására. (3.17. ábra)

3. 17. ábra: A B12 koenzim szerkezete

(forrás: http://human.freescience.org/htmx/vitamin_B12.php).

Nemcsak tetrapirrol típusú komplexképző kofaktorok ismertek. A szubsztituált pterinszármazékok az utóbbi időben szintén érdeklődésre tartanak számot. A vegyület alapváza hasonló a nukleotidokban található guaninhoz, azzal a különbséggel, hogy az öttagú gyűrű helyett hattagú heterociklust találunk. Ilyen vegyületek alkotják a molibdén kofaktort (Mo-co) mely a nitrogenáz enzim kivételével az összes Mo tartalmú enzim prosztetikus csoportja (3.18. ábra). Ezenkívül a pterineket megtaláljuk pl. a fenilalanin anyagcseréjét katalizáló enzimekben vas-, ill. rézionokkal komplexálva, a folsavban és a metanogén baktériumokban is.

3.18. ábra: A pterin sematikus szerkezete.

3.4. Egyéb biomolekulák fémkomplexei

Az élő szervezet minden sejtjében több ezer olyan különböző molekulát találunk, melyek fémionok kötésére képesek. Ezek közé tartoznak pl. a metabolizmus termékei, a szénhidrátok és azok származékai.

A semleges alkoholos hidroxil-donorcsoportok meglehetősen gyenge kölcsönhatást alakítanak ki a fémionokkal. Megnő azonban a hidroxilcsoportok szerepe, amennyiben a molekulában egyéb donorcsoport is található (pl. karboxilát vagy amino) melyek horgonyként viselkedve elősegít(het)ik a hidroxilcsoport koordinációját. Az ilyen, kis molekulatömegű vegyületek közül a legismertebbek a hidroxikarbonsavak (glikolsav, tejsav, almasav, citromsav, borkősav, glükonsav, C-vitamin, 3.19 ábra), az aminocukrok, de vannak biológiai jelentőségű makromolekulák is, mint pl. a glikózaminoglikánok. Ez utóbbiak közül egyik érdekes molekula a hialuronsav, mely glükuronsav és N-acetil-glükózamin heterodimer polimerje. Erről a molekuláról kimutatták, hogy nagy szerepe van pl. a sebek gyógyulási folyamatában, melyet a Zn(II)-ionnal együtt hatékonyan segít elő. A hialuronsav Zn(II)-komplexét emiatt az orvosi gyakorlatban is alkalmazzák.

3.19. ábra: Néhány, a szervezetben előforduló hidroxikarbonsav szerkezeti képlete.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Rajzolja fel az aminosavak általános szerkezeti képletét (semleges és ikerionos formában)! Milyen formában vannak jelen az aminosavak a fiziológiás pH-tartományban és miért?

-Csoportosítsa az aminosavakat az oldalláncok alapján, és szemléltesse egy-egy példával!

- Milyen fémion megkötésére alkalmas donorcsoportok vannak/lehetnek jelen az aminosavakban, ill. az oligopeptidekben?

- Milyen eltérések figyelhetők meg a fehérjék és a fehérje alkotó monomerek komplexképző sajátságaiban?

- Adja meg két olyan ligandum nevét és szerkezeti képletét, amely nagy szelektivitással köti a fémionokat! Nevezze meg az adott szerkezet esetén a nagy stabilitással kötődő fémiont!

- Milyen alkotók épitik fel a nukleozidokat, nukleotidokat és a nukleinsavakat?

- A fenti szöveg alapján mutasson be három példát olyan fémion-ligandum komplexre, amelyek szerepet játszanak a biológiai rendszerekben!

Chapter 4. 4. A BIOLÓGIAI RENDSZEREK KATALIZÁTORAI, AZ ENZIMEK

Kulcsszavak: katalizátor, aktiválási energia, enzim, aktív központ, koenzim, kofaktor, prosztetikus csoport, metalloenzim, fémion által aktivált enzim, szubsztrát, inhibíció

4.1. Az enzimekről általában

Az élő szervezetekben a kémiai reakciók lejátszódását elősegítő katalizátorokat enzimeknek nevezzük. A XIX században Louis Pasteur a szénhidrátok élesztősejtekkel történő fermentációját tanulmányozva a folyamatot az élő anyag képességéhez kapcsolta. Az enzim elnevezést Wolfgang Kühne 1877-ben javasolta először a görög 'enzumé' (enzumη, jelentése 'élesztőben') szóból. 1897-ben Eduard Büchner közleményében azt olvashatjuk, hogy a fenti folyamat az élő sejteket nem tartalmazó élesztőkivonattal is lejátszódik. A reakciót elősegítő enzimet zimáz-nak nevezte el. 1907-ben Nobel díjat kapott ezen felfedezéséért. (További olvasnivaló: http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim; http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme)

Az enzimekre az élő szervezeteknek mindenekelőtt az alábbi okokból van szüksége:

(i)A nem katalizált reakciók igen lassúak az élő szervezetekben uralkodó körülmények (hőmérséklet, nyomás, koncentráció stb.) között. A 4.1. táblázat néhány biokémiai reakció spontán (nem katalizált) lejátszódásának sebességi állandóját, valamint a kiindulási anyag fél-élettartamát adja meg. Jól látszik, hogy egyes reakciók lejátszódása csak a geológiai időskálán válik mérhetővé.

(ii)Az enzimek, mint általában a katalizátorok, csak a reakciók sebességét képesek megnövelni, de energetikailag kedvezőtlen folyamat lejátszódását, önmagukban, nem tudják előidézni. Egy endoterm reakció csak akkor játszódhat le enzimek segítségével, ha a szükséges energiát egy energiában gazdag molekula párhuzamos reakciója fedezi, s ezzel a két folyamat együttesen energetikailag kedvezővé válik. Legtöbbször nagyenergiájú foszforsav-észterek hidrolízise szolgáltatja a szükséges energiát. Ezek közül is az ATP hidrolízise tekinthető a legfontosabb csatolt reakciónak.

4.1. táblázat: Néhány biokémiai reakció sebességi állandója, valamint a kiindulási anyagok fél-élettartama katalizátormentes környezetben (pH = 7, t = 25 C).

(ii)A biológiai rendszerek szabályozott működéséhez nagyfokú specifikusságra van szükség, amit csak a bonyolult összetételű enzimek révén valósítható meg. Egyes enzimek bizonyos vegyületcsaládokat alakítanak át, mások csak egyetlen vegyületet. Az átalakítandó anyagra (szubsztrát) vonatkozó szelektivitás mellett említést érdemel az enzimek enantioszelektivitása is, azaz az enzimatikus reakcióban csak egy jól meghatározott enantiomer alakulhat át vagy képződhet.

(iii)A biokémiai folyamatoknak mellékreakcióktól menteseknek kell lenniük, hiszen azok egyrészt a tápanyagok felhasználásának hatékonyságát csökkentenék, másrészt a jelentős mennyiségben képződő (esetleg mérgező) melléktermékek lebontása és kiválasztása további energiabefektetést igényelne.

Mivel minden reakció egyensúlyra vezet, és az enzimek csak az egyensúly beállását gyorsítják meg, de azt nem tolják el, elvben az enzimek az oda és visszairányú reakciót is katalizálni képesek. Azonban a reakciók nagy részénél az egyensúly jelentősen eltolódik valamelyik irányba. Ezért a valóságban csak néhány enzimnél figyelhetünk meg reverzibilis működést.

Ma már több ezer enzimet ismerünk, melyek túlnyomó része fehérje. Léteznek olyan RNS molekulák is melyek képesek kémiai reakciók katalízisére. Ezeket ribozimoknak nevezzük (ld. 12. fejezet). A fehérje alapú enzimek szisztematikus elnevezése két részből áll, elsőként a szubsztrát (az enzim segítségével átalakuló vegyület) neve, majd a katalizált reakció típusa szerepel (utóbbi tradicionális okokból „áz” végződéssel), pl. ribonukleotid reduktáz. Ez alól csak néhány, a proteinek hasítását végző, már régóta ismert enzim (pl. pepszin, tripszin) jelent kivételt. Az enzimeket hat nagyobb osztályba soroljuk 4.2. táblázat), melyek mindegyike alosztályokra s ezek további csoportokra bonthatóak. Ezen osztályozás alapján az egyes enzimeket egy négy tagból álló EC (Enzyme Commission) számmal jelöljük, ahol az első tag az osztályt, a második az alosztályt, a harmadik a csoportot, míg a negyedik magát az enzimet jelöli. (Részletesen lásd: http://www.expasy.org/enzyme/)

4.2. táblázat: Az enzimek osztályozása.

Számos enzim csak nem fehérje jellegű segédanyagok jelenlétében képes betölteni biológiai funkcióját, melyek lehetnek fémionok vagy szerves molekulák, melyek további csoportosítása alapvetően a fehérjelánchoz való kötődésük erőssége alapján lehetséges. Prosztetikus csoportnak nevezzük azokat a segédanyagokat, melyek a fehérjelánchoz erősen kötődnek (pl. izolálás és tisztítás után is a fehérjéhez kötve maradnak), míg a gyengébben kötődő szerves molekulák a koenzimek. A koenzimek kis molekulatömegű vegyületek, gyakran vitaminok, ill. vitaminszármazékok. Néhány esetben önmaguk is képesek katalizátorként viselkedni, azonban hatásfokuk sok nagyságrenddel megnő a megfelelő enzim jelenlétében. Ennek ellenére elnevezésük megtévesztő, minthogy döntő többségük sztöichiometrikus mennyiségben szükséges az adott reakció lejátszódásához. Gyakran a szubsztráthoz hasonló módon kötődnek meg a fehérjén, a reakció lejátszódása után pedig megváltozott formában szakadnak le arról. Szerepük általában valamilyen atom vagy atomcsoport biztosítása a katalitikus reakció számára (4.3. táblázat). Ezért helyesebb koszubsztrátnak nevezni őket. Ugyanakkor, a szubsztrátoktól élesen megkülönbözteti őket az a sajátságuk, hogy az adott enzimről leszakadva rövid időn belül eredeti formájukba alakulnak vissza, más enzimek segítségével.

4.3. táblázat: Néhány prosztetikus csoport és koenzim, ill. ezek szerepe.

A fémionok az enzimek működése során jelentős szerepet kapnak. Az enzimek kb. 30 %-ának működéséhez szükséges valamilyen fémion, melyeket kofaktoroknak nevezünk. Magát az enzimet metalloenzimnek, ha erősen kötött fémiont tartalmaz, míg fémion által aktiváltenzimnek, ha működéséhez gyengébben kötött fémion(ok)ra van szüksége. A ma ismert ribozimok legnagyobb része is fémionok segítségével fejti ki hatását.

4.2. Az enzimek kialakulása

Az élet mai formáinál jól ismert a genetikai információ tárolására szolgáló DNS, az információ átadását végző RNS, ill. az előbbiek szintéziséért, átalakításáért és lebontásáért felelős fehérje alapú enzimek egymásra utaltsága. Ebből fakadóan, sokáig e létfontosságú makromolekulák párhuzamos fejlődése volt a biológia evolúció egyetlen elképzelhető forgatókönyve. A már említett ribozimok (katalitikus sajátsággal bíró RNS molekulák) felfedezése új lehetőséget szolgáltatott a földi élet korai szakaszának magyarázatára. E hipotézis szerint a mai fehérje nukleinsav alapú életet megelőzte egy „RNS világ”. Ennek bizonyítékaként tekinthető az a tény, hogy a ma ismert koenzimek, prosztetikus csoportok jelentős része nukleotid-származék (4.3. táblázat), és hogy az aminosavak összekapcsolása fehérjékké ma is RNS segítségével történik a riboszómában. Azonban a legkisebb ribozimok is túlságosan bonyolultak ahhoz, hogy szerepet játszhassanak az élet első formáinak kialakulása körüli időkben.

A kb. 4 milliárd éve kialakult óceánok vizében az akkor rendelkezésre álló egyszerű molekulákból (H2, CH4, NH3, H2O, H2S stb.), a Nap erős ultraibolya sugárzásának hatására, viszonylag rövid idő (50-100 millió év) alatt jelentős mennyiségű egyéb kisebb vegyület (pl. H2CO, HCN) halmozódott fel. E vegyületek, polimerizációra való hajlamuk révén, már magukban hordozták a nagyobb molekulák kialakulásának lehetőségét. Azonban, már a prebiotikus korban is csak katalizátorok segítségével képzelhető el a nagyobb (Mr = 50-150) vegyületek kialakulása. Az első katalizátorok, minden bizonnyal, szervetlen vegyületek, pl. szilikátásványok, ill. a vízben oldott formában jelenlévő fémionok voltak. Számos kísérlet bizonyítja, hogy a fenti anyagokból kiindulva, ultraibolya sugárzás hatására, vagy fémionok jelenlétében, aminosavak, cukrok, ill. nukleozid bázisok képződnek (4.1.a ábra). A fémionok alapvető szerepe az élet kialakulásához fontos vegyületek képződésében a 4.1.b ábrán is látható: pirrolból és formaldehidből, laboratóriumi körülmények között, porfiringyűrű képződik kétértékű fémionok (pl. Zn(II)) jelenlétében. A fémionoknak a fenti reakciókban betöltött irányító szerepét templáthatásnak nevezzük. A fémion koordinációs szférájának szimmetriája a reakció szempontjából geometriailag kedvezően helyezi el a ligandumokat. Hasonlóan fontos, hogy a fémion Lewis-sav jellege (elektronszívó sajátsága) miatt, a ligandum elektronszerkezete jelentősen megváltozik, szerencsés esetben a ligandum aktiválódik, ami szintén a reakció lejátszódását segíti elő.

4.1. ábra: Példák templátreakciókra. Az a ábrán az egyszerűség kedvéért nem törekedtünk a reakcióegyenletek sztöchiometriájának rendezésére.

Valószínű, hogy a fent említett templáthatáshoz hasonló jelenség irányította a nagyobb molekulák, oligomerek kialakulását. A különböző szilikátásványok polimer szerkezete egyfajta sablont biztosított több monomer egység egyidejű megkötődéséhez, és a monomer egységek elektronszerkezetének kedvező megváltoztatása révén, a reakció lejátszódását eredményezhették. Ugyanakkor, a királis szilikátásványok magyarázatot jelenthetnek a homokiralitás kialakulására is. A mai enzimek kialakulásának egyik lehetőséget a továbbiakban az jelenthette, hogy az egyre nagyobb koncentrációban kialakuló nukleozid-oligomerek átvették a templát szerepét („RNS-világ”). Erre a bázisok között kialakuló hidrogénhidas kötések kiváló lehetőséget teremthettek.

Egy másik lehetőség az aminosav-alapú biokatalizátorok szubsztrát által irányított kialakulása: a szubsztrát molekula, másodlagos kötések kialakulása révén, sablonként (templátként) szolgálhat egy specifikus katalizátor kialakulásához. E hipotézist néhány kísérleti eredmény is alátámasztja: a Trp, Asn, Met és Cys aminosavakat, Fe(II)-iont és diciánamidot (kapcsolószer) tartalmazó rendszerben, csak a 4-nitrofenol-b-D-galaktopiranozid szubsztrát jelenlétében képződik jelentős mennyiségű Fe(II) Cys-Cys komplex, amely felelős a szubsztrát hidrolíziséért is.

4.3. Az enzimek általános működési mechanizmusa

Az enzimek a katalizált reakciók sebességét 6-18 nagyságrenddel képesek felgyorsítani. E rendkívüli hatékonyság molekuláris szintű magyarázata még nem született meg. Számos elmélet került kidolgozásra, melyek közül az első hipotézist, az ún. kulcs-zár modellt, Emil Fischer állította fel a XIX. század végén. Eszerint, az enzimek szelektivitására az enzim és a szubsztrát komplementer szerkezete ad magyarázatot. A megkötődés során nem változik sem az enzim, sem a szubsztrát szerkezete (4.3.a. ábra).

Ugyanakkor, az elmúlt évtizedek szerkezetvizsgálati eredményei a fehérjék dinamikus szerkezetére utalnak. Ez azt jelenti, hogy határozott konformációs különbség mutatkozik a szabad, ill. a szubsztrátot megkötő enzim szerkezetében, amit már enzim-szubsztrát komplexek kristályszerkezeteivel is alátámasztottak (4.2. ábra). A szubsztrát megkötődése megváltoztathatja a kötőhely és az azt körülvevő csoportok között kialakuló másodrendű kötéseket, vagy pl. leszoríthatja a kötőhelyen megtapadó vízmolekulákat. A fentiek miatt 1958-ban, a kulcs-zár modell továbbfejlesztéseként, D. E. Koshland bevezette az indukált illeszkedés hipotézisét, mely szerint, a szubsztrátot már megkötött enzim kötőhelye valóban komplementer viszonyban áll a szubsztrát szerkezetével, de a szabad enzim nem. A merevnek feltételezett szerkezetű szubsztrát megkötése során, tehát, az enzim konformációs változást szenved (4.3.b. ábra).

4.2. ábra: Az EcoRV nevű restrikciós endonukleáz enzim kristályszerkezete a DNS szubsztrát (balra) távol-, ill. (jobbra) jelenlétében (Cell. Mol. Life Sci. 62 (2005) 685 707).

Bár az enzimek nagyfokú specifikussága a fentiek alapján értelmezhetővé válik, nem kapunk magyarázatot az enzimatikus reakciók mechanizmusára.

4.3. ábra: Az enzim-szubsztrát kölcsönhatás modelljei. Az ES komplex kialakulása során:

az enzim és a szubsztrát szerkezete is változatlan (kulcs-zár modell) (a); csak az enzim szerkezete változik (Indukált illeszkedés: hipotézis) (b); az enzim és a szubsztrát szerkezete is megváltozik (a szubsztrát az átmeneti állapotba kerül) (c).

H. Eyring szerint minden kémiai reakció egy, a reaktánsok és a termék(ek) közötti instabil köztitermék képződése révén valósul meg. A kiindulási és e köztitermékhez tartozó átmeneti állapot energiakülönbségét nevezzük aktiválási energiának. A katalizátorok az átmeneti állapot stabilizálása révén képesek megnövelni egy reakció sebességét az aktiválási energia csökkenése miatt. A kezdeti és végállapot energiakülönbsége, valamint a teljes reakcióra vonatkozó szabadenergia változás a katalizált, ill. nem-katalizált folyamat esetén azonos. Általánosságban a következő séma írható fel egy A+B folyamatra a katalizátor (K) távol-, ill. jelenlétében (4.1. Séma).

Katalizátor jelenlétében, a termékké alakulás (második lépés) valamivel lassabb, de a teljes reakció mégis jóval gyorsabb, mint a nem-katalizált reakció.

Polányi Mihály már 1921-ben felismerte, hogy egy katalizátor erősebben képes megkötni a szubsztrátot, ha az átmeneti állapotra jellemző szerkezet irányába torzul. Linus Pauling szerint, ha egy potenciális szubsztrát enzimhez kötődése során viszonylag stabilis átmeneti állapotot alakul ki (ami nem feltétlenül jelent szerkezeti torzulást), akkor azt az enzim gyorsan továbbalakítja (4.3.c. ábra). Ezt támasztja alá számos enzim inhibitorának vizsgálata. A kulcs-zár, ill. az indukált illeszkedés hipotézisek alapján kifejlesztett, a szubsztráthoz hasonló molekuláknál jóval hatékonyabb és specifikusabb inhibitorok voltak azok, melyek az átmeneti állapot szerkezetével mutattak rokonságot (például a rákellenes hatású pentostatin nevű gyógyszer (4.4. ábra))

4.4. ábra: Az adenozin deamináz sematikus működési mechanizmusa (fent), valamint az enzim egyik rendkívül hatékony inhibitorának (pentostatin) szerkezete (lent).

Az enzimatikus reakciók sematikus energia-diagramján (4.5. ábra) az első lépésben a szubsztrát az enzimhez kötődik. Ennek révén apoláris, H-hidas, ill. ionos kölcsönhatások jönnek létre, melyek az átmeneti állapot kialakulását segítik elő. Az átmeneti állapotban a legtöbb esetben valószínűleg az enzim szerkezete is megváltozik az aktív központ környezetében (v.ö. indukált illeszkedés). A reakció lejátszódása után a termék időlegesen kötve marad, majd eltávozik, s az enzim visszaalakul a kiindulási állapotba.

4.5. ábra: Az enzimatikus reakciók (folytonos vonal) és a nem katalizált megfelelőjük (szaggatott vonal) sematikus energia diagramja elcsúsztatva az y-tengely mentén, a jobb áttekinthetőség kedvéért.

A 108-1018-szoros sebességnövekedés eléréséhez azonban nem elegendő a fentiekben adott magyarázat. Az entatikus állapot hipotézis szerint, az enzim aktív központja entatikus (feszült, magasabb energiájú) állapotban van, ami szintén az aktiválási energia csökkenéséhez vezet. Tipikus példája az entatikus állapotban lévő enzimeknek az ún. I-es típusú réztartalmú (kék réz) fehérjékmelyek az elektronszállító fehérjék családjába tartoznak, s két szubsztrát közötti egyelektronos elektronátadást (redoxi reakciót) segítenek elő. Aktív központjukban egy rézion található, s a szubsztrátok az aktív centrumtól viszonylag távol (kb. 15 Å) kötődnek meg. A rézion erősen torzult tetraéderes szerkezetű (részletek a 7.3. fejezetben), ami sem a Cu(I) sem a Cu(II) oxidációs állapotnak nem kedvez, s ez mindkét irányban megkönnyíti az elektronátadást.

Egy másik elképzelés szerint az enzimek dinamikus szerkezete miatt az átmeneti állapot(ok)hoz tartozó aktiválási energia sem állandó, hanem mind az x-tengely (reakció koordináta) mind az y-tengely (aktiválási szabadenergia) mentén dinamikusan változik. E fluktuáló mozgás során vannak olyan pillanatok, mikor az aktiválási energia kisebb, mint az átlagérték, ami további sebességnövekedést eredményez.

Számos kísérleti eredmény igazolja, hogy nemcsak az aktiválási energiagát felett, hanem a kvantummechanikai alagút effektus révén, azon keresztül is haladhat egy kémiai reakció. Erre az anyag kettős (hullám-részecske) természete révén nyílik lehetőség. Mivel az egy részecskéhez rendelhető hullámhossz fordítottan arányos a tömeg négyzetével, a kvantummechanikai alagúteffektus csak könnyű elemi részecskék esetén (pl. elektron) lehet jelentős mely a jelenség révén akár 25-30 Å távolságot is „átugorhat” (7.4 fejezetet).

4.4. Az enzimek kinetikai sajátságai

Állandó enzim és növekvő szubsztrátkoncentráció esetén a reakció kezdeti sebessége (V0) előbb első rend szerint változik, majd fokozatosan telítésbe hajlik (a szubsztrátra nézve nulladrendűvé válik, 4.6. ábra).

4.6. ábra: Egy egyszerű enzimatikus reakció kezdeti sebességének függése a szubsztrát koncentrációjától.

A 4.6. ábrán látható hiperbolikus görbe a 4.1. általános egyenlettel írható le, ahol [S0] a szubsztrát kezdeti koncentrációját jelöli, míg a és b egy-egy állandó. A jelenséget leíró kinetikai modellt L. Michaelis és M. Menten nevével jelölik (Michaelis-Menten kinetika). A legegyszerűbb enzimek működése a 4.2. reakcióegyenlettel írható le, azaz a termék képződése egy enzim-szubsztrát komplex (ES) kialakulásán keresztül valósul meg. Ha a reakciónak csak a kezdeti szakaszát vizsgáljuk, amikor még nagyon kevés termék (P) képződött, a k 2 állandóval jelölt (E + P ?? ES) folyamat elhanyagolható mértékben játszódik le, a fenti egyenlet egyszerűsíthető: (4.3. egyenlet)

A Michaelis-Menten-féle kinetikai modell azt feltételezi, hogy a reakció megindulása után a stacionárius (angolul steady state) állapot igen hamar beáll. Ekkor az ES komplex kialakulásának és elbomlásának sebessége azonos: (4.4. egyenlet). Ezt az egyenletet átalakítva definiálhatjuk az ún. Michaelis-állandót (KM; 4.5. egyenlet). Figyelembe véve, hogy [E]0 = [E] + [ES], a 4.5. egyenlet átalakítható: 4.6. egyenlet. Ebből [ES]-t kifejezve a 4.7. egyenletet kapjuk, majd ezt a V0 = k2[ES] sebességi egyenletbe behelyettesítve kapjuk az ún. Michaelis-Menten 4.8. egyenletet. Összehasonlítva ez utóbbi és a 4.1. egyenletet, megkaphatjuk a és b állandók jelentését: a = k2[E]0 = Vmax, ill. b = KM, ahol Vmax az adott enzimkoncentrációnál elérhető legnagyobb reakciósebesség (ekkor minden enzim molekulához kötődik egy szubsztrát, [E]0 = [ES]). A 4.8. egyenlettel leírható reakciók döntő többségénél maga a kémiai átalakulás a sebességmeghatározó lépés, azaz k1, k-1 >> k2. Így a Michaelis állandó (KM) jó közelítéssel az ES komplex disszociációs állandójának is tekinthető (minél kisebb KM értéke, annál erősebb az enzim-szubsztrát kölcsönhatás). Ugyanakkor a 4.8. egyenletből az is következik, hogy KM megegyezik azzal a szubsztrát koncentrációval, ahol v0 = Vmax/2.

A Michaelis-Menten (4.8.) egyenlet csak azokra a legegyszerűbb enzimatikus folyamatokra érvényes, melyekben az enzim csak egyetlen szubsztrátot köt meg egyetlen kötőhelyén. Ez a feltétel az enzimek döntő többségénél nem teljesül. Ennek ellenére, megfelelően megválasztott körülmények között számos enzim kinetikai viselkedése sikeresen leírható vele.Az enzimek kinetikai vizsgálatánál gyakran alkalmazzák a 4.6 ábrán látható görbe ún. kettős reciprok (Lineweawer-Burk-féle) ábrázolását. A 4.8. egyenletből nyerhető a 4.9. egyenlet. 1/V-t 1/[S] függvényében ábrázolva egyenest kapunk (4.7 ábra).

4.7. ábra: A Michaelis-Menten (4.8.) egyenlet Lineweaver-Burk-féle ábrázolása.

4.5. Az enzimek gátlása (az inhibíció), az enzimek működésének szabályozása

Az enzimek aktivitását csökkentő anyagokat inhibitoroknak nevezzük. Az inhibitorok által előidézett gátlás lehet reverzibilis (az inhibitor másodrendű kölcsönhatások révén kötődik az enzimhez), vagy irreverzibilis (az inhibitor erős, kovalens kölcsönhatást alakít ki az enzimmel). A reverzibilis gátlás további típusokra osztható. Kompetitív a gátlás, ha az inhibitor a szubsztrátnak az enzimhez való kötődését gátolja meg. Ez általában két módon válik lehetségessé: (i) az inhibitor hasonló szerkezetű, mint a szubsztrát vagy az átmeneti állapot, (ii) az inhibitor az aktív központtól távol kötődik meg, de ez olyan konformáció változást idéz elő, amely meggátolja az enzim-szubsztrát komplex kialakulását. Mivel mindkét esetben egyensúlyi rendszerről van szó, a szubsztrát igen nagy koncentrációja esetén az inhibitor hatása elhanyagolhatóvá válik, így a maximális reakciósebesség (Vmax) nem változik, ugyanakkor KM az inhibitor koncentrációjának növekedésével egyre nő (4.8.a. ábra). A reverzibilis gátlás másik formája a nem-kompetitív gátlás. Ekkor az inhibitor az aktív központ működésében okoz zavarokat (pl. a katalízisben résztvevő csoporthoz, vagy metalloenzim esetén a fémionhoz kötődik), azaz a szubsztrát koncentrációjának növelése nem tudja leszorítani az inhibitort. Ekkor Vmax értéke csökken, de KM értéke nem változik (a szubsztrátkötő-hely nem módosul, ld. 4.8.b. ábra).

A reverzibilis inhibíció harmadik típusa az unkompetitív gátlás. Ekkor az inhibitor vagy az enzim-szubsztrát komplexhez kötődik. Ilyenkor az inhibitor az enzim aktivitását csökkenti, azaz Vmax értéke csökken, KM-é pedig nő a gátlószer koncentrációjának növekedésével (4.8.c. ábra).

4.8. ábra: Az enzimek reverzibilis gátlásának módjai.

A fentiek közül a biológiai rendszerekben az ún. allosztérikus gátlásnak van legjelentősebb szerepe, mely lehet kompetitív (az inhibitor az aktív centrumtól távolabb kötődik), vagy nem-kompetitív. Hasonló okokra vezethető vissza az allosztérikus aktiválás is. Ez a két, általában az enzim konformációjának megváltozását eredményező, mechanizmus az enzimatikus folyamatok szabályozásának egyik legfontosabb eszköze. Az enzimműködés reverzibilis biológiai szabályzásának még számos további módját ismerjük. Ilyen pl. a termékinhibíció, amely a termék felhalmozódásakor leállítja az enzim működését (feedback mechanizmus).

Az irreverzibilis gátlásra példa az enzimek szerin, treonin vagy tirozin egységeinek (OH-csoportjainak) foszforilációja-defoszforilációja. Az így kialakuló foszforsavmonoészterek két negatív töltésük révén erős ionos vagy H-hidas kölcsönhatásra képesek, melyek jelentősen befolyásolhatják az enzim konformációját, aktiválva vagy dezaktiválva azt. A protein-kinázok alakítják ki, míg a protein-foszfatázok hidrolizálják el a foszforsavmonoészter-csoportokat. Több száz olyan enzim ismert, melyek szabályozása ilyen módon történik.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Mi annak a feltétele, hogy egy kémiai reakció spontán módon lejátszódjon?

- Mi a katalizátor, és mi a szerepe a kémiai folyamatokban?

- Mit nevezünk enzimnek?

- Keresse ki az EC számmal megjelölt enzimeket és olvassa el leírásukat

- Mi a templáthatás!

- Milyen elméletek születtek az enzim-szubsztrát kölcsönhatás modellezésére?

- Mi az entatikus állapot?

- Hogyan írná fel a Michaelis és Menten nevével fémjelzett kinetikai egyenletet?

- Az enzim inhibíció milyen típusait ismerte meg?

Chapter 5. 5. FÉMIONOK FELVÉTELE, SZÁLLÍTÁSA ÉS TÁROLÁSA. BIOMINERALIZÁCIÓ

Kulcsszavak: transzferrin, ferritin, ceruloplazmin, albumin, metallothionein, csontképződés, biomineralizáció, kollagén

A kémiai elemek létfontosságú kategóriába történő besorolásának egyik alapfeltétele, hogy az illető elem részt vesz az anyagcsere folyamatokban, azaz meghatározott felszívódási és kiürítési mechanizmusa van. Az élő szervezetek a számukra szükséges elemeket a környezetükkel való anyagcsere révén felveszik, a felesleget kiválasztják. Az elem felvétele után beépül a szervezetbe, majd lebomlik és/vagy tárolódik a későbbi felhasználásra, vagy jórészt kiürül. A tárolás és az azonnali kiürülés aránya elemenként más és más, így az elemek „tartózkodási ideje” a szervezetben eltérő.

A felszívódás mechanizmusa szinte minden elem esetén más és más, és a hasznosulás mértékét befolyásoló tényezők is jelentősen különbözhetnek. Ezt jól szemlélteti például a két leggyakoribb nyomelem, a vas és cink jelentősen különböző felvételi mechanizmusa. A vas felvételének mértékét elsősorban a vastárolók (ferritin) telítettségének szintje határozza meg, közel függetlenül a gyomorba került összes vas mennyiségétől. A cinkfelvételt ugyanakkor a koncentrációfüggő mechanizmus jellemzi, azaz a nagyobb pótlás, nagyobb hasznosulást eredményez. Ugyanakkor mindkét fémion esetén ismertek olyan anyagok amelyek gátolják, ill. elősegítik az említett fémionok felvételét (további részleteket lásd az M3 mellékletben).

Egy adott elem koncentrációjának a változása hatással van más elemek koncentrációjára és fiziológiai hatására is. Egy sokdimenziós kölcsönhatás-rendszer áll fenn a szervezet számára fontos elemek anyagcseréje között. Két komponens kölcsönhathat úgy, hogy erősítik megfelelő hatásukat (szinergizmus) vagy úgy, hogy egymással versengenek, és elnyomni igyekeznek a másik elem hatását (antagonizmus).

5.1. A fémionok szelektív felvétele

Érdekes, hogy bár a periódusos rendszer gyakorlatilag minden eleme előfordul az élő szervezetekben (lásd a 2.1. táblázatot), csak viszonylag keveset hasznosítanak ezekből. Így a 2.1. fejezetben felsorolt létfontosságú elemek, a Mo kivételével a periódusos rendszer első 30 eleméből kerülnek ki. Miért ezeket választotta ki a természet és miért nem másokat, holott szervetlen kémiai ismereteink alapján mások potenciális értéke nagyobbnak tűnik. Például kobalt-tartalmú légzési fehérjék nem alakultak ki, holott tudjuk, hogy egyes kobalt vegyületek hajlamosak az O2 reverzibilis megkötésére. Amint azt a 2.1. fejezetben tárgyaltuk az egyik tényező, amely megszabta, hogy az élő szervezetek mennyire hasznosították az egyes elemeket az a relatív gyakoriságuk, de még inkább a biohozzáférhetőségük volt. A vas a leggyakoribb átmenetifém a földkéregben és a redukáló atmoszféra idején a tengervízben is lényegesen nagyobb lehetett a koncentrációja, mint ma, amikor az oxidáló atmoszférában létező Fe(OH)3 rossz oldékonysága miatt a koncentrációja igen kicsiny. Így nem meglepő, hogy nagyon sok szervezet számára létfontosságú lett. Az sem meglepő, hogy az atmoszféra oxidálóvá válásával, amikor biohozzáférhetősége jelentősen lecsökkent, a különböző szervezetek igen változatos mechanizmusokat alakítottak ki (lásd később) a vasszükségletük biztosítására. A másik tényező, amit figyelembe kell venni az, hogy a fémtartalmú fehérjék aktív centrumát kinetikailag labilis fémionok, termodinamikailag stabilis egységei alkotják. Az enzimben kötött fémion általában veszít labilitásából, renyhévé válik, így a fémion gyors beépülése az enzim aktív centrumába és kilépése onnan általában gátolt, de a szubsztrát viszonylag gyors asszociálódása, ill. disszociációja megmarad. Az olyan fémionok, mint a Cr(III) vagy a Co(III), melyekről tudjuk, hogy ligandumcsere folyamataikban nagyon inertek, nem hasznosulhattak. Hasonlóképpen, az átmenetifémek második és harmadik sorában található fémionok lényegesen inertebb voltuk miatt gyakorlatilag nem játszanak szerepet a bioszervetlen kémiában, holott a kémiai ipar nagyon sokat alkalmaz közülük homogén vagy heterogén katalizátorként.

Hogyan tudják a biológiai rendszerek a számukra fontos elemeket a környezetükből, a szilárd ásványokból felvenni. A tengeri élőlények esetén is a biohozzáférhetőséget alapvetően a szilárd ásványokból való kioldódás mértéke határozza meg. Az olyan ionok számára, mint a Na+, a Mg2+ vagy a Zn2+, az oldhatóság a szükséges mM koncentrációban nem jelent problémát. Más elemek, mint a vas, különösen +3 oxidációs állapotban azonban semleges pH-n nagyon rosszul oldódnak. Valamely elem felvételének módját jelentős mértékben meghatározza, hogy milyen természetű az a környezet, amelyet elhagy, és amelybe kerül. A környezet fontos jellemzői a pH, az ionerősség, a redoxipotenciál és a kémiai összetétel. Ezek a jellemzők a biológiai rendszerekben jelentős eltéréseket mutatnak. A sejten belül a pH 7 körüli, az ionerősség kb. 0,3 M, a redoxipotenciál 0,0-0,4 V között változhat, a sejten kívül a redoxipotenciál lényegesen nagyobb, akár a +0,8 V értéket is elérheti. Speciális testnedvekben, pl. az emésztőnedvekben a pH értéke igen kicsi is lehet (pH 1 és 3 közötti). A kémiai forma, amelyben egy adott elem előfordul (speciáció) általában meghatározó a szervezet válaszát tekintve. A felvétel útja, mértéke és sebessége, a metabolizmus, a tárolás és a kiválasztás nagymértékben különbözhet. A szervetlen vegyületek felszívódása alapvetően az oldhatóságuktól, annak termodinamikai és kinetikai viszonyaitól függ. Az emberi szervezet, pl. 70-80 %-ban képes a molibdátot MoO42 a tápanyagokból felvenni, ugyanakkor a lassan kölcsönható Cu(I) felvétele igen kismértékű (? 1%).

Ha egy adott fémre egy adott szervezetnek szüksége van, akkor azt energiafelhasználás árán is de felhalmozza sejtjeiben. Például a tengeri zsákállatkák vanadocitái 7 nagyságrenddel nagyobb koncentrációban tartalmazzák a vanádiumot, mint a környező tengervíz, amelyben élnek, nyilván indokolt a vanádiumnak ez az óriási mértékű felhalmozódása. A feltételezések szerint vanádium a tunicitákban redoxi folyamatok moderátora, bár pontos szerepe, az e téren ma is folyó jelentős kutatások ellenére, nem ismeretes. Hasonlóképpen és sajnálatosan, egyes kagylófélék a toxikus kadmiumot vagy a higanyt dúsítják fel magukban. A higanyvegyületek nagy részének rendkívüli toxicitása a világ előtt is világossá vált, amikor jelentős mennyiségű higanytartalmú katalizátor hulladék szennyezte el Japánban a Minamata öblöt 1948 és 1960 között, és a higannyal szennyezett tengeri kagylók fogyasztása több ezer ember halálát okozta (15.2. fejezet). Az 5.1. táblázatban azt mutatjuk be, hogy egyes elemeket mely növény- és állatfajták dúsítanak fel kiemelkedő mértékben.

5.1. táblázat: Egyes elemeket leginkább feldúsító növény- és állatfajták.

A fontos elemek felvételéhez az élő szervezetek akár a kémiai környezetük megváltoztatására is képesek, bizonyos anyagok, pl. komplexképzőszerek kibocsátásával változtatva meg az aktuális redoxipotenciált és ezen keresztül az oldhatóságot. Például, vannak olyan baktériumok, melyek a vassal igen stabilis komplexet képező sziderofór típusú vegyületek révén a számukra fontos vasat még a rozsdamentes acél felületéről is képesek felvenni, vagy egyes növények pirokatechin származékokat (pl. kávésav, klorogénsav) bocsátanak ki gyökerükön keresztül, melyek képesek a rosszul oldódó Fe(III)-at a lényegesen jobban oldódó Fe(II)-vé redukálni, elősegítve így a vas felvételét.

A fentiek alapján is nyilvánvaló, hogy a nyomelemek hasznosulását lehetővé folyamatok minden elem esetén egy igen bonyolult rendszert alkotnak, amit az elem kémiai jellemzői és biokémiai funkciói egyaránt alapvetően befolyásolnak. Ezek a folyamatok egyaránt tartalmazzák a felszívódás, szállítás (beleértve a membránon keresztüli transzportot) és tárolás megvalósulását. A legtöbb elem esetén ezek a folyamatok még alig (vagy részben) ismertek, ezért a továbbiakban a két, ebből a szempontból legjobban megismert elem a vas és réz szállításának és tárolásának formáival és az azokat befolyásoló tényezőkkel foglalkozunk. Az egyéb nyomelemekkel kapcsolatban a szállítás/tárolás egyes lényegesebb pontjait az M3 mellékletben érintjük.

5.2. A vas szállítása és tárolása az emberi szervezetben

Az összetett szervezetekben, mint az emberben is a vas szelektív szállítása kitüntetett fontosságú. A vas felvétele a táplálékokból +2 oxidációs formában hatékony, például az aszkorbát (C-vitamin) fokozza a vas gyors felszívódását, míg a nem redukáló tulajdonságú, de a Fe(III)-mal erős kölcsönhatásra képes foszfát gátolja ezt a folyamatot. Alacsonyabbrendű szervezetekben a vas szállítása és tárolása ugyanazon anyagok, a kis molekulatömegű sziderofórok révén történik, míg magasabbrendű szervezetekben a két funkció szétválik és e feladatokat nagy molekulatömegű fehérjék a transzferrin (szállítás), ill. a ferritin és hemosziderin (tárolás) látják el. Ilyen transzport- és tárolórendszer azonban nem csak az emlősökben található. A vastároló fehérjét a fitoferritint a növényekben, míg a hemtartalmú bakterioferritint egyes baktériumokban mutatták ki.

5.2.1. A transzferrin

A transzferrin fő funkciója az, hogy a vasat a felszívódás, a tárolás vagy a lebomlás helyéről a felhasználási helyekre szállítsa. A szállított vas legnagyobb része az új vérsejtekben a hemoglobin szintézisére használódik fel, terhesség alatt jelentős mennyiségű vas szállítódik a méhlepényen át a magzatnak is. A másik sokkal közvetettebb, de lényeges szerepe a transzferrinnek, a fertőzésekkel szembeni védelem. A transzferrin olyan erősen köti a vasat (lg K ? 22), hogy nem marad vas az élősködő mikroorganizmusok számára és így azok fejlődését, és szaporodását gátolja. Ez egy fajtája a nem specifikus immunrendszereknek. A laktoferrin (a tejben) az ovotranszferrin (a tojásfehérjében) a fertőzésre nagyon érzékeny testfolyadékok, a nyálkahártya és az embrió fertőzések elleni védelmét is biztosítja.

A transzferrinek (ovotranszferrin, laktoferrin és szérum transzferrin) ? 8? kDa molekulatömegű glikoproteinek. Egyetlen polipeptidláncból állnak, melynek harmadlagos szerkezete két alegységet határoz meg, ezek mindegyike tartalmaz egy-egy vaskötő helyet. A vas torzult oktaéderes koordinációs szféráját két Tyr fenolát-O (ez adja a fenolát-O ? Fe(III) CT átmenet révén a vasat tartalmazó fehérje intenzív vörösesbarna színét), egy His imidazol-N, egy Asp karboxilát-O és a kétfogúan kötődő karbonát két O-je telíti. A karbonát hidrogénkötésben van Arg és Thr oldallánccal, ill. két peptid-NH csoporttal. A kötésmódot az 5.1. ábra szemlélteti.

A két félrészből álló egység fémmentesen nyitott konformációja a Fe(III) és a szinergista CO32- anion megkötődése után egymásra hajló zárt konformációt vesz fel. A két konformáció ezen reverzibilis egymásba alakulása alapvető fontosságú a hatékony vastranszporthoz (5.1. egyenlet). Mind a Fe(II), mind a Fe(III) kötődik a transzferrinhez, de a Fe(II) csak gyengén, aminek oxidálódnia kell Fe(III)-má, hogy az igen stabil kötődését elérje.

5.1. ábra: A laktoferrin aktív centruma, a vas koordinációs szféráját mutatva.

5.2.2. A ferritin és a hemosziderin

A sejtbe bejutott vas vagy azonnal felhasználódik, vagy biztonságos módon tárolódik. Különösen az O2 dús atmoszféra kialakulása után vált szükségessé egy rendszer, amely képes a vasat biztonságosan tárolni, hogy a Fe(III) ellenőrizetlen hidrolízise és a redukált szabad vasionnak O2-nel vagy annak metabolitikus termékeivel való reakciójában (pl. Fenton reakció) az igen reaktív, OH képződése elkerülhető legyen. Két nagy fehérje szolgál erre a célra a ferritin és a hemosziderin. A ferritin az állatokban és a növényekben is megtalálható. Az emberi test vastartalmának mintegy 13%-a található ehhez a fehérjéhez kötve, és elsősorban a májban, a lépben és a csontvelőben fordul elő. Ez a nagy fehérjemolekula egy változó méretű és összetételű szervetlen magból és az azt körülvevő fehérjeburokból áll, mely egy ? 7,5 nm átmérőjű üreget határoz meg.

Az apoferritin átlagos molekulatömege 440 kDa és 24 egyforma alegységből áll, ez így ?12 nm külső átmérőjű egységet alkot (lásd 5.2. ábra).

5.2. ábra: A 24 alegység elrendeződése az apoferritinben.

Az alegységek térbeli elrendeződése több hidrofób és hidrofil csatornát alakít ki, melyeknek fontos szerepe van a vas beépülésében és felszabadulásában. Az alegységek által meghatározott üregben maximálisan 4500 (átlagosan 1200, így az üreg telítettsége változó mértékű) vascentrum található oxigén klaszter formájában, melynek sztöchiomeriája Fe9O9(OH)8(H2PO4), bár a foszfát mennyisége változó. A szervetlen vasvegyület hexagonális szoros illeszkedésű oxid-, vagy hidroxidhidas Fe(III)-oxid rétegekből áll. A foszfátok szerepe feltehetőleg a szervetlen magnak a fehérjéhez való kötésében van. A ferritin képződése során a Fe(II) képes bejutni az apoferritin hidrofil csatornáján keresztül mintegy 3000 Fe/s sebességgel az üregbe, ahol vastartalmú ferroxidáz enzim katalizálta folyamatban az O2 Fe(III)-má oxidálja és beépül a szervetlen magba. A vas mobilizálása a ferritinből szintén redoxi reakcióhoz kötött. A rácsból szabaddá váló Fe(II) enzimkatalizált mobilizálásában sav-bázis reakcióknak és kelátképződésnek is szerepe van.

5.3. A réz felvétele, szállítása és tárolása

A réz felszívódása (naponta 3-5 mg) a bélből döntően aktív folyamat és Cu-ATP-áz enzimek közreműködésével történik (15.1. fejezet). A réz felszívódását aminosavak elősegítik. A bélfalon a réz részben valószínűleg aminosavkomplexekben kötve jut át. A vérbe került réz kötésében két fehérje az albumin és a ceruloplazmin vesznek részt. Az albumin egy ?70 kDa molekulatömegű fehérje, melyet diszulfidkötések stabilizálnak. A rezet az N terminális vég X-X-His szekvenciája köti (NH2, N, N, Nimidazol) koordinációval. A fehérjék oligopeptid-szerű fémion-kötése igen ritka, pl. az albumin a cinket, melyet ugyancsak szállítani képes, már fehérje-szerűen az oldallánc donorcsoportokon keresztül köti (3. fejezet). Az albuminhoz kötött réz mobilis. A keringési rendszer réztartalmának meghatározó része azonban a ceruloplazminban kötve található. Ez alapján sokáig úgy vélték, hogy a ceruloplazmin az elsődleges rézszállító fehérje. A ceruloplazmin egy ?150 kDa molekulatömegű fehérje és kékréz oxidázok közé sorolható (lásd 10.1.2. fejezet) és már inertebb kötésmódban tartalmazza a rezet. A réz anyagcsere zavaraiból addódó jól ismert betegségek (a Wilson-kór és Menkes-kór, lásd 15.1. fejezet) a ceruloplazminszint lecsökkent szintjével párosulnak. Csökkent ceruloplazmin termelés esetén a réz elsősorban a májban és az agyszövetekben halmozódik fel (Wilson-kór), ill. egyes fontos rézrtartalmú enzimek hiányához vezet (Menkes-kór), és mindkettő végzetes következményekkel járhat. Az újabban megismert aceruloplazminémia nevű betegség azonban a ceruloplazmin teljes hiányát jelenti, de nem eredményezi a réz anyagcseréjének zavarát. Ezen adatok egyértelművé tették, hogy az elsődleges rézszállító fehérje az albumin, míg a ceruloplazmin, mint ferrooxidáz alapvető szerepet játszik a vas anyagcserében. A réz hiánya is okozhat tehát vérszegénységet, mivel a réz befolyásolja a vas anyagcserét. Réz szükséges a vörös vérsejtek éréséhez, a vasnak a hembe való beépüléséhez és a vas mobilizásálásához a ferritinből a transzferrinbe, mivel katalizálja a Fe(III)/Fe(II) redoxi átalakulást, ami szükséges a vasnak a szállító/tároló/funkcionális fehérjék közötti mozgásához (5.2. és 15.1. fejezetek).

A réz szállításával kapcsolatban említést kell még tenni azokról a fehérjékről, amelyek a fémionnak a membránon keresztüli transzportját biztosítják. Ezeket összefoglaló néven „metallochaperon”-oknak nevezik és elsődleges szerepük, hogy a fémionokat specifikus kötő/felvevő helyekre eljutassák. Ezek egyrészt lehetővé teszi a fémionnak a membránon keresztüli transzportját, másrészt biztosítják, hogy az igen reaktív szabad fémionok sejten belüli koncentrációja rendkívül alacsony legyen. A rézhiánnyal/fölösleggel összefüggő megbetegedések valódi okát is ilyen specifikus réztranszport fehérjék hiánya/mutációja (ATP7a and ATP7b) jelenti.

A cink transzportfolyamatai az új eredmények tekintetében hasonlatosnak tünnek a rézhez. A keringési rendszeren belül mindkét fémion szállításában az albumin szerepe meghatározó, míg a sejten belül specifikus cinktranszport fehérjék jönnek számításba. Ugyancsak számottevő hasonlatosság látszik a két fémion tárolásában is, amelyben a metallothionein nevű fehérjéknek/polipeptideknek van kitüntetett szerepe.

5.4. A metallotioneinek

A metallotioneinek az emberben, állatokban és növényekben (fitokelatinok) is megtalálható viszonylag kis molekulatömegű (~ 60 aminosav, 6-7 kDa) fehérjék, melyek klaszter szerkezetben képesek szoft fémionokat megkötni. Mivel ezek igen gazdagok Cys aminosavban (~ 33%), szoft fémionok, mint a Cu(I), Zn(II), Cd(II), Hg2(I), Hg(II), Ag(I) és Co(II) szelektív kötőfehérjéi. Kén- és fémtartalmuk igen nagy, 10% körüli értéket ér el. Az izolálási helytől függően eltérő aminosav összetételűek lehetnek és fémtartalmuk is változó. Szerkezeti érdekességüket a nyúlmáj metallothionein, ill. annak Zn(II)-komplexének példáján mutajuk be. Az 5.3. ábra a polipeptid aminosav szekvenciáját mutatja, kiemelvén a 62 aminosavból összesen 20 ciszteint. A ciszteinek mindegyik kénatomjai két klasztert hoznak létre a kapcsolódó Zn(II)-ionokkal, Zn3S9 és Zn4S11 összetételben. Ezen klaszterek szerkezetét az 5.4. ábra szemlélteti, míg az 5.5. ábra a teljes molekula képét vázolja fel.

5.3. ábra: A nyúlmáj metallothionein aminosav szekvenciája.

5.4. ábra: A nyúlmáj metallothionein Zn3S9 és Zn4S11 klasztereinek kötésmódja (Zn(II): zöld, Cys-S: sárga).

5.5. ábra: A nyúlmáj metallothionein teljes szerkezete jelezvén a Zn3S9 és Zn4S11 klasztereket.

A metallotioneinek szokatlanul reaktívak; nagy termodinamikai stabilitásuk nagy kinetikai labilitással párosul. A fémionok stabilitási sorrendje a szervetlen tiolátokénak megfelelően: Hg(II) > Ag(I) > Cu(I) ~ Cd(II) > Zn(II). A könnyű ligandumcsere reakciók mind az oldatban levő fémionokkal szemben, mind a más metallotionein klaszterekben kötött fémionokkal szemben érvényesül.

A metallotioneinek feltehetően többfunkciós fehérjék, és alapfunkciójuk függ az élő szervezettől és a fehérje variánstól:

(1) Mint fémtárló molekulák elsősorban a réz és a cink homeosztázisában (fémionháztartásában) vesznek részt,

(2) Mint méregtelenítő molekulák a nem kívánatos szoft fémionok (mint a Cd(II), a Hg(II), az Ag(I) és az Au(I)) eltávolításában aktívak (15.1. fejezet),

(3) Mint tiolátokban gazdag fehérjék képesek az erélyes oxidáló hatású gyökök, pl. az OH megkötésére és redoxi reakció révén való semlegesítésére, különösen a központi idegrendszerben.

(4) Feltételezhető, hogy a sejtek redoxi állapotának szabályozásában és energia metabolizmusában is szerepet játszanak.

A megkötődő fémionok képesek a metallotioneinek képződését indukálni, megfelelő specifikus gének aktiválása révén. Ez arra utal, hogy a metallotioneinek bioszintézise egy szigorúan szabályozott rendszer részét képezi, melynek feladata e fémionok szintjének szabályozása.

5.5. Biomineralizáció

Az élő szervezetek ásványokat szintetizálhatnak egyszerű vegyületekből különböző célokból. A biológiai ásványképződés elsősorban abban tér el a geológiai ásványképződéstől, hogy az ásvány morfológiáját (kristályszerkezetét) biológiai mátrixanyagok erősen szabályozzák. Az élő szervezetben lezajló biológiai ásványképződést bioásvány-képződésnek vagy biomineralizációnak nevezzük.

Alapvető követelmény a bioásványokkal szemben a kis oldhatóságuk a normál fiziológiás körülmények között. A bioásványok tiszta vagy vegyes fázisokként is megjelenhetnek, amorf vagy mikrokristályos formában, tisztán vagy szerves polimer mátrix anyagokkal (fehérjék, lipidek, poliszacharidok) együtt. Képződhetnek intracellulárisan, a sejtek felületén vagy a sejten kívüli térben. Ezek az ásványi lerakódások részt vesznek a sejtek kation- és anionkoncentrációjának szabályozásában, így a szervezet homeosztázisának a fenntartásában is.

5.5.1. A kalcium-foszfát a csontokban

A gerincesek vázanyagai a csontok mintegy 30%-ban egy szálas fehérjeanyagból, a kollagénből, 55%-ban az erre rákristályosodott kalcium-foszfátból, elsősorban hidroxiapatitból és mintegy 15%-ban egyéb ásványokból, mint a kalcium-karbonát, a kova, a magnézium-karbonát állnak (5.6. ábra).

5.6. ábra: A kollagén és a hidroxiapatit fázisok kapcsolódása a csontokban.

A csontokban a szervetlen ásvány biztosítja a keménységet és nyomásállóságot, míg a szerves mátrix kollagén a hajlékonyságot, a rugalmasságot és törésállóságot. A kollagén rostszerű fehérje. A csontképződés a kötőszövetek határfelületén elhelyezkedő foszfátban gazdag csontsejtek felületén megy végbe. A csontokba beépült Ca2+ és foszfát folyamatos cserében van a szabad ionokkal. A csontok teljes Ca2+ tartalma néhány év alatt teljesen kicserélődik, míg a foszfát ennél jóval gyorsabban, órák alatt. A csont növekedéséhez a Ca2+ és a foszfát ionok viszonylagos fölöslege szükséges, amit az ATP-t fogyasztó ionpumpa a Ca-ATPáz biztosit aktív transzport révén. Különböző fémionok, mint a Cd2+, az Pb2+, vagy az Al3+ megzavarhatják a csontképződés folyamatát, mert beépülhetnek a Ca2+ helyére és a csontoknak eltérő mechanikai szilárdságot (törékenység, hajlékonyság) kölcsönözhetnek. A Ca2+-hoz igen hasonló méretű és tulajdonságú Sr2+ teljes mértékben helyettesítheti az előbbit. Ennek a folyamatnak a radioaktív 90Sr beépülésénél van jelentősége, mert a 90Sr erős γ sugárzó, és beépülve a csontokba a csontvelőt folyamatos radioaktív sugárzással károsítja, ami fehérvérűséget idézhet elő. Ugyanakkor a gyorsabban távozó és gyengébben sugárzó 30P izotópot a csontrendszer diagnosztikai vizsgálatában használják.

A magasabbrendű gerincesek csontjainak és fogainak kifejlődése jár talán a legnagyobb változásokkal a biomineralizációs folyamatokban. Kezdetben pl. a foganyag 80-90%-ban speciális szerves márixfehérjékből áll és csak mintegy 10-20% az ásványi anyag tartalma. Ez közel teljes mineralizáción megy át és a végleges fog külső része élő sejtet egyáltalán nem tartalmaz, teljes egészében szervetlen anyagból, főként hidroxiapatitból áll, melyben a hidroxicsoportokat részben fluoridcsoportok helyettesítik. Ennek jelentős szerepe van a foganyag különleges ellenállóképességében.

Rosszul oldódó kalcium-só kiválása nem csak a megfelelő ionos helyekkel rendelkező kollagénen történhet, hanem más lágy kötőszöveteken is, melyeken, oxidáció révén az életkor előrehaladtával ionos csoportok alakulhatnak ki. Ezek kalcifikációs helyekként viselkedhetnek és nem kívánatos meszesedési, vagy kőképződési folyamatok játszódhatnak le az élő szervezetekben.

5.5.2. A kalcium-karbonát, mint héjképző anyag

A tojáshéj, vagy a tengerben a kagylók héjának a képződésében is megfelelő szerves mátrixanyagra van szükség, amely itt Ser-OH csoportokat tartalmazó fehérje. Ezen, mint templáton történik a kalcit mikrokristályok kiválása. Jelentős mennyiségű szénsav anhidráz enzim (12.1. fejezet) is jelen van, hogy a HCO3-ra túltelített oldatot alakítson ki a héj gyors növekedését téve lehetővé. A mineralizáció során az oldhatatlan szerves mátrix felületén a Ca2+ és a HCO3 ionokból CaCO3 kiválásával megy végbe, H+ ionok felszabadulásával, amit NH3 köt meg. Az NH4+ ionokat pedig a mátrix, szulfátban gazdag poliszacharid komponense köti meg. A növekedést a sejtek az NH3 felszabadítás szabályozásával érik el.

A tengeri élőlények MgCO3 tartalmú CaCO3-ot választanak ki fotoszintetikus aktivitásuk révén. Amikor a vízben oldott CO2 fotoszintetikusan asszimilálódik, a környezet pH-ja nő, és az 5.2. reakcióegyenlet értelmében nő a karbonát-tartalma is, ami a CaCO3 kiválását fokozza. A MgCO3 oldhatósága kicsivel jobb, így a kivált szilárd anyag a kalcit vagy aragonit, ami MgCO3-tal csak kis mértékben szennyezett.

5.5.3. Amorf kovasav/szilícium-dioxid

Bár a szilícium, a szilikátok és a szilícium-dioxid formájában a földkéreg második legelterjedtebb eleme, szerepe a bioszférában csak csekély. Ez elsősorban a kovasav (H4SiO4) és a polimer kondenzációs termékei kis oldhatóságának a következménye, ami fémionok (mint a Ca2+, Al3+, Fe3+) jelenlétében még tovább csökken. Így a tengervízben való oldhatósága csak 5 ppm. A bioszférában az oldott kovasav felszívódik, majd újra polimerizálódik és különféle szilárd szerkezeteket alakít ki. Az amorf kovasav elsősorban egysejtűekben fordul elő, és a szerinben gazdag sejtmembránhoz kötődve épül be a sejtfalba. A felhalmozott szilícium-dioxid egyértelműen védelmi funkciót lát el.

5.7. ábra A szilikát megkötése a kovamoszatban (forrás: Gergely P., Erdődi F. Vereb Gy., Általános és bioszervetlen kémia, Semmelweis Kiadó, Budapest, 1992).

Amorf kovasav lerakódások találhatók bizonyos magasabbrendű növényekben is. Megtalálhatók egyes szúrós vagy csípős növények membránjában, így például a csalánszőrök is amorf kovasavból állnak. A polikondenzálódott kovasav törékenysége és felületi tulajdonságai révén veszélyesek lehetnek az emberi szervezetre, hasonlóan az azbeszt ásvány szemcséihez rákkeltő tulajdonságúak.

5.5.4. A vas bioásványok

A ferritinben előforduló, alapjaiban kondenzációs Fe(III)-hidroxid lerakódás mellett biogén vasoxid, mint magnetit is előfordul. Ez a Fe(II)/Fe(III) vegyes oxid az elég elterjedt mágneses baktériumok, kitonok, molluscok, egyes halak és rákok alkotója. A mágneses baktériumok képesek a Föld mágneses mezejének irányába beállni és így mintegy biomágneses iránytűként szolgálni.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Sorolja fel a fémionok felszívódását befolyásoló főbb tényezőket! Milyen különbségeket említene a vas és cink felvételét meghatárözó folyamatokban?

- Hasonlítsa össze a transzferrin és ferritin szerkezeti jellemzőit! Mivel magyarázza a különbségeket?

- Hasonlítsa össze a vas és réz tárolását/szállítását megvalósító mechanizmusokat! Értelmezze a különbségeket!

- Milyen fontos szerkezeti jellemzőket emelne ki a metallothioneinek esetén?

- Milyen összefüggéseket lát a metallothioneinek kémiai jellemzői és biológiai funkciói között?

- Mely elemek és milyen vegyületek formájában vesznek részt a vázképzésben?

- Mit nevezünk biomineralizációnak?

- A fent szöveg alapján magyarázza meg, hogy

- miért káros a fogakra és a csontokra a nagyon sok savas üdítőital fogyasztása?

- miért lehet veszélyes a tengerekben élő csigák, kagylók számára, ha a tengervíz oldott szén-dioxid tartalma jelentősen megnő?

Chapter 6. 6. EGYENLŐTLEN ELEKTROLITMEGOSZLÁS: AZ ALKÁLI- ÉS ALKÁLIFÖLDFÉM-KATIONOK FUNKCIÓJA ÉS TRANSZPORTJA

Kulcsszavak: koronaéterek, makrociklus, fémionszelektivitás, membrántranszport folyamatok, passzív transzport, aktív transzport, inger, akciós potenciál, izom felépítése, izomösszehúzódás

Az élővilágban teljesen általános jelenség, hogy a sejten belül a K+- és Mg2+ionok, míg a sejteken kívül a Na+-, Ca2+-, Cl- és HCO3-ionok koncentrációja a nagyobb (6.1. táblázat). A HPO42 /H2PO4 ionok koncentrációja kb. azonos a sejtmembrán két oldalán.

6.1. táblázat: Az emlősök átlagos ionkoncentrációja a sejten belül és kívül mM-ban megadva (a Mg2+- és Ca2+-ionok esetén csak a szabad ionok koncentrációja szerepel, ui. a sejtekben kb. 20 mM Mg2+ és 1-2 mM Ca2+ kötött formában is jelen van).

A Na+-, K+- és Cl-ionok sejten belüli és kívüli koncentrációja több mint tízszeres eltérést mutat, ugyanakkor a Ca2+ esetén ez 4 nagyságrend. Ez a gradiens csak jelentős energia-befektetés révén valósítható meg. Az átlagos sejtek teljes energiaigényük kb. harmadát, az emlősök idegsejtjei annak kétharmadát, fordítják a koncentrációkülönbség fenntartására.

Az alkálifémionok viszonylag nagyméretűek, felületi töltéssűrűségük kicsi (6.2. táblázat), így az esetek döntő többségében nem alakítanak ki erős (koordinatív) kölcsönhatást a bioligandumokkal. Emiatt a biológiai rendszerekben szinte kizárólag szabad (hidratált) formában fordulnak elő, így mozgásukat alapvetően csak a diffúzió korlátozza. Ezért a hidrogénion után az élő szervezet legmozgékonyabb kationjai. Ugyanakkor az élő szervezetben nagy mennyiségben állnak rendelkezésre, fiziológiás körülmények között (pH ~ 7,4) koncentrációjuk több mint hat nagyságrenddel nagyobb, mint a hidrogénioné. Mindezek számos létfontosságú funkció ellátására teszik alkalmassá az alkálifémionokat, valamint a hasonlóan nagy koncentrációban jelenlévő, és gyenge komplexképző sajátságú kloridiont.

6.2. táblázat: Néhány alkáli- és alkáliföldfém-kation jellemző fizikai-kémiai sajátságai.

A Mg2+- és Ca2+-ionok fizikai és kémiai sajátságai eltérnek az alkálifémionokétól (6.2. táblázat), de egymástól is különböznek. A Mg2+ kisebb, szinte kizárólag szabályos oktaéderes környezetben található, vízmolekulák, ill. negatív töltésű O-donorok által körülvéve. A Ca2+ nagyobb, általában szabálytalan, nagy koordinációs számú környezetben található, és határozott készséget mutat semleges O-donorokkal való kölcsönhatás kialakítására is.

Minthogy a Ca2+-ion a biomolekulákkal közepesen erős kölcsönhatást alakít ki, az alkálifém-ionoknál kisebb mozgékonysággal bír biológiai rendszerekben, de a létfontosságú kétértékű fémionok között így is a legmozgékonyabb. A Mg2+ koordinációs kötései hasonló erősségűek, azonban reakciói kb. 3 nagyságrenddel lassabbak, mint a Ca2+-ioné (l. a vízcsere sebességet a 6.2. táblázatban).

6.1. A Na+-, K+-, Ca2+- és Mg2+-ionok szelektív felismerése

Az alkáli- és alkáliföldfémionok között meglévő koordinációs kémiai eltérések azt eredményezik, hogy utóbbiak sokkal stabilisabb komplexeket képeznek pl. a többfogú, negatív töltésű donorcsoportokat (pl. karboxilát) tartalmazó ligandumokkal. A Mg2+-ion kicsi, s csak a szabályos oktaéderes környezetet részesíti előnyben, míg a Ca2+ nagyobb és könnyen alakít ki szabálytalan, fluktuáló koordinációs szférát, akár hat-nyolc donoratom részvételével is. Ez az eltérés akár 4-5 nagyságrend stabilitás különbséget is eredményezhet egy adott kötőhely (ligandum) esetén, ami már teljes szelektivitást tesz lehetővé.

A Na+ és K+ azonban még az imént tárgyalt két fémionnál is nagyobb hasonlóságot mutat. Sokáig úgy tartották, hogy nem képesek koordinációs kémiai kötés kialakítására. A 60-as évek végén ismerték fel, hogy az ún. koronaéterek (6.1. ábra) az alkálifémionok erős és szelektív megkötésére képesek (C.J. Pedersen, Nobel-díj 1987-ben).

6.1. ábra: Az alkálifémionok szelektív megkötésére alkalmas koronaéterek (felső sor), ill. kriptandok (alsó sor). Zárójelben az előnyben részesített fémion.

Ezek a konformációjukat könnyen változtató (flexibilis) makrociklusos poliéterek különböző méretű háromdimenziós „üregek” kialakítására képesek. A kialakuló üreg mérete határozza meg, hogy melyik alkálifémionnal alakítja ki a legstabilabb komplex vegyületet (6.2. ábra).

6.2. ábra: A [12]korona-4 molekula és Li+ komplexének szerkezete.

Néhány évvel később J. M. Lehn (Nobel-díj 1987-ben) állított elő olyan makrobiciklusos polidentát ligandumokat (kriptándok, 6.1. ábra), melyek a koronaétereknél is erősebben képesek megkötni az alkálifémionokat. A nagyobb stabilitást, s így a nagyobb szelektivitást, a kriptándok speciális szerkezete eredményezi, amely a konformáció jelentősebb megváltoztatása nélkül képes teljesen körül ölelni a fémionokat. A [2,2,2]kriptand vegyület szelektivitását szemlélteti alkálifémionokra a 6.3. ábra. A vegyületek szelektivitása különböző szubsztituensek beépítésével tovább növelhető.

6.3. ábra: A [2,2,2]kriptánd alkálifémionokkal alkotott komplexének stabilitása.

A gombákból, ill. zuzmókból izolálható ciklikus oligopeptid, a valinomicin (6.4. ábra), sok hasonlóságot mutat a koronaéterekkel. Azokhoz hasonlóan ciklikus vegyület és a semleges oxigén-donoratomok ez esetben is egy fémion, a káliumion megkötésére alkalmas üreget alakítanak ki. A káliumionnal (6.4. ábra). alkotott komplex stabilitási állandója ~ 17000-szer nagyobb, mint az analóg nátrium-komplexszé. A valonimicin a gombák és zuzmók védekező anyaga, természetes antibiotikuma, ami felborítja a gazdanövényre káros baktériumok ionháztartását, így a baktériumok elpusztulnak, anélkül hogy maga a gazdanövény károsodna (ld. 6.2. fejezet).

6.4. ábra: A valinomicin és kálium-komplexének szerkezete.

6.2. Membrántranszport folyamatok, ionpumpák

A membránok elhatárolják a sejtet környezetétől, valamint a sejtalkotókat (mitokondrium, lizoszóma, Golgi-test stb.) a citoplazmától. A membrán korlátozott permeábilitása lehetőséget teremt arra, hogy az egyes anyagok membránon belüli és kívüli koncentrációja eltérhessen egymástól. A membrán alapszerkezetét az ún. membránlipidek kettősrétege alkotja, ebbe membránfehérjék ékelődnek be, melyek gyakran átnyúlnak a membrán mindkét oldalára (6.5. ábra).

6.5. ábra: A sejtmembrán sematikus szerkezete.

A sejtek, ill. a sejtalkotók működéséhez azonban jelentős anyagáram (ionok, tápanyagok, metabolitikumok) kapcsolódik, melynek membránon keresztüli transzportját többnyire magas fokon szabályozott működésű, specifikus membránfehérjék segítik elő. Kivételt képeznek ez alól az egyszerű apoláris gázok (pl. O2, CO2) és a kifejezetten zsíroldékony, apoláris vegyületek (pl. koleszterin) melyek transzportja az apoláris membránon keresztül a diffúzió törvényei szerint játszódik le. Azonban a poláris vegyületek (pl. monoszaharidok) és főként a töltéssel rendelkező anyagok (pl. aminosavak, fémionok) spontán átjutása a membránon jelentős mértékben gátolt, és igen lassú folyamat, melyek membránon való gyors átjutását ún. transzporterek segítik elő.

Alapvetően két membránon keresztüli szállítási mechanizmust különböztethetünk meg, a passzív, ill. az aktív transzportot, melyek megfelelnek a termodinamikai egyensúly elérését célzó (a koncentrációgradiens irányába mutató), ill. azzal ellentétes anyagáramnak. A passzív transzport történhet ionofórok, csatornaképző, ill. szállító fehérjék segítségével, míg az energia befektetést igénylő aktív transzport kizárólag pumpák (speciális szállító fehérjék) közreműködésével mehet végbe. Ezen folyamatok szemléletes ábrázolása található az alábbi linken:

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/ecb/ecb_images/12_04_passive_active_transport.jpg

Az ionofórok kis molekulatömegű hidrofób molekulák melyek jól oldódnak a membránt alkotó lipidek kettősrétegben, és szelektív módon jelentősen megnövelik annak permeábilitását bizonyos ionok számára. Két típusukat különböztetjük meg, az ún. mobil, ill. a csatornaképző ionofórokat (6.6. ábra). A mobil ionofórok csoportjába tartoznak a vas felvétele kapcsán már említett sziderofórok (3.3.1. fejezet), valamint az előző fejezetben említett, az alkálifémionok szelektív felismerésére képes valinomicin is (6.3. ábra). Ezek közös sajátsága, hogy szelektíven megkötik, s egy hidrofób burokba zárják a töltéssel rendelkező vagy erősen poláros szállítandó anyagot, amely így könnyen átjuthat a hidrofób membrán kettősrétegén.

6.6. ábra: A mobil és csatornaképző ionofórok működésének sematikus rajza.

A csatornaképző ionofórokra példa a gramicidin A, ami két helikálisan összefonódó dodekapeptidből épül fel (6.7. ábra). Ezt a szerkezetet kívül apoláris oldalláncok veszik körül, míg belül egy poláris csatorna alakul ki. Ha két ilyen helikális dimer összekapcsolódik, akkor az így kialakuló csatorna hossza kb. azonos lesz a membrán vastagságával. E csatorna belső átmérője akkora, hogy a Na+- és K+-ionok könnyen, és mivel a folyamatot csak a diffúzió szabályozza, rendkívül gyorsan áthaladhatnak rajta, kiegyenlítve ezzel a membrán két oldala között fennálló koncentráció különbséget. Ugyanakkor a Ca2+-ion, amely erősebb kölcsönhatást alakít ki a csatorna belső falán található karboniloxigénekkel, blokkolja annak működését.

6.7. ábra: A membránon átnyúló gramicidin A dimer oldal és felül nézetben.

Mind a gramicidin A, mind az előző fejezetben említett valinomicin természetes antibiotikum, amely felborítja a gazdanövényt károsító baktérium Na+ és K+ háztartását, s így elpusztítja azt. Mindkét vegyületet hasonló célokra használja a humán gyógyászat is.

A csatornaképző fehérjék hasonló elven működnek, mint a gramicidin A, azonban azzal ellentétben, rendkívül szelektívek és a folyamat bonyolult szabályzását teszik lehetővé, így jóval nagyobb méretűek is. A szelektív ioncsatornákat a lipidmembránba beékelődött integráns membránfehérjék alakítják ki, oly módon, hogy a fehérjelánc több szakasza is átnyúlik a membránon, melyeket a membránon kívül elhelyezkedő hurkok kötnek össze. Az egymáshoz képest rendezetten elhelyezkedő transzmembrán szakaszok alakítják ki a membránon átnyúló csatornát (6.8. ábra). A csatornák szelektivitását alapvetően annak belső mérete biztosítja. Az ionátmérő okozta különbségeket tovább differenciálja a töltés nagysága, hiszen a töltés/ionsugár hányadosa határozza meg a hidratáció mértékét (minél nagyobb ez a hányados annál több és erősebben kötődő vízmolekula veszi körül a fémiont).

6.8. ábra: A K-csatorna felülnézetben (a), oldalnézetben (b), ill. egyetlen alegységének szerkezete (c).

Ez a viszonylag egyszerű szabályozás meglepően jó hatásfokkal működik. Az anionok, ill. kationok megkülönböztetésére a csatorna nyílásánál elhelyezkedő töltéssel bíró csoportok és az adott ion között elektrosztatikus kölcsönhatások kiválóan alkalmasak. E csatornák általában zárva vannak, a bemeneti nyílást a fehérje egy részlete elzárja. A csatornák megnyílása valamilyen inger hatására bekövetkező konformáció változás következménye. Aszerint, hogy milyen ez az inger beszélhetünk feszültségfüggő vagy receptorfüggő ioncsatornákról. Az előbbi esetben a membránpotenciál megváltozása, utóbbiaknál a megfelelő anyagnak a receptoron való megkötődése idézi elő a konformáció változást, s így a csatorna megnyílását. A receptoron megkötődő anyag is többféle lehet. Ismeretesek többek között fémionokra (pl. Ca2+) vagy neurotranszmitterekre (pl. acetilkolin) specifikus receptorok.

Az eddig tárgyalt mechanizmusok csak a termodinamikai egyensúly irányába mutató ionvándorlást (passzív transzport) tették lehetővé. A koncentráció gradiens ellenében végzett iontranszport (aktív transzport) csak specifikus szállító fehérjék (pumpák) segítségével történhet. Ezeket csoportosíthatjuk pl. a folyamathoz szükséges energia forrása alapján.

  • ATP által elősegített transzport, amikor az ATP hidrolízise fedezi a szükséges energiát (ATPázok),

  • csatolt transzport (másodlagos aktív transzport), amikor pl. a sejtmembrán két oldala között meglévő valamilyen (legtöbbször Na+) ionra vonatkozó koncentráció gradiensben tárolt energia fedezi a kérdéses anyag szállításának energiaszükségletét. Ilyen csatolt transzfer segítségével jutnak a sejtbe a monoszaharidok, aminosavak és több neurotranszmitter, de ismeretesek ilyen módon működő H+- és Ca2+-pumpák is.

Példaként tekintsük a minden állati szervezetben megtalálható Na+-K+ ATPáz működését, melynek egy ciklusa során 3 Na+-ion kerül a sejten kívüli térbe, ahonnan két K+-ion jut a sejt belsejébe. Mindkét ion szállítása a koncentráció gradiens ellenében történik, aminek energiaigényét egy ATP molekula hidrolízise fedezi (6.9. ábra).

  • A fehérjének a membrán belső oldalán elhelyezkedő része három Na+-iont köt meg, aminek hatására a fehérje egy karboxilátcsoportja, egy ATP molekula hidrolízisével egyidejűleg, foszforilálódik (foszforil-transzfer). Ennek következményeként a fehérje jelentős konformációváltozást szenved. E szerkezeti változás hatására

  • a fehérje már nem képes a Na+-ionok szelektív megkötésére, azok disszociálnak róla

  • elzáródik a sejtplazma irányába vezető út, így a Na+-ionok csak a sejten kívüli térbe juthatnak

  • a fehérjének ebben a konformációs állapotában két K+-ionokra szelektív kötőhely alakul ki.

  • A sejten kívüli térből K+-ionok kötődnek meg, ami megindítja a karboxilátcsoport defoszforilációját. Ennek hatására visszaalakul az eredeti konformáció, azaz újra Na+-szelektív kötőhelyek alakulnak ki, lezáródik a külső térbe vezető út, a fehérjéről disszociált K+-ionok csak a sejtplazma irányába tudnak távozni.

6.9. ábra. A Na+-K+ ATPáz sematikus működése.

6.3. A Na+-, K+-, Ca2+- és Mg2+-ionok biológiai szerepe

  • A megfelelő ozmotikus nyomás biztosítása, amely alapvető a sejt, ill. a sejtalkotók fizikai stabilitása szempontjából.

  • Töltéskompenzáció és szerkezet stabilizálás. A sejtekben található biológiai (makro)molekulák jó része negatív töltésű csoportokkal rendelkezik (foszfát, karboxilát, szulfonát), melyeknek töltéskompenzációja, az elektroneutralitás szempontjából, elengedhetetlen. Másrészt a polielektrolitként kezelhető makromolekulák (fehérjék, DNS, RNS, poliszaharidok), ill. sejtalkotók (pl. foszfolipid membrán) ellenionjaiként, azok szerkezetének stabilizálásában is részt vesznek.

  • A sejtek közötti információáramlás (ingerületvezetés). A biológiai szabályozás egyik legalapvetőbb formája az elektrolitikus ingerületvezetés. A sejten belüli funkciók szabályozása, sőt magasabb rendű szervezetekben az egyes sejtek, ill. szervek közötti kommunikáció is történhet ún. ionáramok révén (a későbbiekben erről még részletesen beszélni fogunk)

6.3.1. Az ingerület terjedése

A központi idegrendszer és az egyes szervek közötti információátvitelt biztosító idegsejtek alapvető feladata az, hogy jeleket (ingereket) fogadjanak, azt hosszú axonjain keresztül vezessék, majd egy másik idegsejtnek továbbadják. Az idegsejten belül az ingerület elektromos jel formájában halad tovább, az idegsejtek közötti jelátadás kémiai ingerületátvitel formájában valósul meg (6.10. ábra)

6.10. ábra: Az akciós potenciál kialakulásának fázisai.

Az idegsejt nyugalmi állapotában a sejtmembrán két oldala között, a korábban említetteknek megfelelően, koncentráció gradiens áll fenn számos ionra vonatkozóan. Ennek ellenére a membrán minden ion számára szinte átjárhatatlan (a megfelelő csatornák zárt állásban vannak), kivéve a K+ és Cl--iont, ui. néhány e két ionra szelektív csatorna állandóan nyitva van. A membrán két oldala között fennálló koncentráció gradiensük mégis megmarad.

  • Egyensúlyi állapotban a membrán két oldalán kismértékben eltér a pozitív és negatív töltésű ionok száma (a sejten belül több a negatív töltés), s ez eredményezi a membrán két oldala között mérhető potenciálkülönbséget, az ún. membránpotenciált. Minthogy a K+-ionok számára átjárható a membrán, a nyugalmi állapotban a membránpotenciál közel van a K+ egyensúlyi potenciáljához (Emembrán ~ (RT/F)ln([K+]külső/[K+]belső) ~  70 mV).

  • Az ingerület vezetését, azaz akciós potenciálnak az axonon való tova terjedését, az idegsejt membránjában lévő feszültségfüggő Na+ és K+-csatornák működése teszi lehetővé. A kémiai, mechanikai, fény, hang stb. inger hatására a membránpotenciál kismértékben megnő, azaz csökken a membrán két oldala közötti potenciálkülönbség.

  • Ennek hatására megnyílik néhány feszültségfüggő Na+-csatorna, s megindul a Na+-ionok beáramlása a sejt belsejébe A beáramló pozitív töltések hatására a membránpotenciál tovább nő (depolarizáció), ami újabb feszültségfüggő Na+-csatornák megnyílását eredményezi.

  • Ez az öngerjesztő folyamat kb. fél ms-ig tart, s ez alatt az idő alatt a membránpotenciál lokális értéke megközelíti a Na+-ionra vonatkozó egyensúlyi potenciált (Emembrán ~ (RT/F)ln([Na+]külső/[Na+]belső) ~ 50 mV), azaz immár a sejt belsejében lesz több a pozitív töltés.

  • Amikor a membránpotenciál pozitív értéket vesz fel (Emembrán > 0 mV), beindul az eredeti állapot visszaállítását célzó mechanizmus. Elsőként számos feszültségfüggő K+-csatorna kinyílik, melyek révén a sejten belül kialakult pozitív töltéstöbblet kiáramlik. Majd spontán inaktiválódnak a Na+-csatornák. Ezután már csak a K+-csatornák maradnak nyitva, melyeken keresztül a sejten belüli pozitív töltéstöbblet kiáramlik.

  • Ennek következtében a membrán külső oldalán lokális pozitív töltéstöbblet alakul ki (túltöltődés), de ez az állapot a K+-ionok gyors diffúziója miatt csak igen rövid ideig tart.

  • A folyamat befejezéseként (~ 2 ms-mal az inger után), az inaktiválódott Na+-csatorna visszanyeri eredeti zárt állását, s így alkalmassá válik egy újabb akciós potenciál elindítására.

  • A fent leírt folyamat, azaz a membrán belső falának egy pillanatig tartó lokális áttöltődése (depolarizációja) aktiválja a sejtmembrán szomszédos részeinek Na+-csatornáit, ami egy az előzőhöz hasonló akciós potenciál kialakulását indítja el, s így az ingerület tovaterjedhet az axon mentén, amely akár 1 m hosszú is lehet.

Amikor ez a jelhullám az axon végéhez, az ún. szinapszishoz ér, a membrán depolarizációjának hatására a feszültségfüggő Ca2+-csatornákon keresztül Ca2+-ionok áramlanak a szinapszisba, aminek következtében ún. neurotranszmitter molekulák (pl. acetil-kolin) szabadulnak fel. Ezek keresztülhaladnak a két idegsejtet elválasztó ún. szinaptikus résen, s hatására (kémiai ingerlés) újabb akciós potenciál indul meg de most már a szomszédos axon mentén. Ezután a neurotranszmitter rövid idő alatt elbomlik és megszűnik a ingerlés. A fent leírt mechanizmus révén az ingerület igen gyorsan, akár 100 m/s-mal (360 km/h) is képes terjedni.

Érdemes megjegyezni, hogy az idegsejtek feszültségfüggő Na+-csatornáinak gátlása révén működnek az ún. helyi érzéstelenítők (pl. a lidokain).

6.3.2. Az izomműködés

Az izomműködés energiaigényes folyamat, s tulajdonképpen a kémiai energiának mechanikai energiává történő átalakítását jelenti. A magasabb rendű állatok koordinált mozgását sok-sok elemi izom-összehúzódás, az izomrostok két alkotójának (vastag és vékony filamentum) egymáshoz viszonyított elmozdulása eredményezi.

Az izomrost több sejt összeolvadásából létrejött szerkezeti egység. Belsejében ún. miofibrillumok találhatóak, melyek közötti teret a szarkoplazma tölti ki (6.11. ábra).

6.11. ábra: Az izom felépítése.

A miofibrillumokat az ún. vastag és vékony filamentumok építenek fel. A vékony filamentum három fehérje alegységből áll, az aktinból, a tropomiozinból és a troponin komplexből (6.12. ábra). Az aktin egy globuláris fehérje, amely egy gyöngysorszerű kettős hélixszé polimerizálódik. A tropomiozin hélix szerkezete stabilizálja az aktin polimer szerkezetét. A troponin komplex három fehérjéből áll, s az izomműködés Ca2+-ion általi szabályzásában vesz részt. A vastag filamentum miozin nevű fehérjékből épül fel. Egy-egy miozin dimer szerkezetű, két fejrészből s két hosszú, hélix szerkezetet kialakító, farokrészből áll. Ez utóbbi ATPáz aktivitással bír.

6.12. ábra: A vékony filamentum komponensei (a) és kapcsolódása a miozinhoz (b).

6.13. ábra: Az izomműködés vázlatos mechanizmusa.

További ábra: http://qwickstep.com/search/skeletal-muscle-contraction.html?p=9.

  1. Az izomsejt nyugalmi állapotban az aktin és a miozin nincs kapcsolatban egymással. A miozin fejrészéhez ekkor egy Mg2+-ADP adduktum és egy foszfátion kapcsolódik. A miozin és az aktin közötti kapcsolatot az aktinszálhoz kötődő troponin komplex kedvezőtlen konformációja akadályozza meg.

  2. Az idegsejtek által közvetített inger hatására a Ca2+-csatornákon keresztül Ca2+ szabadul fel, s tulajdonképpen ez indítja el az izomrost összehúzódását. A Ca2+-ion megkötődik a troponin komplex egyik összetevőjén (troponin C), s ezzel annak alapvető konformációs változást idéz elő, aminek következtében a foszfátion leszakad a miozin kötőhelyéről és az aktin megkötődik a miozin fejrészén, a Mg2+-ADP adduktumot kötő hely közelében.

  3. A Mg2+-ADP adduktum leszakad a miozin fejrészéről, annak konformációja megváltozik, így az aktin elmozdul a miozinhoz képest.

  4. A Mg2+-ATP kötődik a miozin fejrészéhez. Ezzel egyidejűleg a Ca2+-pumpák hatására a kalcium koncentrációja lecsökken a szarkoplazmában, a troponin C-ről is disszociál, s annak így kialakuló eredeti konformációja újra gátolja a miozin-aktin kölcsönhatást. Végül az ATP a Mg2+ közreműködésével hidrolizál (13. fejezet), a felszabaduló energia a miozin fejrészének konformáció változására fordítódik, amivel a kiindulási állapotba kerül a rendszer.

  5. Gyors izomműködés esetén a kalcium koncentrációjának a jeladás utáni gyors csökkenése, s az ezzel járó relaxáció, igen fontos. Az említett ATP igényes Ca2+-pumpák, azonban, igen gyors mozgásoknál nem mindig elég hatékonyak, ezért számos adat arra utal, hogy egyes izmokban mellettük egy speciális kalcium-kötő fehérje, a parvalbumin is szerepet kap. A parvalbumin mind a kalcium, mind magnézium megkötésére alkalmas, azonban míg magnéziummal közepes erősségű kötést alakít ki, addig a kalciumot rendkívül erősen, a troponin C-nél is erősebben, köti. Minthogy izomsejt nyugalmi állapotában a magnézium koncentrációja jóval nagyobb, mint a kalciumé, a parvalbumin kötőhelyein szinte kizárólag Mg2+ kötődik meg. A kalcium beáramlásakor a kalcium mind a troponin C-vel, mind a parvalbuminnal kölcsönhatásba lép. Azonban a magnézium leszorítása a parvalbuminról jóval lassabb folyamatban játszódik le, mint a Mg2+-iont nem tartalmazó troponin C-n való megkötődés. Ez az időkülönbség ugyan nagyon csekély, kb. 1 ms, azonban elegendő arra, hogy a troponin C-vel kölcsönhatásba kerülve a Ca2+-ion elindítsa az izom-összehúzódást, s ezután a parvalbumin szinte azonnal mintegy elszívja a kalciumot, lehetővé téve ezzel a gyors relaxációt.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Foglalja össze az alkálifém- és alkáliföldfémionok koordinációs sajátságait!

- Sorolja fel, és röviden jellemezze a membránon keresztül való lehetséges transzport folyamatokat!

- Sorolja fel a legfontosabb eltéréseket az aktív és a passzív transzport között!

- Az ingerületvezetés, ill. az izomműködés során mely lépésben történik passzív, ill. aktív transzport folyamat?

- Sorolja fel az akciós potenciál kialakulásának legfontosabb lépéseit!

- Röviden jellemezze az izomrostok két fő felépítő egységét!

- Az izomösszehúzódás során mely lépésekben és hogyan játszik szerepet a kalciumion?

Chapter 7. 7. ELEKTRONSZÁLLÍTÓ FEHÉRJÉK

Kulcsszavak: vas-kén fehérjék, citokrómok, kék réz fehérjék, rubredoxinok, ferredoxinok, HIPIP, (antiferromágneses) spin-spin kölcsönhatás, nagy távolságú elektrontranszfer fehérjék.

Az elektron szállítására, továbbadására képes anyagok lehetőséget teremtenek arra, hogy a biokémiai folyamatok redukciós és oxidációs lépései a térben egymástól elkülönülve játszódjanak le. Biológiai rendszerekben az elektron szállítására szerves molekulák (ún. elektronátvivők, pl. nikotinsavamid-adenin-dinukleotid, NAD+), ill. fehérjék specializálódtak. Utóbbiak négy nagyobb csoportot alkotnak: (i) a flavadoxinok, (ii) a vas-kén fehérjék, (iii) citokrómok, ill. (iv) az 1-es típusú (kék) réz fehérjék. Minthogy a flavadoxinok nem tartalmaznak fémiont (prosztetikus csoportjuk az ún. flavin-mononukleotid), jelen tárgyalásunkban csak az utóbbi három típussal foglalkozunk részletesebben.

7.1. ábra: A mitokondriális légzési lánc sematikus ábrázolása (FMN: flavin mononukleotid, FeS: vas-kén fehérje, Q: ubikinon, Cyt: citokróm, CuA: 1-es típusú (kék) réz fehérje, lásd később).

Az elektron szállításának lényegét jól szemlélteti a 7.1. ábra, amely a mitokondrium belső membránjába ékelődő légzési láncot mutatja be egyszerűsített formában (bővebben lásd a 10. fejezetben). A lánc egyik végén a tápanyagok lebontásakor képződő NADH adja át az általa szállított két elektront (NADH = NAD+ + H+ + 2e), amit a lánc végén a dioxigén molekula vesz fel s víz képződik belőle (1/2 O2 + 2H+ + 2e = H2O). A lánc két vége között számos elektronszállító fehérje vesz részt az elektronok továbbadásában. Bár ezek szerkezete meglehetősen eltérő, rendelkeznek néhány közös sajátsággal, melyeket az elektronszállítás/átadás képességének általános követelményeként adhatunk meg, s melyek megkülönböztetik őket az egyébként nagyon hasonlatos redoxi enzimektől:

  1. a hozzájuk kapcsolódó molekulák (szubsztrátok) nem kis molekulatömegű vegyületek, hanem fehérjék,

  2. koordinációs szférájuk telített, és a működés során változatlan marad,

  3. az oxidációs állapot megváltozása a fém-ligandum kötéstávolságok, ill. az aktív centrum környezetének minimális megváltozásával jár (ellenkező esetben a működés túlságosan nagy aktiválási energiát igényelne),

  4. az előző sajátság teljesülése egyelektronos redoxi átmenetet, viszonylag merev szerkezetet, ill. p-kötés kialakítására képes ligandumokat igényel; utóbbi lehetőséget teremt arra, hogy a fémion effektív töltése ne változzon lényegesen a működés során (az elektronszállító fehérjékben előforduló kén donoratomok, ill. a kiterjedt elektron delokalizációval rendelkező hem-csoport is σ-donor/p-donor tulajdonsággal rendelkezik, így alkalmas az 'elektronhiányos' magasabb oxidációs állapot effektív töltésének csökkentésére).

7.1. A vas-kén fehérjék

A vas-kén fehérjéknek két nagyobb csoportját különböztetjük meg, az aktív centrumukban csak egyetlen vasat tartalmazó rubredoxinokat, ill. a többmagvú, szervetlen szulfidionok részvételével nFe-nS (ahol n az adott ion számát (n = 2,3,4), S a szervetlen szulfidiont jelöli) klasztereket felépítő ferredoxinokat. Utóbbiak több további alcsoportra oszthatóak (ld. 7.1 táblázat). A vas-kén proteinek minden élőlényben megtalálhatóak, meghatározó szerkezeti egységeik az evolúció során szinte alig változtak.

7.1 táblázat: A vas-kén proteinek néhány tipikus képviselője és tulajdonságaik.

7.1.1. A rubredoxinok

A rubredoxinok viszonylag kis fehérjék (6-8 kD), melyek csak bizonyos anaerob baktériumokban fordulnak elő. A központi fémiont, amely +2 és +3 oxidációs állapotában is nagyspinű elektronszerkezettel rendelkezik, négy cisztein tiolát veszi körül enyhén torzult tetraéderes elrendeződésben. Nevét az oxidált forma igen intenzív (rubinvörös) színéről kapta, amely a S2- ? Fe(III) töltésátviteli sáv következménye. A négy cisztein tiolát két egymástól távoli  Cys-X-X-Cys- szekvencia koordinációjából ered (X tetszőleges aminosavegységet jelöl). Ez a szekvencia, aminek rövidsége lehetőséget teremt arra, hogy a két tiolát ugyanazon fémionhoz koordinálódjon, a többi vas-kén fehérjénél is megjelenik. Az Fe-S kötéstávolságot a központi fémion oxidációs állapota nem befolyásolja lényegesen (DrFe-S ~ 0,05 Å). Említésre méltó sajátsága a rubredoxinoknak (és minden vas-kén fehérjének), hogy képesek a vas +3-as oxidációs állapotának stabilizálására. Ez azért meglepő, mert a fehérje speciális szerkezetének hiányában gyors redoxi reakció játszódik le a fémion és liganduma között, ami diszulfidot eredményez:

2 Fe3+ + 2 R-S- = 2 Fe2+ + R-S-S-R.

7.1.2. A [2Fe-2S] ferredoxinok

Mindkét fémion két cisztein tiolát és két szulfidion által alkotott torzult tetraéderes környezetben található, a négy tiolátcsoport itt is két -Cys-X-X-Cys- szekvenciához tartozik. A szulfidionok hidat képeznek a két fémcentrum között, a Fe-Fe távolság ~ 2,7 Å, ami igen jelentős antiferromágneses kölcsönhatást tesz lehetővé a két fémion között. Ennek eredményeképpen a nagyspinű Fe(III)-ionokat tartalmazó oxidált forma eredő spinje zérus, így ESR spektrum nem detektálható ebben az állapotban. A redukált forma egy-egy nagyspinű Fe(II) (S = 2) és Fe(III) (S = 5/2) iont tartalmaz. Ezek szintén erős antiferromágneses kölcsönhatásban állnak, minek következtében az eredő spin 1/2, azaz a redukált forma ESR aktív. A páratlan elektron mindkét fémion környezetében előfordulhat, azonban a két fémion közötti elektroncsere sebessége viszonylag lassú (az ESR spektrumokról bővebb információ a Melléklet 2.3.1. fejezetében található).

Ebbe a csoportba tartozik a vas-kén proteinek között unikumnak számító Rieske-centrum is, amelyben az egyik fémionhoz két tiolát helyett két imidazolgyűrű koordinálódik (7.1 táblázat). A két semleges ligandum jelenléte jelentős redoxipotenciál növekedést eredményez (a redukált forma stabilabb), és szemben a normális [2Fe-2S] klaszterekkel, az oxidációs állapot megváltozása csak az egyik, az imidazolok által koordinált, fémionhoz rendelhető. Az imidazolgyűrűk koordinációja miatt a redoxipotenciálja erősen pH-függő, így elképzelhető, hogy szerepet játszik az elektron-, ill. protontranszport folyamatok összekapcsolásában. A Rieske-centrum a mitokondriális légzési lánc, ill. a fotoszintézis elektronszállító rendszerében található meg.

7.1.3. A [4Fe-4S] ferredoxinok

A legstabilabb, s az élővilágban legáltalánosabban elterjedt vas-kén fehérjék tartoznak ebbe a csoportba. A négy fémion egy torzult tetraéder négy csúcsán helyezkedik el, hasonlóan a közöttük hidat képező szulfidionokhoz. Emiatt a nyolcatomos klaszter köbös szerkezetet vesz fel, amelynek csúcsait felváltva szulfid-, ill. Fe(II)/Fe(III)-ionok foglalják el (7.1 táblázat). Az így kialakuló kocka erősen torzult, amit jól példáz, hogy a vas-vas, ill. kén-kén atomok közötti távolság (a lapátlók) ~ 2,7, ill. ~ 3,5 Å. A fémionok koordinációs szféráját egy-egy cisztein tiolát csoportja egészíti ki tetraéderessé, egyúttal ezek a kötések rögzítik a vas-kén klasztert a fehérjéhez. Ez a szerkezet, benne a σ-donor/p-donor sajátságú szulfidionokkal, kiválóan alkalmas arra, hogy tompítsa az oxidációs állapot megváltozásával járó geometriai torzulásokat.

A [4Fe-4S] ferredoxinok redoxipotenciáljuk alapján két, markánsan különböző csoportra oszthatóak, az ún. 'normál' és a HIPIP (HIgh Potential Iron-sulfur Protein) ferredoxinokra. Előbbiek negatív, utóbbiak pozitív redoxipotenciállal rendelkeznek (7.1 táblázat). Az eltérés oka az oxidált (ill. redukált) formák különbözősége. Mint az a 7.1 táblázatból kiolvasható, a normál ferredoxinok oxidált formája 2-2 Fe(II), ill. Fe(III)-iont tartalmaz, csakúgy mint a HIPIP fehérjék redukált állapota (azaz a [4Fe-4S] ferredoxinok három különböző oxidációs állapotban is megtalálhatóak a biológiai rendszerekben). A klaszterek elektronszerkezete, az igen részletes ESR, ill. Mössbauer spektroszkópiai vizsgálatoknak köszönhetően, ma már tisztázott. A köztes állapot (oxidált normál ferredoxin, ill. redukált HIPIP) legjobban két antiferromágnesesen csatolt Fe(II)-Fe(III) pár dimerjeként írható le. Az egyes párok eredő spinje 1/2, hasonlóan a [2Fe-2S] ferredoxinok redukált formájához. Ugyanakkor, utóbbiaktól eltérően a Fe(II)-Fe(III) párokon belül az elektroncsere rendkívül gyors, ezért a kísérleti módszerek (pl. Mössbauer spektroszkópia) átlagos +2,5-es oxidációs állapotú fémionok jelenlétére utalnak. A két 1/2-es spinű dimer szintén antiferromágneses kölcsönhatásban áll egymással, így maga a klaszter diamágneses (ESR inaktív). A redukált normál ferredoxin formálisan három Fe(II) és egy Fe(III)-iont tartalmaz. Azonban hasonlóan az előzőekhez, a klaszter elektronszerkezete helyesebben írható le egy Fe2+-Fe2+ és egy Fe2,5+-Fe2,5+ pár dimerjeként. A párokon belül, ill. azok között most is erős antiferromágneses kölcsönhatás alakul ki, így a klaszter eredő spinje 1/2, azaz ez a forma ESR aktív. E tekintetben hasonlóan viselkedik a HIPIP oxidált formája, de itt spektroszkópiai eredmények szerint egy Fe3+-Fe3+ és egy Fe2,5+-Fe2,5+ pár dimerje van jelen.

Logikus a kérdés, hogy vajon mi eredményezi az egyébként nagyon hasonló rendszerek ilyen látványos eltérését. A klaszterhez kapcsolódó ciszteinek a peptidláncban való elhelyezkedése különböző, ami eltérő konformációs sajátságokat kölcsönöz a fehérjének; különbözik a klaszter egészének töltése, és eltérőek lehetnek a peptidláncban elhelyezkedő funkciós csoportoknak a klaszter kénatomjaival kialakított hidrogén-hidas kötései is. Ezek az első látásra csekély eltérések jól példázzák, hogy a fémion közvetlen koordinációs szférája mellett az aktív centrum környezete is mennyire meghatározó lehet a fizikai-kémiai sajátságokat illetően. Ugyanakkor valószínűvé teszi azt az elképzelést, hogy az aktív centrum konformációjának csekély megváltozása is 300-400 mV-al képes eltolni az azonos típusba sorolható vas-kén fehérjék redoxipotenciálját (ld. 7.1 táblázat). A későbbiekben látni fogjuk, hogy ez az 'érzékenység' általános tulajdonsága az elektronszállító fehérjéknek.

7.2. A citokrómok

A vasat tartalmazó elektronszállító fehérjék másik nagy csoportját a citokrómok alkotják. Már elöljáróban meg kell jegyezni, hogy a citokrómok nem csak az elektronszállításban vesznek részt, nagyszámú enzim, ill. az oxigén szállításáért felelős hemoglobin is ebbe a csoportba tartozik (ld. 9, 10. fejezet), közös sajátságuk, hogy hem (vas + porfirin gyűrű) prosztetikus csoportot tartalmaznak. Nevüket rendkívül intenzív színükről kapták, ami a 400-450 nm közötti tartományban található fényelnyelésük (Soret-sáv) következménye. Ma több mint 50 különböző elektronszállító citokrómot ismerünk. A fémion oxidációs állapota +2 és +3 lehet, így egy hem csoport egyetlen elektron továbbítására képes. A citokrómok többségében csak egy hem csoport van, bár ismeretesek olyanok is melyek többet tartalmaznak (pl. a citokróm c 3 fehérjében 4 hem csoport található). A citokrómok csoportosítása a hem típusa alapján történik (7.2. ábra). Eszerint beszélhetünk citokróm a fehérjékről, melyek a típusú hemet tartalmaznak, és a citokróm c oxidáz alegységei (ld. 10. fejezet). A két legelterjedtebb csoportot a citokróm b és c fehérjék alkotják. Elektronszállító fehérjék mindhárom csoport tagjai között megtalálhatóak. A citokróm a és b fehérjék esetén a hem csoport erősen, de nem kovalens kötéssel kapcsolódik a fehérjéhez. Ugyanakkor a hem tioéter kötéssel kapcsolódik a citokróm c fehérjékhez (7.2. ábra). A hem típusa, ill. a fehérje szerkezete alapvetően meghatározza a fehérje redoxipotenciálját, de jelentős hatása van az axiálisan koordinálódó ligandumok minőségének is. Ez az esetek döntő többségében vagy két hisztidin imidazolgyűrűje, vagy egy-egy imidazolgyűrű és metioin tioétercsoport lehet (7.2 táblázat).

7.2. ábra: Egy citokróm c protein vázlatos szerkezete (alul), ill. a hem gyűrű három típusa (felül, az áttekinthetőség kedvéért az axiális ligandumok hiányoznak az ábrákról).

7.2 táblázat: Az elektronszállító citokrómok néhány típusa.

Ritkán egyéb donorcsoportok is koordinálódhatnak a citokrómok axiális pozícióiban, a citokróm f fehérjékben pl. egy amino- és egy imidazolcsoport található.

A legtöbb ismeret a citokróm c fehérjékről áll rendelkezésre, melyek többsége viszonylag kis méretű (~ 12 kD). Az különböző fejlettségi szintű szervezetekből izolált azonos funkciójú citokróm c-k aminosav sorrendje, de még negyedleges szerkezete (7.2. ábra) is csak kismértékben különbözik, ami arra utal, hogy a citokróm c magas szinten optimalizált, evolúciós szempontból 'öreg' fehérje.

7.3. Az 1-es típusú, ún. kék réz fehérjék

Az elektronszállító fehérjék harmadik nagyobb csoportját az ún. kék réz fehérjék alkotják. Az elektron átadására a Cu(I)/Cu(II) redoxpár ad lehetőséget, tehát ez esetben is csak egyetlen elektron átadására van lehetőség. Az elnevezés az oxidált forma mélykék színéből ered. Ugyan a fényelnyelés maximuma 600 nm körül van, mint sok más Cu(II)-komplex d-d átmenetének, azonban a szokásosnál kb. százszor intenzívebb. Bár sokáig vitatták, ma már egyértelműnek tűnik, hogy az említett sáv egy tiolát?Cu(II) töltésátmenethez rendelhető. A kék réz fehérjéket négy csoportba sorolhatjuk. Az azurin, a plasztocianin és a sztellacianin fehérjék közös sajátsága, hogy a központi fémion környezete erősen torzult szerkezetű, és három erősen kötődő ekvatoriális ligandum, két imidazolgyűrű és egy tiolátcsoport, közel síkháromszöges geometriát alakít ki a fémion körül. A plasztocianinban ezt egy metionin tioétercsoportja egészíti ki tetraéderessé. Minthogy a Cu-SMet kötéstávolság meglepően nagy (2,9 Å), a tetraéder erősen torzult (7.3 ábra). A néhány ismert sztallacianin esetén a tioétercsoportot egy glutamin oldallánci karbonilcsoportja helyettesíti, de a szerkezet alapvetően hasonló. Az azurinokban az említett síkháromszöges szerkezet torzult trigonális bipiramissá egészül ki egy metionin tioéter- és egy peptidkötés karbonil-oxigénjének koordinációja révén (7.3. ábra). A két axiális donoratomnak a fémiontól mért távolsága (3,1 Å) a határán van annak a tartománynak, amit még kémiai kötésként értelmezhetünk. A fémion oxidációja (ill. redukciója) során az aktív centrum szerkezete gyakorlatilag nem változik, sőt a fehérje konformációja a réz elvonása után sem változik lényegesen. A kék réz fehérjék aktív centruma tehát meglehetősen merev szerkezetű.

A fémion környezetében mutatkozó eltérések természetesen jelentős hatással vannak e fehérjék redoxipotenciáljára. A plasztocianinok redoxipotenciálja 300-400 mV között változik. Az oxigén donoratom megjelenése a Cu(II) állapot valamivel nagyobb stabilitását eredményezi, ami a redoxipotenciál csökkenésében (azurin 200-300 mV, sztellacianin ~ 150 mV) nyilvánul meg. Az oxidált, ill. redukált fémion koordinációs sajátságai meglehetősen eltérőek. A 3d10 elektronszerkezettel rendelkező Cu(I), síkháromszöges vagy tetraéderes környezetben elhelyezkedő 'soft' ligandumokat (pl. kén) részesít előnyben. Ugyanakkor a telítetlen d-héjú (3d9) Cu(II)-nek a síknégyzetes vagy torzult oktaéderes, N,O donorcsoportokat tartalmazó koordinációs szféra a kedvező. A kék réz proteinek donorcsoportjainak erősen torzult elrendeződése olyan, mintha a tetraéderes, ill. a síknégyzetes szerkezetek közötti átmeneti állapotnak felelne meg, azaz a Cu(I) és Cu(II) által előnyben részesített geometriák közötti kompromisszumos megoldás eredménye lenne. Ennek következményeként egyik oxidációs állapot sem képes stabilizálódni, ami lehetővé teszi a gyors elektronátadást. A kék réz fehérjéknek ez az átmeneti állapotnak megfelelő szerkezete jelentős szerepet játszott az entatikus állapot hipotézis kidolgozásában (ld. 4.3 fejezet).

A kék réz fehérjék negyedik típusának szerkezete valamelyest eltér az eddigiektől. Az ún. CuA centrumot tartalmazó fehérje a citokróm c oxidáz egyik alegysége (ld. 10. fejezet), de megtalálható más oxidáz sajátságú fehérjekomplexekben is. A CuA centrum két rezet tartalmaz, erősen torzult tetraéderes környezetben (7.3 ábra). A fémionokhoz két hídként kötődő cisztein tiolát, ill. egy-egy imidazolgyűrű koordinálódik. Az első három csoporthoz hasonlatos, erősen torzult tetraéderes szerkezet egy-egy gyengén kötődő ligandum révén alakul ki. Az egyik fémionhoz egy peptidkötés karbonil-oxigénje, a másikhoz egy metionin tioétercsoportja koordinálódik. A Cu-Cu távolság 2,5 Å. Ez a centrum is csak egyelektronos transzportfolyamatban vesz részt, oxidált formája Cu(I)-Cu(II), amelyben a párosítatlan elektron teljesen delokalizálódik.

7.3. ábra: Néhány kék réz fehérje fémcentrumának koordinációs geometriája (a: plasztocianin, b: azurin, c: a citokróm c oxidáz komplex CuA centruma.

7.4. A nagy távolságú ('long-range') elektrontranszfer és az elektronszállító rendszerek

Az elektrontranszfer folyamatok értelmezésekor számos tényezőt kell figyelembe vennünk, melyek közül a legfontosabb a folyamat hajtóereje, a távolság, amit az elektronnak le kell küzdenie, ill. az oxidációs állapot megváltozásával járó szerkezeti átrendeződéshez szükséges ún. reorganizációs energia. Biológiai szempontból hasznosítható, tehát megfelelően gyors, elektrontranszfer folyamatok esetén a reorganizációs energiának nyilvánvalóan kicsinek kell lennie. A fentebb tárgyalt fehérjék esetén a fémion oxidációs számának megváltozása csak csekély szerkezeti változást eredményez, így ez a feltétel teljesül (ami azonban nem jelenti a szerkezeti átrendeződés teljes hiányát).

Az elektrontranszfer folyamatok hajtóereje a partnereknek, az adott körülmények között (pH, koncentráció, stb.) mérhető, redoxipotenciáljai közötti különbség (DGr = -FDE, ahol F a Faraday állandó). Biológiai rendszerekben DE-nek természetesen határt szab a víz oxidációja, ill. redukciója által meghatározott redoxipotenciál tartomány (pH 7 esetén EH+/H2 = -0.42 V és EO2/H2O = 0,80 V), így DEmax ~ 1,2 V. Ez természetesen csak egy elméleti határ, DE a valóságban ennél mindig sokkal kisebb, hiszen az elektrontranszport folyamatok soklépéses kaszkád-reakción keresztül valósulnak meg (ld. 7.1. ábra). Annak érdekében, hogy az elektrontranszport lánc egy tagja mindig képes legyen tovább adni az elektront, azaz redukálni a lánc következő tagját, az egyes lépések DE értékének kicsinek kell lennie (DE ~ 30-250 mV).

A harmadik, s egyben a legtöbb nehézséget okozó paraméter az a távolság, amit az elektronnak az elektronátadás során meg kell tennie. A biológiai elektronátadás fehérjék között valósul meg. Ráadásul az elektronszállító fehérjék közös sajátsága, hogy az aktív fémion ugyan a felszín közelében, de sohasem a fehérje felszínén található. Ebből az következik, hogy az elektronnak rendkívül nagy, tipikusan 10-20 Å távolságot kell 'átugrania' egy-egy elektrontranszfer lépés során. Ennek mikéntje csak nagy vonalakban ismert, számos részlet még tisztázásra vár. Alapvetően három lehetőség van az elektron vándorlására: a téren keresztül, a kötések mentén, ill. az anyag hullámtermészetét kihasználó ún. kvantummechanikai alagút effektus révén (ld. 4. fejezet). Ebben a sorrendben egyre hatékonyabb (gyorsabb) az elektronok vándorlása. A rendelkezésre álló eredmények alapján valószínűleg mindhárom mechanizmus szerepet játszik az elektronszállításban, de meghatározó, s egyben a vándorlás irányát megszabó, jelentősége van a kötések mentén történő vándorlásnak. A delokalizált elektronfelhővel rendelkező aminosav oldalláncok (triptofán, tirozin stb.) természetesen hatékonyabban 'vezetik' az elektront, de a σ-kötések szerepét sem szabad elhanyagolni. A fehérjén belüli, ill. a fehérje komplexek közötti elektrontranszfer vizsgálatának bevett módja az irányított mutáció. Ekkor azt vizsgálják, hogy egy-egy aminosav alegység cseréje hogyan befolyásolja az elektronátadás sebességét. Számos mutáns tanulmányozásával viszonylag pontos kép kapható az elektron vándorlásának útvonaláról.

Ellenőrző kérdések

- Mi az elektronszállító fehérjék funkciója a biológiai rendszerekben? Milyen elektronszállító fehérjéket ismer?

- Jellemezze a citokrómokat szerkezeti szempontból!

- Hasonlítsa össze a vas-kén proteineket és a citokrómokat szerkezeti sajátságaikat tekintve!

- A vas-kén proteinek milyen kéntartalommal rendelkeznek?

- Mi a jellemzője a réztartalmú elektrontranszfer fehérjéknek?

- A kémiai evolúcióban való keletkezésük szempontjából elemezze a vas-kén fehérjék, a citokrómok és a kékréz fehérjék családját!

Chapter 8. 8. A FOTOSZINTETIKUS EGYSÉG MŰKÖDÉSE, FÉMIONJAI: A MAGNÉZIUM ÉS A MANGÁN

Kulcsszavak: fotoszintézis, klorofill, klorinváz, glükóz, fotokémiai reakcióközpont, fotolízis

A fotoszintézis alatt azon folyamatok összességét értjük, amelynek során élő szervezetek szénhidrátok formájában nagy energiatartalmú vegyületeket szintetizálnak a légkörből származó szén-dioxid redukciója révén, és így a napfény energiája kémiai energiává alakul át. A fotoszintézis során e redukciós lépéssel párhuzamosan a víz dioxigénné való oxidációja is lejátszódik. A fotoszintézis folyamata változtatta át a Föld légkörét oxidáló jellegűvé, ami jelentős mérföldkő volt az evolúció során. Ez a reakció biztosítja áttételesen az összes többi élő szervezet folyamatainak energiaszükségletét.

A fotoszintézis az egyik legnagyobb volumenű biokémiai folyamat a Földön, egy évben kb. 200 milliárd tonna szénhidrát vagy ennek megfelelő vegyület képződik, eközben a Földre eső sugárzás kevesebb, mint 1%-át hasznosul. A reakció a 8.1. bruttó egyenlettel jellemezhető. A szükséges energiát a fény biztosítja. A folyamat két nagy szakaszra osztható.

  • Fényreakciók (víz fotolízise): közvetlenül igénylik a fényenergiát, és az energiatranszformáció útján lehetővé teszik a fotoszintézis két alapvegyületének, az ATP-nek és a NADPH-nak a keletkezését, a 8.2. reakció „mellékterméke” pedig az oxigén

  • Sötét reakciók (CO 2 fixálása): a CO2 redukciója, amely lejátszódásához közvetlenül nincs szükség fényenergiára, a szükséges energiát az ATP és a NADPH biztosítja (8.3. egyenlet).

8.1. A napfény elnyelődése és továbbítása a fotoszintetikus rendszerben

A zöld növényekben a Nap sugárzásának főként a látható hullámhossz-tartományba eső komponensei nyelődnek el a szerves festékanyagok (pigmentek) fényabszorpciója révén. A legismertebbek ezek közül a klorofillek. A klorofill molekula két részből épül fel (8.1. ábra).

  • a fény elnyeléséért a klorofill molekula klorinváza felelős

  • a hosszú szénhidrogénlánc a molekula tilakoid membránba való beágyazodását biztosítja

  • 8.1. ábra: A klorofillok szerkezete.

A klorofill fény hatására gerjesztődik, a váltakozó egyes- és kettős kötéseket tartalmazó kloringyűrű elektronjai nagyobb energiájú állapotba kerülnek. Ebből az állapotból alapvetően háromféle módon kerülhet vissza az alapállapotba a molekula:

  • az energia hővé és fénnyé alakul (fluoreszcencia)

  • elektron nélküli energiaátadás történik a szomszédos klorofill számára (rezonancia energia transzfer)

  • egy elektron átadása történik egy elektronakceptor molekulának (elektrontranszfer), az eredeti állapot visszaállítása pedig egy elektron felvételével valósul meg egy elektrondonor molekulától

  • A viszonylag kis energiájú, látható fénysugárzás hatékony felhasználására akkor van lehetőség, ha nagyon sok foton energiája akkumulálódik. A fény elnyelődése ezért elsőként nagyszámú szerves festékanyag fehérjékkel alkotott komplexeiben valósul meg. Ezekben az ún. molekuláris fénygyűjtő antennakomplexekben klorofillmolekulák százai (a teljes klorofilltartalom ~98%-a) találhatók. A fényenergia abszorpciója az antennakomplexekben nagyon gyors folyamat (10 15 s), és az elnyelt energiát a molekula fluoreszcencia révén gyorsan el is veszítheti. Emiatt a begyűjtött fényenergiát nagyon hatékony módon kell eljuttatni a fotoszintézis reakciócentrumába rezonancia energia transzfer révén. Ehhez a klorofillmolekulák jól meghatározott, szabályos elrendeződésére van szükség a tilakoid membránokban (8.2. és 8.3. ábrák).

8.2. ábra: A pigmentanyagok szerveződése a tilakoid membránban a II. fotoszisztéma monomer antennakomplexeiben (CP43, ill. CP47), és a reakcióközpontban (D1/D2). Az (a) és a (b) ábra különböző irányú nézeteket mutat.

A magnéziumionok egyik nagyon fontos szerepe épp a klorofillmolekulák térbeli elrendezésében van. Ugyanis a pigmentmolekuláknak a membránban pusztán a klorofill fitin oldalláncán keresztül történő rögzítése még meglehetősen nagy flexibilitást eredményezne. A környező fehérjemolekulák oldalláncai viszont a Mg(II)-ion szabad axiális koordinációs helyeire bekötve a festékanyagot teljes mértékben rögzíthetik egy jól meghatározott térbeli helyzetben.

8.3. ábra: A pigmentanyagok szerveződése a tilakoid membránban a fotorendszer I antennakomplexeiben, ill. a reakcióközpontban. Az (a) és a (b) ábra különböző irányú nézeteket mutat.

Az egymáshoz közel elhelyezkedő kromofórok ~ 95%-os hatékonysággal képesek a gerjesztési energiát továbbítani a reakcióközpont felé mintegy 10-100 ps alatt. Az elnyelt fényenergia a fotoszintetikus reakcióközpontokban alakítható át kémiai energiává.

8.2. A fotoszintetikus reakcióközpontok

A fotoszintetikus membránokban a klorofill- és fehérjemolekulák kapcsolódása révén óriási méretú multiprotein komplex jön létre, amit fotorendszernek nevezünk. Itt történik meg a fényenergia begyűjtése és hasznos formába való alakítása. A fényenergiának kémiai energiává való átalakítása a növények sejtjeiben két, egymással kapcsolatban álló reakcióközpontban történik: ez a fotorendszer I. és II. (a továbbiakban PS I és PS II - az angol photosystem I, ill. II. elnevezésből). Az elsődleges fényreakció a fotorendszer II-ben jön létre (a fordított elnevezés a hagyományokból származik). Itt a 680 nm hullámhosszú fény abszorbeálódik, ezért P680-nak is nevezik. Az itt leadott elektronok egy elektronszállító rendszerbe jutnak, amely azokat a fotorendszer I-hez továbbítja. A PS I egy másik, függetlenül gerjeszthető reakcióközpontot tartalmaz, mely a 700 nm hullámhosszú fényt abszorbeálja (P700). Innen az elektronok a következő szállító rendszer közvetítésével a NADP+-molekulára tevődnek át, és eközben a NADP+ NADPH-molekulává redukálódik (ún. Z-séma, 8.4. ábra).

8.4. ábra: A fotoszintetikus elektronvándorlás Z-sémája.

A fotokémiai reakcióközpont két klorofillmolekula által képzett speciális dimerből áll (a fotoszintézis „szíve”) (8.5. ábra), mely az ide továbbított fényenergiát irreverzibilisen fogadja be. Innen egy, a fényenergia által gerjesztett elektron azonnal elektronakceptor molekulák láncolatába kerül, vándorlása jól meghatározott térbeli elhelyezkedésű molekulákon keresztül történik.

8.5. ábra: A PS II dimer pigment-fehérjekomplexének szerveződése a tilakoid membránban.

8.2.1. A víz fotolízise

Az elektronját elvesztett festékmolekula az elektront a víz molekulájából pótolja. Így a PS II rendszerhez tartozó enzimek a fényelnyelő pigmentek által megkötött energiával a vizet protonra, elektronra és molekuláris oxigénre bontják (8.4. egyenlet). Kimutatható, hogy egy oxigénmolekula képződéséhez legalább négy fotonnak kell elnyelődnie a PS II centrumában. A vizet oxidáló katalizátor egy, a PS II fehérjéihez kötött 4 Mn-t tartalmazó Mn-O kötésű klaszter. Három mangán- és egy kalciumion köbös Mn3CaO4 rácsban található, melyben az oxigénatomok μ-oxohidakat képeznek a fémionok között. Egy további mangán (Mn4) ehhez a klaszterhez szintén egy mono-μ-oxohidas kötéssel kapcsolódik (8.6. ábra).

8.6. ábra: A mangán-klasztert tartalmazó katalitikus központ sematikus ábrája. (A különböző színnel jelölt aminosavak más-más fehérje alegységhez tartoznak: sárga - D1, narancs - D2, ill. zöld - CP43.)

Az enzim két vízmolekulát köt meg, és a vízmolekulákból a 4 elektront egyenként távolítja el a reakciócentrum elektronhiányának a pótlására, miközben a mangán +2, +3, ill. +4-es oxidációs állapotokat vehet fel (8.7. ábra)

8.7. ábra: A víz lépcsőzetes oxidációja körfolyamatának egyik feltételezett mechanizmusa.

8.2.2. A két fotorendszert összekötő elektronszállító lánc

A PS II leadott elektronjai számára az elsődleges elektronakceptor a plasztokinon, amelynek redukciójához két elektron szükséges. A kétszeresen redukált plasztokinont a citokróm b6f komplex oxidálja, és egyúttal továbbítja az elektronokat a plasztocianin közvetítéséval a PS I felé. (további részletek a citokróm b6f komplexről: http://fotoszintezis.szbk.u-szeged.hu/fototan/fot_mol_biol/cit_sum.htm )

8.2.3. Fotorendszer I.

Ebben a rendszerben a fény általi gerjesztés hatására hasonló folyamatok játszódnak le, mint a PS II-ben. A kialakuló elektronhiány a plasztocianinról pótlódik, tehát a PS II végső elektronakceptora valójában a PS I. A PS I gerjesztett elektronja a ferredoxin Fe-S centrumára kerül, és ez redukálja a NADP+ molekulát NADPH molekulává.

8.2.4. A CO2 redukciója

A NADPH-molekula segítségével a levegőből fölvett CO2 egy körfolyamatban szénhidrátokká redukálódik (sötétreakciók). A körfolyamatban keletkezik a glükóz, majd ebből a keményítő. A nagy energiatartalmú szerves vegyületek keletkezése energiát igénylő folyamat, az ehhez szükséges energiát elsődlegesen a fényenergia adja, az átalakulása folyamán termelődő ATP- és NADPH-molekula formájában.

A CO2 asszimilációja során a három-szénatomos elsődleges termékek egy olyan hat-szénatomos molekula hasadása során jönnek létre, amely a CO2 megkötésével képződött egy pentóz-származékból (ribulóz-1,5-difoszfát) (8.8. ábra). Ezt a karboxilálási folyamatot a ribulóz-1,5-difoszfát-karboxiláz/oxigenáz enzim katalizálja.

8.8. ábra: A ribulóz-1,5-difoszfát-karboxiláz enzim által katalizált CO2 fixálás sematikus képe.

Az enzim önmagában inaktív, az aktiválását egy szabályozó szerepet betöltő CO2 molekula, ill. Mg(II)-ionok megkötése okozza. A CO2 egy, az aktív központban lévő lizin oldallánccal labilis karbamátot képez, amit a Mg(II)-ion stabilizál. E folyamatot egy aktiváz-enzim katalizálja.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Írja fel a fotoszintézis két fő szakaszát! Melyik lépéshez van szükség közvetlenül fényenergiára?

- Hogyan lesz a glükózból keményítő? Írja fel a lejátszódó folyamat egyenletét!

- Miért a szénhidrátok biztosítják a fő energiaforrást a szervezet számára? A szöveg alapján állapítsa meg, mekkora energia szabadul fel 1 mol glükóz égése során?

- Milyen fémion játszik szerepet a víz oxidációját katalizáló redoxienzimben?

- A fotoszintézis során a magnézium több lépésben is nélkülözhetetlen. Mutassa be két példán a magnézium szerepét!

Chapter 9. 9. A DIOXIGÉN, O2 BIOLÓGIAI SZEREPE, FELVÉTELE ÉS SZÁLLÍTÁSA

Kulcsszavak: triplett oxigén, szingulett oxigén, peroxid, szuperoxid, oxid, a dioxigén aktiválása, oxidáz funkció, oxigenáz funkció, peroxidáz funkció, kataláz, szuperoxid-dizmutáz, oxigénhordozó komplexek, hemoglobin, mioglobin, porfirin gyűrű, hemeritrin, hemocianin, szintetikus oxigénhordozó komplexek.

9.1. Az oxigén tulajdonságai, előfordulása és szerepe biológiai rendszerekben

A nagy dioxigén, O2, koncentráció jelenléte a földi légkörben a növények folyamatos fotoszintetikus tevékenységének az eredménye. Az O2 megjelenése és felhalmozódása a Földön mintegy 2,5 milliárd évvel ezelőtt kezdődött és kb. 400 millió évvel ezelőtt alakult ki a már stacionáriusnak tekinthető egyensúlyi O2 koncentráció. A légkör aerobbá válásával az élet fenntartásának energiaszükségletét a környezetből felvett tápanyagoknak az O2 részvételével megvalósuló enzimek által gondosan szabályozott „lassú” égése szolgáltatja. A négy elektron felvételével lejátszódó O2 → 2 H2O folyamat energetikailag igen kedvezményezett folyamat (ΔG = -228,4 kJ/mol), mégis a molekuláris oxigén csak mérsékelten oxidáló tulajdonságú. A dioxigén renyheségének magyarázata, hogy amíg az O2 alapállapotban két párosítatlan spinű elektronnal rendelkezve (kettős gyök) triplett állapotú, (a triplett állapotú 3O2 mindkét szingulett állapotnál energetikailag sokkal kedvezőbb 1O2 () (90 kJ/mól) és 1O2 () 150 kJ/mól értékkel), addig a reakciópartner szerves molekulák általában párosítatlan elektront nem tartalmazó szingulett állapotúak, így a köztük lévő reakció spin-tiltott. A reakció végbemenetele nagy aktiválási energiát igényel. Ez a metastabil állapot az oka egyébként annak is, hogy az egyébként éghető anyagok (mint a fa, a fosszilis tüzelőanyagok, vagy a szénhidrátok, stb.) dioxigénben dús atmoszférában is eltarthatók anélkül, hogy a legalacsonyabb energiaállapotú CO2-dá és vízzé alakulnának. A reakció lejátszódásához az O2 molekulát aktiválni kell, amit átmenetifém komplexekkel (a szervezetben metalloenzimek révén, a kémcsőben pedig változó oxidációs állapotra képes átmenetifém ionokkal, ill. komplexeikkel) elő tudunk idézni. A dioxigén oxidáló tulajdonságát mutatják a 9.1. ábrán a semleges pH-ra vonatkozó redoxipotenciál értékek.

9.1. ábra: Az O2 és redukciós termékeinek redoxi (pH 7) tulajdonságai.

Az ábrából látható, hogy az O2 kételektronos redukciója termodinamikailag kedvezményezettebb, mint az egyelektronos, de igazából sem, egy- sem kételektronos lépéseiben nem erélyes oxidálószer. Közbülső oxidációs állapotai a szuperoxid gyökanion, O2? és a peroxidion O22 az igazán erélyes oxidálószerek. Ezek káros hatása ellen az aerob szervezeteknek védekezniük is kell (lásd a 9.2. fejezetet).

Az élő szervezetben előforduló O2 többféle fizikai folyamatban, ill. kémiai reakcióban vehet részt. Ezeket a 9.2. ábrán foglaljuk össze.

9.2. ábra: Az O2 részvétele biológiai folyamatokban.

A molekuláris oxigént előbb meg kell kötni, el kell szállítani oda, ill. ideiglenesen tárolni kell ott, ahol oxidációs reakcióba léphet. Ezekben a folyamatokban a vastartalmú hemoglobin és mioglobin, ill. alacsonyabb rendű szervezetekben a szintén vastartalmú hemeritrin és a réztartalmú hemocianin vesznek részt (lásd később). A redoxi reakciói többfélék lehetnek. Az O2 molekula mindkét oxigénatomja beléphet a szubsztrátba (dioxigenáz funkció), ilyen folyamatot katalizál például a vastartalmú bakteriális triptofán dioxigenáz. Részt vehet oxidáz folyamatokban, amikor az O2 molekula, megfelelő H-donor szubsztrát révén hidrogén-peroxiddá vagy vízzé redukálódik, pl. a vastartalmú citokróm c oxidáz enzim katalizál ilyen folyamatot. A katalizált reakció tulajdonképpen a szubsztrát dehidrogénezése. Vannak olyan folyamatok, amikor az O2 molekulának csak az egyik atomja lép be a szubsztrátba, a másik, H-donor szubsztrát révén H2O2-dá vagy vízzé redukálódik. Az ilyen folyamatokat monooxigenázok katalizálják (vegyes oxidáz-oxigenáz funkció). Ilyenek a hidroxileződési folyamatokat katalizáló enzimek, például a tirozináz, ami réztartalmú enzim, vagy a bakteriális kámfor monooxigenáz, ami vastartalmú.

Az oxigén redukciójának reaktív köztitermékei, mint a O2? és a O22 , ill. szerves peroxidok megjelenhetnek az élő szervezetek sejtjeiben. Ezek ellen a sejteket védeni kell, az e folyamatokat katalizáló enzimek vas-, mangán, ill. réztartalmúak. A peroxidok eltávolítása diszproporcionálódással történik, mely folyamatot a vastartalmú peroxidázok (kataláz) katalizálnak. A O2?semlegesítése is diszproporcionálódással O2? = O22 + O2 valósul meg, Cu/Zn- vagy Mn- és Fe-tartalmú szuperoxid dizmutáz enzim révén.

Amint a fentiekből látható döntően a Fe- és Cu-tartalmú fehérjék képesek mind az oxigén reverzibilis megkötésre, és ezáltal a biológiai rendszerekben való szállítására és tárolására, mind aktiválására, és így redoxi reakcióba vitelére (9.1, 9.2 séma).

Ha a K nagy, akkor az oxigénhordozó komplex képződésére van lehetőség. Azt viszont, hogy ez felhalmozódhat-e, vagy az oxigénhordozó komplex azonnali továbbalakulásával redoxi reakció játszódik le, azt a molekulán belüli intramolekuláris, a ligandumról az O2-re a fémion közvetítésével lejátszódó elektrontranszfer reakciónak a sebessége (a k nagysága) dönti el.

9.2. Oxigénhordozó komplexek

Bár a szervetlen kémiai ismereteink alapján leginkább a Co(II)-komplexek között várnánk oxigénhordozó tulajdonságú komplexeket, a biológiában ezt kizárólag vas- és réztartalmú fehérjék végzik. Három oxigénszállító rendszer ismeretes: a hemoglobin (Hb), a hemeritrin (Hr) és hemocianin (Hc). A hemoglobin vas-porfirin egységet un. hemet tartalmaz, míg a hemeritrin két nem hem vasatomot, a hemocianin pedig két rézatomot, mint funkcionális egységet, melyek aminosav oldallánc donorcsoportokon keresztül kapcsolódnak a fehérjerészhez. Ezen három oxigénhordozó fehérje néhány tulajdonságát a 9.1. táblázat (ld. 15. ajánlott irodalom: S.J. Lippard, J.M. Berg, 285. oldal, 11.1. táblázat) tartalmazza. Az O2 molekula tárolását a szövetekben, mint például az izomban a mioglobin (Mb) és a miohemeritin (MioHr) látja el, amelyek szerkezete nagyon hasonló a megfelelő szállító fehérjéhez. Oxigéntartalmazó állapotukban ezek a fehérjék intenzív színűek. Az O2 kötődése a Hr és Hc molekulákban, peroxid formában történik, míg az egymagvú Hb-ban a kötődés legvalószínűbb állapota a O2?szuperoxidion. A redukált, oxigénmentes állapotokat dezoxi, az O2-kötött állapotokat oxi, és az oxidált, funkcionálisan inaktív állapotokat met előtaggal különböztetjük meg.

9.1. táblázat: Az oxigénhordozó fehérjék néhány tulajdonsága.

9.2.1. A hemoglobin és a mioglobin

A magasabb rendű állati szervezetek használják a hemoglobint (egy speciális tetrapirrol származék a porfinvázas protoporfirin-IX makrociklus (9.3. ábra) egymagvú vaskomplexe) az O2 szállítására a tüdő és a szövetek között a véráram útján, ill. a mioglobint hogy az O2-t az izomszövetekben tárolják (9.4. ábra).

9.3. ábra: A hem (Fe-protoporfirin IX) szerkezete.

9.4. ábra. A mioglobin szerkezete.

Mivel az O2 szállítása és tárolása nem katalitikus, hanem sztöchiometrikus funkció a szervezet vastartalmának döntő része (65%+6%) e két fehérjében kötötten fordul elő. A vastároló fehérjék a ferritin és a hemosziderin tartalmazzák a maradék vas döntő részét (13+12%). A katalitikusan aktív enzimek (akár hem, akár nem hem típusúak) elenyésző mennyiségű vasat tartalmaznak.

A gerincesek izomszöveteiben az O2-tároló szerepet betöltő mioglobin egyetlen, 153 aminosavat tartalmazó polipeptid láncból áll, melyet globinnak hívunk. Ehhez kapcsolódik egy hisztidin imidazol oldalláncon keresztül koordinatív kötéssel az O2-kötő prosztetikus csoport a Fe(II)-protoporfirin IX. A dezoximioglobin ötös koordinációjú Fe(II)-t tartalmaz, amely mintegy 0,42 Å-mel a négy pirrol gyűrű által meghatározott síktól a közeli His felé eltolódva helyezkedik el. A hatodik koordinációs hely üres, bár jóval távolabb itt is található egy hisztidin oldallánc. Az O2 megkötésekor a vasatom közelítőleg a gyűrű síkjába esik. Az O2 molekula az egyik végén keresztül kötődik a vashoz; a Fe O=O kötésszög 115o.

A hemoglobin (Hb) a véren keresztül szállítja a tüdőben felvett O2-t a szövetekben levő mioglobinnak. A Hb négy alegységből (2 α és 2 β) álló fehérje, az alegységek egyike sem egyezik meg pontosan a mioglobinnal. Mindegyik alegység tartalmaz egy Fe(II)-protoporfirin IX (hem) csoportot, amely a közeli (proximális) His imidazol oldalláncon keresztül kötődik a fehérjéhez, hasonlóan, mint a mioglobinban. A dezoxi-Hb-ban a vas ?,36-?,4? Å -mel itt is a porfin váz síkja alatt helyezkedik el, ami az O2 molekula megkötődése hatására, ?,12 Å-nyire a síkba „esik”.

Mind a Hb mind a Mb valószínűleg a legjobban vizsgált fémtartalmú fehérje, számosan tanulmányozták termodinamikai, spektroszkópiai és kinetikai viszonyait. Az optikai spektrumát egy intenzív, a porfin gyűrű π?π? átmenethez rendelhető sáv uralja a 4??-6?? nm hullámhossz tartományban, amit Soret-féle α és β sávnak nevezünk. A Raman spektroszkópiai adatok az O2 oldaláról, míg a Mössbauer spektrális adatok a vas oldaláról arra utalnak, hogy a koordinált O2 állapota a hemben leginkább a Fe(III)-szuperoxidion, Fe(III)-O2- kötési viszonnyal írható le. Bár sokáig kérdéses volt az irodalomban a vas-oxigén kötés mibenléte, a ma rendelkezésünkre álló bizonyítékok fényében az valószínűsíthető, hogy az O2 koordinálódását a dezoxi-Mb vagy dezoxi-Hb-hoz egy elektron átmenete kíséri a Fe(II)-ről az O2 molekulára. Az O2- gyökaniont a távoli (distal) His imidazol-N-H hidrogénkötéssel stabilizálja.

A Mb erősebb O2 megkötő képessége és a Hb O2 megkötését jellemző kooperatív hatás eredményezi a szállító rendszerből a tároló rendszerbe való minél hatékonyabb O2 átadást (minél kevesebb az O2 a szállító rendszerben, annál tökéletesebben képes átadni azt a tároló rendszernek). Az ennek eredményeként kialakuló Mb és Hb oxigéntelítési görbéket a 9.5. ábrán tüntettük fel.

9.5. ábra: A mioglobin és a hemoglobin oxigéntelítési görbéinek pH függése.

A rendszer működésének lényegi eleme a vasnak a porfirin váz síkjába való kerülése, ami a több alegységes Hb fehérje kooperatív O2 megkötését eredményezi. Kicsit leegyszerűsítve a helyzetet a fehérjének két különböző kvaterner szerkezetét képzelhetjük el, melyek egymással egyensúlyban vannak. A feszítetett állapotban, amely a nem koordinált állapotban jellemzi a Hb-t, az alegységek közötti sóhíd kölcsönhatások (negatív töltésű COO- és pozitív töltésű -NH3+ aminosav oldallánc donorcsoportok között) akadályozzák a közeli hisztidint abban, hogy elmozduljon a porfirin váz síkja irányába, ami csökkent oxigén megkötést eredményez. Az első O2 molekula megkötésekor a kvaterner szerkezet kisebb, a második O2 molekula megkötésekor jelentősebb konformációváltozást szenved, amelyben ezek az akadályok megszűnnek és a másik két alegység O2 megkötő képessége nő. Az egész konformáció-váltási folyamatnak a kulcsa, hogy az O2 megkötés hatására a vas a porfinváz síkjába hullik, magával húzva a közeli hisztidint is. Amint az a 9.6. ábrán látszik a dezoxi-Hb Fe(II) állapota nagy spinszámú (S=2), és túl nagy a kovalens sugara, hogy a vas a váz által meghatározott síkban helyezkedjen el. Az O2 felvétel hatására képződő Fe(III)-O2- adduktumban a vas kovalens sugara csökken és a vas a váz által meghatározott síkba mozdul. A pH csökkenése (Bohr effektus) pl. a nagy CO2 tartalmú szövetekben szintén kedvezményezetté teszi a Hb O2 leadását (lásd a 9.5. ábrát), ami tovább fokozza az oxigénnek a vérből a szövetekbe való átadását. Ennek van jelentősége a fokozott izommunkánál megnőtt oxigénigény kielégítésében is, amikor az izomszövetekben a tejsav-koncentráció megnövekedése eredményezi a pH csökkenését.

9.6. ábra: A dezoxi-Hb és az oxi-Hb szerkezete és elektronállapota:(a) a nagy spinszámú Fe2+ dezoxi forma, (b) a kis spinszámú Fe3+ oxi forma.

A reverzibilis O2-hordozó komplexek előállítása a szintetikus kémia nagy kihívását jelentették hosszú ideig. A jól ismert Co(II) és más átmenetifém (pl. az Ir(I) Vaska-komplexe) komplexek mellett a Fe(II)-porfirin komplexeknél a fő problémát az jelenti, hogy irreverzibilisen reagálnak oxigénnel μ-peroxo intermedieren keresztül. A reverzibilis oxigénhordozó Fe(II)-porfirin komplexek előállítására több megközelítést is alkalmaztak. Mindegyik a Fe(II) körüli hidrofób környezet kialakításával igyekezett megakadályozni, hogy a reaktív oxigénezett centrumok μ-peroxo komplexet képezve reagáljanak. Ezek a komplexek reverzibilis O2 hordozó sajátságot mutattak és hozzájárultak a természetes O2-hordozó komplexek szerkezetének s működésének jobb megismeréséhez.

9.7. ábra: Szintetikus oxigénhordozó komplexek.

9.2.2. A hemeritrin

Néhány szárazföldi gerinces (pl. a kígyók) vagy a tengeri férgek nem hem típusú fehérjét használnak az O2 reverzibilis felvételére és szállítására. A vastartalmú hemeritrin, mely nevével ellentétben nem tartalmaz Fe(II)-porfirin prosztetikus csoportot (hem), 8 alegységből felépülő (8x13,5 kDa) 1?8 kDa molekulatömegű vastartalmú fehérje, mely alegységenként 2 vasat tartalmaz és 1 molekula O2 megkötésére alkalmas. A rendelkezésre álló mágneses, spektrális (rezonancia Raman és Mössbauer) és újabban röntgendiffrakciós adatok a dezoxi- származékban két egymással gyenge spin kölcsönhatásban levő hidroxohíddal összekapcsolt nagy spinszámú Fe(II) jelenlétét valószínűsíti. A fehérjerészhez való kötődésben His, Asp és Glu aminosavak vesznek részt, az utóbbiak karboxilát hídligandumként kötik össze a két vascentrumot. A nem kooperatív O2 felvétel, melyet a 9.8. ábra szemléltet, jelentős színváltozással és redoxi reakcióval jár, a Fe(II) atomok egy-egy elektronátadásával Fe(III)-má oxidálódnak és peroxid formában (ν(Raman)= 848 cm-1) aszimmetrikus elrendeződésben kötik az O2 molekulát. Az O22- csak az egyik Fe(III)-hoz kötődik, a másik végével, hidrogénhíddal kapcsolódik a hidroxidhídhoz. A két nagy spinszámú Fe(III) erős antiferromágneses csatolásban van egymással (S=1/2).

9.8. ábra: A dezoxi-hemeritrin O2 felvételi reakciója.

A dezoxi formában a Fe(II)-ionok egy OH-ionon keresztül kapcsolódnak. Az O2 megkötése után az OH deprotonálódik a peroxo intermedier révén és egy oxohíd alakul ki a két Fe(III) centrum között. A hidroxi-peroxid hidrogénhidat alakít ki az oxohíd ligandumokkal.

9.2.3. A hemocianin

A hemocianinok tengeri élőlények „vérében” előforduló réztartalmú fehérjék, melyek több alegységből felépülő nagy fehérjemolekulák, molekulatömegük általában nagyobb, mint 45? kDa. A színtelen dezoxi forma telítetlen koordinációs szférájú Cu(I) ionokat tartalmaz, melyek mindegyike 3 His oldallánchoz koordinálódik, az egyes alegységekben a Cu(I)-ek közötti távolság ? 4,6 Å, kialakítva egy az O2 befogadására alkalmas üreget. A fémcentrumok egymástól elkülönültek, közöttük kölcsönhatás nem mutatható ki. Az oxiHc viszont két erős antiferromágnesesen csatolt Cu(II)-t tartalmaz (3. típusú réz-fehérje). Elektrongerjesztési spektruma 345 nm-nél intenzív elnyelési sávot mutat (ligandum?fém CT sáv), ami a Cu2-μ-peroxo centrumot tartalmazó komplexekre jellemző. Spektroszkópiai, O18 izotópos vizsgálatok és nagyszámú szintetikus modellel szerzett ismeretek alapján az O2 kötődése a 9.9. ábrán feltüntetett kétféle módon is elképzelhető.

9.9. ábra: A dezoxi-hemocianin O2 felvételi reakciója (+ animáció).

Az első kötésmódban az erős antiferromágneses kölcsönhatáshoz még egy hídligandumra van szükség, ami lehet egy OH-, míg a második kötésmódnál erre nincs szükség, és a jelentősen meggyengült O-O kötést is jobban magyarázza. Az O2 oxidációs állapotát ebben az esetben is a rezonancia Raman mérések alapján feltételezhetjük. A legújabb röntgendiffrakciós mérések az utóbbi, az μ-η22 koordinációjú alapjában síkszerű [Cu2O2]2+ vázat tartalmazó szerkezetet igazolták.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Milyen reakciókba léphet a molekuláris oxigén az élő szervezetekben?

- Hasonlítsa össze az oxigénszállító fehérjék szerkezeti sajátosságait!

- Magyarázza hemoglobin és a mioglobin eltérő funkcióját, eltérő oxigén-kötő sajátosságait szerkezeti különbözőségeik alapján!

- Milyen szintetikus oxigénhordozó komplexeket ismer? Ezekben milyen módon kötődhet az oxigén molekula?

- Mi a különbség a hemeritrinben és a hemocianinban levő peroxidkötésű oxigénmolekula között?

Chapter 10. 10. KISMOLEKULÁK AKTIVÁLÁSA AZ ÉLŐ SZERVEZETBEN

Kulcsszavak: Fe(II/III), Cu(I/II), citokróm P450, oxidázok, oxigenázok, szuperoxid dizmutázok, peroxidázok, kataláz, molibdén, FeMo-kofaktor, nitrogenáz, hidrogenázok, nikkel, F430 koenzim.

Az életfolyamatok fenntartása és biológiai rendszerek energiaigényének biztosítása elképzelhetetlen az egyszerű, szervetlen kismolekulák részvételével lejátszódó folyamatok nélkül. Az aerob élőlények az O2, az N2, a H2O és a CO2, míg az anaerob rendszerek a H2, a CO, a CO2 és a CH4 különböző reakcióit igénylik. Az említett kismolekulák normális környezeti feltételek mellett azonban csak kevessé reakcióképesek, azaz szükség van olyan összetett rendszerek létezésére, amelyek biztosítják ezen kismolekulák aktiválását. Ezeket a reakciókat, mint a redoxi reakciókat általában, változó oxidációs állapotú fémionokat (vas, réz, nikkel molibdén, mangán, vanádium) tartalmazó enzimek katalizálják.

10.1. Az O2 aktiválása és metabolizmusa

Az oxigénmolekula részvételével lejátszódó redoxi folyamatokban meghatározó szerepe van a vas- és réztartalmú fehérjéknek. A reverzibilis O2 hordozó molekulákat, a vastartalmú hemoglobint és hemeritrint és a réztartalmú hemocianint a 9. fejezetben már tárgyaltuk. Ebben a fejezetben a molekuláris oxigén redukciójával, azaz a szubsztrát oxidációjával járó folyamatok néhány fontosabb példáját emeljük ki. Az oxigenázok működése során az O2 molekula oxigénatomjai belépnek a szubsztrátba és ezáltal oxidálják azt. Az oxidáz funkció az O2 metabolizmusának alapfolyamata az O2 redukciója végső soron vízzé, az igen reaktív köztitermékeken (H2O2, O2?-) keresztül, melyek átmenetileg megjelenhetnek a sejtekben. Ezek eltávolítását külön enzimrendszerek, a peroxidáz/kataláz és a szuperoxid dizmutáz, végzik (a részfolyamatokat lásd a 9. fejezetben).

10.1.1. Vastartalmú oxigenázok

A mono- és dioxigenázok között hem és nem hem típusú vastartalmú fehérjékkel egyaránt találkozunk. Ezen enzimrendszerek közül is talán legismertebb a citokróm P450, amelynek katalitikus ciklusát a 10.1. ábra szemlélteti. A citokrom P450 (fényelnyelése 450 nm-nél mutat maximumot) enzimcsalád, igen sokféle monooxigenáz folyamatot képes katalizálni, azaz a molekuláris oxigén egyik oxigénatomját különféle biológiai szubsztrátoknak átadni, miközben a másik oxigénatom vízzé redukálódik. Így, működéséhez ezen két elektronos redukciót végző koenzimre (FADH2, és az elektronszállító vas-kén fehérje rendszer által szolgáltatott elektronokra) is szükség van. A citokróm P450 enzimek által katalizált leggyakoribb reakciótípusok a hidoxileződési, folyamatok, és az igen nehezen megvalósítható reakciót a szénhidrogének alkoholokká való oxidálását is képesek katalizálni.

A különböző élő szervezetekben előforduló citokróm P450 enzimféleségek közös jellemzője az, hogy bennük a hem egység egy cisztein tiolát csoporton keresztül kapcsolódik a fehérjerészhez. Az alapállapot kis spinszámú hatos koordinációjú (porfirin, Cys, H2O) Fe(III), amely főként hidrofób kölcsönhatások révén képes a 6. koordinációs hely környezetében a víz kicserélésével a szubsztrát megkötésére. Ez a Fe(III) nagy spinszámúvá való alakulását idézi elő. A következő 1 elekronos redukciós lépésben (FADH2) nagyspinszámú Fe(II) állapot alakul ki, üres 6. koordinációs hellyel, amely alkalmas az O2 megkötésére. Ennek révén koordinatíve telített kis spinszámú oxi-forma alakul ki, nagy valószínűséggel Fe(III)- O2- elektroneloszlással a Fe(III) és az O2 között.

10.1. ábra: A citokróm P450 katalitikus ciklusa.

(S.J. Lippard, J. Berg, Principles of Bioinorganic Chemistry, University Science books, Mill Valley, CA 94941, 1994, p. 308)

Egy újabb 1 elektronos redukcióval a nagyon labilis kis spinszámú peroxo Fe(III)-komplex képződik. Ez oxidálja a Fe(III)-at Fe(IV)-gyé, majd az O-O kötés felhasadásával Fe(IV)-O- képződik, míg a másik oxigén atomját leadva két protonnal egy vizet képez. A reakciólépés a következő „oxenoid” formákkal jellemezhető: Fe(III)-Oo ? Fe(IV)-O ? Fe(V)-O2 . Alternatív lehetőségként a porfirin váz π elektronrendszere is oxidálódhat kationos gyökké, ami P-Fe(IV)=O állapotot jelent. A fenti, szokatlan oxidációs állapotú vasat tartalmazó, igen erélyes oxidáló centrum H-absztrakció majd kötésátrendeződés révén adja az alkoholt és a kiindulási alapállapotú enzimet. A vázolt mechanizmus alapján világos, hogy a hatékony működés alapfeltétele a szokatlan Fe(IV)/Fe(V) oxidációs állapotok, mint reaktív köztitermékek megjelenése. Hasonló oxidációs állapotok kialakulásával más vastartalmú fehérjék működése során is találkozhatunk (pl. kataláz, lásd 10.1.5. fejezet).

10.1.2. Réztartalmú enzimek: oxidázok és oxigenázok

Amint azt fentebb már említettük, a réztartalmú fehérjék gyakorlatilag minden olyan funkciót képesek ellátni, amit a vastartalmú fehérjék. A fehérjékben kötött rézatomok koordinációs geometriája és spektrális jellemzőik alapján a réztartalmú fehérjéket különböző szerkezeti típusokba szokták sorolni, amelyek egyszerűsített összegzését a 3. melléklet M3-7. táblázatában foglaltuk össze. A réztartalmú oxidázok és oxigenázok általában igen összetettek és fontosabb képviselőiket a 10.1. táblázat mutatja.

10.1. táblázat: Néhány reprezentatív réztartalmú fehérje.

A kék réz oxidázok közös jellemzője, hogy a rézionok mindhárom típusát tartalmazzák, azaz minimum 4 réziont: 1db 1. típus + 1. db 2. típus + 2 db. 3. típus megoszlásban. Ilyen típusú oxidázok a lakkáz, az aszkorbát oxidáz és a ceruloplazmin. Az aszkorbát oxidázban például a röntgendiffrakciós mérések a 2. és a 3. típusú réz közelségéről vallanak, ami alapján ezt, mint kölcsönható trimer rendszert kezelhetjük (10.2. ábra). Ez az elrendeződés kedvez az O2 molekula négy-elektronos 2 H2O-zé történő redukciójának. Amint látható a rézionok kötésében általában His imidazol-N-ek vesznek részt. Oxidált állapotban két 2. típusú Cu(II)-t egy OH- híd köt össze, amely a réz atomok redukált állapotában disszociálnak. A réz trimer mellett a molekula jóval távolabb tartalmazza az 1. típusú Cu centrumot, ami a szubsztrát és az O2 molekula közötti elektronszállításban vesz részt.

10.2. ábra: Az aszkorbát oxidáz Cu trimer egysége.

Van néhány oxidáz enzim, amely nem sorolható ebbe a csoportba, pl. a galaktóz oxidáz, mely egyetlen 2. típusú réz centrumot tartalmaz négyzetes piramisos elrendezésben és koordinációs szférájában 3 His mellett két Tyr is van. Az egyik Tyr gyökké alakul a reakcióciklusban (hasonlóan, mint pl. az a vastartalmú ribonukleotid reduktázban történik, lásd a 11. fejezetet), és a Cu(I)/Cu(II) elektronátmenettel együtt 2 elektronos oxidázként működik.

Vannak réztartalmú monooxigenázok vagy hidroxilázok is, mint a tirozináz, vagy a dopamin-β-monooxigenáz. Ezek a hormon és neurotranszmitter pirokatechin-származékok metabolizmusában (tirozin ? dopa ? dopamin ? noradrenalin ? adrenalin) játszanak szerepet. Az enzimben az O2 kötődése teljes hasonlóságot mutat az oxy-hemocianinban kapottakhoz (lásd 9.2.3. fejezet). Hasonlóképpen o-kinonná oxidál a tirozináz enzim más benzolszármazékokat is, mint pl. az 1,2-diamino-benzolt. Ez a reakció az o-kinon polimerizálódásával a vöröstől a sötét barnáig terjedő színt mutató melaninig megy. A melanin a bőr, a haj és a tollak festékanyaga, ill. képződik a gyümölcsök levegő oxidálta rothadási folyamataiban (gyümölcsök barnulása) is. Másrészről, az o-polifenolokat vas-, illetőleg réztartalmú pirokatechin dioxigenázok gyűrűfelhasadással oxidálják tovább, ami az aromás vegyületeknek a környezetben való mikrobiológiai lebomlási folyamatát jelenti.

10.1.3. A citokróm c oxidáz; a légzési lánc és az oxidatív foszforiláció

A citokróm c oxidáz az utolsó tagja a membránban kötött elektrontranszportnak, amely a mitokondriális légzési láncot alkotja. Elektrontranszfer lépések gondos szabályzásával szállítja az elektronokat az elektrondonor NADH és FADH2 és az akceptor O2 molekulák között. Ezen folyamatok egyben nagy mennyiségű energia felszabadulását teszik lehetővé szabályozott módon, és a membrán két oldala között protongradienst hoznak létre. Ez a protongradiens adja az ATP szintéziséhez a hajtóerőt. Azaz a tápanyagok elégetése során felszabaduló a NADH és a FADH2 által közvetített oxidációs energia kémiai energia, ATP formájában tárolódik. Ez az oxidatív foszforiláció. A légzési lánc és az oxidatív foszforiláció tehát ugyannak a folyamatnak két oldalát jelenti.

A citokróm c oxidáz egyike a legfontosabb, de egyben a legbonyolultabb metalloproteineknek, amely 13 alegységből épül fel (molekulatömege ? 1?? kDa). Ebből két alegység, ami az enzim aktivitásáért felelős, a többi valószínűleg a membránhoz való megfelelő kötődést biztosítja. A fémtartalmú elegységek két hemet (cit a és a3) (7.2. fejezet) három rezet (CuA és CuB), egy cinket és egy magnéziumot tartalmaznak. Ez utóbbi kettő elsősorban szerkezetstabilizáló szerepet tölt be. Szerkezeti szempontból az enzim egyik érdekessége a dimer CuA centrum, ami egy szulfidhidas, vegyesvegyértékű magot tartalmaz (lásd 10.3. ábra). A két réz összesen rendelkezik egy párosítatlan elektronnal (Cu(I) + Cu(II)) és a maradék koordinációs helyeket His-imidazol nitrogének foglalják el. A CuB monomer Cu(II) centrum, hasonló a 2. típusú rézhez, de a koordinálódó hisztidinek trigonális piramisos elrendeződésben vannak.

A CO kompetitív partnere az O2-nek a citokróm c oxidázhoz való kötődésében is, csakúgy mint a Hb esetében (lásd a 9. fejezet). Toxikológiailag sokkal fontosabb azonban a CN- kötődése, és hatásos inhibíciós reakciója, mely blokkolja a légzési lánc terminális lépését és eredményezi a cianid igen erős mérgező tulajdonságát.

10.3. ábra: A CuA szerkezete.

10.1.4. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) enzimek

A szuperoxid dizmutáz (SOD) enzimek a toxikus O2 szuperoxid gyökanion diszproporcionálódását katalizálják oxigénné és hidrogénperoxiddá (10.1. egyenlet). Az eukarioták (sejtmaggal rendelkező szervezetek) citoplazmájában működő Cu/Zn-tartalmú SOD mellett a prokariotákban (sejtmaggal nem rendelkező szervezetek) vastartalmú (baktériumokban és növényekben) és mangántartalmú (a mitokondriumban és baktériumokban) enzimek is találhatók az élővilágban. Újabban egy nikkeltartalmú SOD enzimet is azonosítottak, amely kizárólag mikroorganizmusokban található.A különböző SOD enzimek hatásukat alapvetően annak köszönhetik, hogy az M(I)/M(II) redoxipotenciál a réz, az M(II)/M(III) a vas, mangán és nikkel esetén az O2/O2-, ill. a O2-/O22- párok redoxipotenciálja közé esik.

10.1.4.1. Vas- és mangán- és nikkeltartalmú SOD-ok

A Mn-SOD esetén az enzimműködés katalitikus ciklusát a 10.2. és 10.3. egyenletekkel értelmezhetjük, míg az aktív centrum szerkezetét a 10.4. ábra szemlélteti. A vastartalmú SOD enzimek szerkezete és a katalitikus reakció mechanizmusa a mangánhoz nagyon hasonló és az ábra alapján jól látható, hogy a fémionok torzult trigonálios bipiramisos környezetben vannak. Három His, egy Asp és egy H2O/OH található a fémion koordinációs szférájában, de az aktív centrum kialakításában hidrogénkötések révén részt vesz még a Tyr, Trp, Gln és Asn oldallánc is.

A Ni-SOD enzim szerkezetileg teljesen különböző az előbbiektől. A nikkelatomok megkötésében a cisztein-S donoratomoknak van meghatározó szerepe, és a működés során a szokatlan Ni(II)   Ni(III) átmenet valósul meg.

10.4. ábra: A Mn-tartalmú SOD enzim aktív centrumának szerkezete.

A különböző SOD enzimek létezése jól mutatja az enzimrendszerek fejlődési folyamatát az evolució során. Nagyon valószínű, hogy a vastartalmú SOD még az evolúció korai szakaszában kis O2 koncentrációszintnél kialakulhatott. Ahogy az evolúció előrehaladtával a légkör O2 koncentrációjának növekedésével a vas biohozzáférhetősége, annak oxidálódása miatt csökkent, a Mn-tartalmú SOD-ok vették át egyre inkább az O2- semlegesítésének szerepét, illetőleg kifejlődtek a leginkább hatékony Cu/Zn-tartalmú SOD enzimek. A nikkeltartalmú SOD enzimek jóval ritkábbak az előzőeknél és mind a szerkezet, mind a katalitikus reakció mechanizmusa tekintetében egyedi esetet képviselnek. A Ni-SOD létezése ugyanakkor jól mutatja azt a nagymértékű változatosságot, amit a természet a reaktiv oxogéngyökökökkel szembeni védekezés során kialakított.

10.1.4.2. A Cu/Zn-tartalmú SOD

A SOD enzimek közül a Cu/Zn tartalmú ismert a legnagyobb mértékben. Két viszonylag kicsi alegységből áll (molekulatömege 2x16 kDa), és mindegyik alegység tartalmaz egy réz- és egy cinkiont, melyeket oxidált formában egy deprotonált imidazolát gyűrű hídligandumként köt össze. A réz koordinációs szférájában további három His, míg a cink koordinációs szférájában két His és egy Asp található, amint az a 10.5. ábrán látható. A cink koordinációs szférája közel tetraéderes, a rézé erősen torzult, átmenetet képez a négyzetes piramisos és a trigonális bipiramisos geometria között. A réz aktív centruma képes a O2 megkötésére. A dizmutálási reakció lényegi része az, hogy a redoxi aktív Cu centrum egyik állapotában képes a metastabilis O2oxidálására, míg a másik állapotában a redukálására (10.4. 10.7. egyenletek)

10.5. ábra: A Cu/Zn SOD enzim aktív centruma.

Amint azt a 10.4. 10.7. egyenletek is mutatják az enzimreakció első lépésében az enzimben kötött Cu(II) oxidálja a koordinált O2-t O2-né. A redukált Cu(I)-et egy proton kiszorítja az imidazolátról, így a Zn(II) szabályos tetraéderes komplexszé alakul. Majd a még a fehérjéhez kötött koordinatíve telítetlen Cu(I)-et a hidrogénkötéssel kapcsolódó O2 oxidálja vissza Cu(II)-vé, és HO2-t a Zn(II) koordinált HisH protonálja H2O2-vé. A reakció hajtóereje a Cu(II) nagy affinitása a His imidazoláthoz. A reakció igen gyors (k = 2?1?9 M 1s 1), közel van a diffúziós határhoz, és így a Cu/Zn SOD antioxidánsként viselkedve képes a citoszolból eltávolítani a O2-t, gátolva így az öregedést és a sejtek rákos elfajulását.

10.1.5. A peroxidázok és a kataláz

Az oxigénmolekula kételektronos redukciója, ill. a SOD enzimek működése egyaránt a reaktív hidrogén-peroxid képződéséhez vezet. Ennek további lebontását a peroxidáz és kataláz enzimek végzik. A peroxidázok a 10.8. egyenlet szerint a hidrogénperoxidot további kételektronos redukcióval vizzé redukálják. A kataláz enzim a hidrogén-peroxid diszproporcióját vezérli és a 10.9. egyenlet értelmében vizet és oxigént termel.

A peroxidok semlegesítését végző hidroperoxidázok hem b-t tartalmaznak prosztetikus csoportként. A hidroperoxidázok nyugalmi állapotban Fe(III)-hemet tartalmaznak. Minden esetben a peroxid oxidálja a hem centrumot és egy intermedier oxoferril centrum (Fe(IV)=O) képződik, egy elektron vagy a hemről származik és ezáltal π kation gyökké alakul, vagy a környező fehérje oldalláncáról. Ezt az erélyes oxidáló centrumot a következő lépésben vagy a H2O2 (diszproporcionálódás) vagy egy szubsztrát (RH2) vagy egy redoxi partner (citokrom cred, Mn(II), Cl-) redukálja. Minden esetben az oxoferril centrum végül vizet ad, és a vas visszajut a Fe(III)-hem állapotba. A környező fehérje oldalláncok (His, Asp) hidrogénhidak révén segítik elő az elektrontranszfer reakciót a hem centrum és a szubsztrát között.

A peroxidáz enzimek további két fontos képviselőjét jelentik a vanádiumtartalmú haloperoxidázok, ill. a szeléntartalmú glutation-peroxidáz. Ezen enzimek szerkezetével és működésük értelmezésével a következő fejezetekben fogunk megismerkedni.

A kataláz a H2O2 diszproporcionálását végzi és szerkezete alapján szintén a hemtípusú vasfehérjék közé sorolható. A kataláz enzim működési mechanizmusának egyszerűsített modelljét a 10.6. ábra szemlélteti és látható, hogy ismét az igen reaktív Fe(IV) köztiterméknek van kitüntetett szerepe.

10.6. ábra: A kataláz enzim reakcióciklusának sematikus ábrázolása.

10.1.6. A vanádiumtartalmú haloperoxidázok

A peroxidázok csoportjába tartoznak a haloperoxidázok is, amelyekben a H2O2 redoxi partnere halogenidion, és a reakciójuk eredményeképpen keletkező hipohalogénessav az, ami további reakcióba léphet a szubsztráttal. A haloperoxidázok között a vanádium-tartalmúak a legjelentősebbek. A haloperoxidázok néhány szárazföldi gombában (kloroperoxidáz) és egyes tengeri algákban (elsősorban bromo- és jodoperoxidázok) fordulnak elő. Az általuk katalizált reakció a 10.10. egyenlettel szemléltethető, ahol X a halogenid (Cl, Br vagy I) ionokat, RH a szerves szubsztrátot jelenti. A röntgendiffrakciós szerkezet bizonyítja, hogy a VV vanadátként (HVO4) kötődik az aktív centrumban, amit négy nem-fehérje eredetű oxigén és egy His imidazol-N koordinál trigonális bipiramisos elrendeződésben, három oxigénnel az ekvatoriális síkban, melyek hidrogénkötésben vannak a fehérjével. A peroxid származékban a peroxidcsoport kétfogúan η-módon koordinálódik a vanadáthoz (a koordinációs szám növekszik). A szárazföldi haloperoxidáz és a tengeri bromoperoxidáz az aktív centrum és annak környezetét tekintve nagyfokú hasonlóságot mutat.

10.1.7. A glutation peroxidáz

A glutation peroxidáz enzim az emberi szervezet egyik legfontosabb enzime, amely a reaktív szabad gyökök elleni védelemben meghatározó szerepet játszik. Az enzim szinte valamennyi emlős citoplazmájában megtalálható és elsődleges funkciója a lipid hidroperoxidok és a hidrogén-peroxid koncentrációjának alacsony szinten tartása. Az enzimnek nagyon sok szerkezetileg és funkcionálisan különböző változata ismert, de ezek egyik közös jellemzője, hogy általában szeléntartalmú fehérjékből épülnek fel. be. A glutation peroxidáz a legismertebb szeléntartalmú enzim, amely a reaktív oxigén gyökanionok közül a peroxidanion redukcióját katalizálja az alábbi folyamatban (10.11. egyenlet).

A glutation oxidált formáját (GSSG) a szelenoprotein képes visszaredukálni glutationná (GSH) és ezáltal biztosítja a katalitikus ciklus létrejöttét. Az enzim működése tehát elválaszthatatlen a glutation jelenlététől, ami az élő szervezetekben legnagyobb koncentrációban megtalálható természetes tripeptid, γ-L-glutamyl-L-ciszteinilglicin. Az aminosavakra jellemző fémkötési helyekből és a szabad tiolcsoport jelenlétéből adódóan a glutation fémionaffinitása más biomolekulákhoz képest kiugróan nagy, ezért a glutation a fémionok felvétele/megkötése és a Cu(II)/Cu(I) redoxi rendszer szabályozása szempontjából is jelentős lehet.

10.2. A nitrogén körforgás metalloenzimei

A szervetlen, ill. biológiai nitrogén körforgás a földi élet szempontjából aligha becsülhető túl. Elég csak az ammónia szintézis ipari folyamatára gondolni, amely évente 40 millió tonna termelést jelent a talajok nitrogénhiányának pótlására. A biológiai nitrogénfixálás révén 100-140 millió tonna NH3 képződik évente, míg az atmoszférikus reakciók (pl. villámlás) 10-40 millió tonna/év mennyiséggel járulnak hozzá az NH3 képződéséhez. A tüzelőanyagok égéstermékei 90-190 millió tonna/év, a biológiai denitrifikálás folyamatai pedig további 100-160 millió tonna/év mennyiséget jelentenek. A teljes szárazföldi nitrogén körforgás megközelíti a 2 milliárd tonna/év értéket és ehhez járul még a zömmel tengeri planktonokból származó kétszer ennyi, kb. 4 milliárd tonna/év nitrogén mennyiség. A legtöbb biológiai rendszer, amely a nitrogénkörforgásban részt vesz fémtartalmú enzimet használ. Három fő folyamat különböztethető meg: a nitrogénfixálás (10.12.a. és b. egyenlet), a nitrifikálás (10.13. egyenlet) és a denitrifikálás (10.14. egyenlet). A nitrogénfixálás enzimei vas- és molibdén(vanádium)-tartalmú enzimek, a denitrifikálás folyamatában az ugyancsak Mo-tartalmú nitrát reduktáz, a Cu vagy hemtartalmú nitrit reduktáz és a Cu-tartalmú dinitrogén-monoxid reduktáz enzimek vesznek részt.

Biológiai és kémiai jelentőségénél fogva is kiemelkedik ezek közül a levegő N2 tartamának a nitrogenáz enzim által történő fixálása. Ezt biológiailag a pillangósok gyökérzetén a növénnyel szimbiózisban élő baktériumok (az Azobacter törzs Rhizobium baktériumfaja) végzik. Az ezen biológiai rendszerekben megvalósuló nitrogénfixálás a klasszikus koordinációs kémia területén is kiterjedt vizsgálatokat indított a dinitrogénmolekula aktiválásának megismerése és alkalmas katalitikus modell kidolgozása céljából. Közismert, hogy az egyszerű kétatomos molekulák körében a hármas kötéssel összekapcsolt N2 molekula rendelkezik a legnagyobb disszociációs energiával (945 kJ/mol), így a nitrogénmolekula a legtöbb esetben inert gázként viselkedik. Az első dinitrogén molekulát tartalmazó komplexvegyületet is csak 1965-ben sikerült előállítani a viszonylag egyszerű [Ru(NH3)5N2]2+ formájában. Ma már több száz N2 molekulát tartalmazó komplexvegyület ismert, de a molekula jelentős mértékű aktiválását egyik esetben sem sikerült éredemben megvalósítani. Ez a felismerés méginkább fokozta azokat az erőfeszítéseket, amelyek a nitrogenáz enzim és a biológiai nitrogénfixálás megismerésére irányultak.

A biológiai nitrogénfixálás nagy energiaigényét az ATP hidrolízise szolgáltatja a 10.15. egyenlet szerint. A folyamatban tehát az ammónia mellett hidrogén is képződik. Az enzimatikus N2 fixálás egyébként eléggé lassú folyamat, a reakció ciklus-száma az 1/s nagyságrendben van. Szerkezeti jellemzőit tekintve a biológiai nitrogénfixáló enzim a vas mellett molibdént tartalmaz. A molibdéntartalmú nitrogenáz (α2β2)(γ2) két fehérje részből áll. A homodimer Fe-fehérje (γ2 alegység) egy ferredoxin-szerű (lásd a 7.1. fejezetet) [Fe4S4]2+/+ klaszter. Maga a Fe-fehérje két MgATP receptort is tartalmaz, mivel minden egyes szállított elektron 2 ATP hidrolízisével jár. Az alegység tehát az ATP hidrolízisét kapcsolja az elektrontranszfer folyamatokhoz. A másik komponens a dinitrogenáz, amely egy Fe-Mo fehérje, az (α2β2) tetramer, amely két igen speciális ?8Fe-7S? rendszert (Cys hidakkal kapcsolt két ?4Fe-4S? centrumot (P klaszter) és két FeMoco kofaktort (M klaszter) tartalmaz, melyek mindegyike MoFe7S8 sztöchiometriájú. Feltételezetten ez utóbbi a katalitikusan aktív hely. A P- és az M-klaszter szerkezetét a 10.8. ábrán mutatjuk be.

10.8. ábra: A nitrogenáz P klaszterének és M klaszterének (FeMoco kofaktor) szerkezete.

A MoFe7S8 klaszterben a két egymásra helyezett ?4Fe-4S? klaszter ([8Fe-8S] klaszter (lásd 7.1 fejezet), egyik vas atomját Mo helyettesíti, melynek oxidációs állapota +IV (redukált állapotban) és koordinációs szféráját a két S mellett „kívülről” egy His imidazol-N és egy kelátként koordinálódó homocitrát (R-2-hidroxi-1,2,4- butántrikarbonsav) telíti. A homocitrát pontos funkciója még nem ismert. A két M klaszter távolsága ?7 nm, míg az M és a P klaszterek közötti legkisebb távolság ?2 nm. A redukált Fe-fehérjétől átvett elektronok révén feltehetőleg a P klaszter összes vas ionja Fe(II)-vé redukálódik, és szabályozottan átadja elektronjait a FeMo kofaktornak. Bár a vélemények megoszlanak, tekintettel főként a Mo koordinatív telítettségére, feltételezhető, hogy inkább a centrális vasak, és nem a Mo a N2 kötési helye. A Mo szerepe feltehetőleg az, hogy koordinációjával csökkenti a klaszter szimmetriáját, ami a N2 lépcsőzetes redukciós folyamatában az elektrofil támadási lépéseket megkönnyíti.

A 80-as évek felfedezése, hogy a FeMo kofaktorban a Mo vanádiummal helyettesíthető. Mo távollétében és V jelenlétében V-függő nitrogenáz képződik. Ez utóbbi valamivel kisebb aktivitású, és a redukciós „energiának” 50%-a használódik el a H+ redukciójára (szemben a Mo-tartalmú enzimmel, ahol ez csak 25%), de a V-függő nitrogenáz alacsony hőmérsékleten (5 oC) hatékonyabb, mint a Mo-tartalmú társa. A legérzékenyebb heteroatom-mentes (csak Fe) nitrogenázok jellemzése még alig történt meg, aktivitásuk úgy tűnik alacsonyabb, mint akár a vanádium-, akár a molibdéntartalmú enzimé.

10.3. A hidrogenázok

A hidrogénmolekula egy újabb példája az élő szervezetekben is megjelenő és reakcióiban aktiválásra szoruló kismolekuláknak. A kétatomos H2 molekulában az atomokat egyszeres kötés tartja össze, a kötéstávolság 74 pm, a kötés disszociációs energiája 436 kJ/mol. Ez számottevően kisebb, mint az előző pontban tárgyalt nitrogén- molekuláé, de elég nagy ahhoz, hogy környezeti feltételek mellett a hidrogénmolekula se legyen nagyon könnyen felhasítható. A hidrogenáz enzimek redox fehérjék, melyek az élővilágban előforduló legegyszerűbb molekula, a dihidrogén képződését vagy elbontását katalizálják kételektronos reverzibilis folyamatban (10.16. egyenlet).

A hidrogenázok az evolúció időskáláján ősi enzimeknek számítanak. Elsősorban anaerob baktériumokban találjuk meg képviselőiket. A C. pasteurianum nevű baktérium pl. H2-t termel a cukrok fermentálása során. E folyamatban a cukrok oxidációjával párhuzamosan képződő redukált kofaktorok a protont hidrogénné redukálják. Ezzel ellentétben, pl. a metanogén baktériumok H2-t vesznek fel, és használják fel a CO2 metánná és más szénvegyületekké történő redukálására. A nitrogén-fixáló baktériumoknál a nitrogén megkötése során keletkezik hidrogén is, és a nitrogenáz enzim párhuzamos hidrogenáz funkciója révén, a H2 redukáló tulajdonságát kihasználva további nitrogén megkötése válik lehetségessé (lásd 10.2. fejezet). Az anaerob szervezetekben a hidrogenázenzimeknek jelentős szerepük van a redukciós folyamatokban (pl. nitrogén fixálás, szulfát-redukció, mikrobiális foszforiláció, vagy metán szintézise), ill. az anaerob életforma O2 elleni védekezésében.

A hidrogenázok azonban nemcsak az anaerob baktériumok alkotóelemei, aerob baktériumokban, fotoszintetizáló algákban és eukarióta szervezetekben is megtaláljuk képviselőiket. A H2 biológiai energiaforrásként is szerepelhet pl. a NADH helyett. Egyes aerob baktériumokban a 10.17. reakció szabályozott körülmények között történő lejátszódása lehetővé teszi a felszabaduló energia biológiai hasznosítását. Bizonyos hidrogenázok reverzibilisen működnek, míg mások a H2 egyirányú felvételét katalizálják. Csoportosíthatjuk őket aszerint is, hogy a sejtmembránhoz kötötten, vagy a citoplazmában találhatóak. Az előbbiek által a H2 oxidációja során generált elektronok és protonok a légzési láncban az O2 redukcióját, ill. nagy energiájú foszfátok szintézisét segítik elő, az utóbbiak pedig a NAD+ redukciójában vesznek részt.

A hidrogenázok izolálása a levegővel szemben mutatott érzékenységük vagy a membránhoz való kötöttségük miatt meglehetősen bonyolult. A hidrogenáz-enzimek általában közepes méretű fehérjék (Mr = 40 100). A különböző hidrogenázokban jelentős aminosav-sorrend hasonlóság fedezhető fel, különös tekintettel a cisztein aminosavak helyzetére. A legtöbb hidrogenáz tartalmaz Fe/S centrumo(ka)t. Több esetben a Fe/S klaszterek (lásd 7.1. fejezet) mellett nikkelion is található a molekulában. Fémtartalmuk alapján a hidrogenázokat két csoportba sorolják: vas-hidrogenázokra és a nikkel-vas hidrogenázokra.

10.4. A CO, CO2 és CH4 bioszervetlen kémiája

A szén körforgásának egyik alapvető eleme a szerves anyagok anaerob baktériumok által történő lebontása. E folyamatok végső termékei az egyszerű, egy szénatomot tartalmazó (C1) vegyületek, melyek között a CO2 a legnagyobb, a CH4 pedig a legkisebb oxidációs állapotot képviseli. Míg egyes baktériumok a szerves anyagokat hidrogénné, szén-dioxiddá, formiáttá, acetáttá alakítják, addig a metanogén baktériumok ezekből metánt állítanak elő. A fenti baktériumokban játszódik tehát le a C1 reakciók döntő többsége. Az utóbbi időkben e folyamatok tisztázása során jónéhány különleges biokémiai reakciólépésre derült fény, és számos új enzimet, ill. kofaktort fedeztek fel.

A CO2 redukciója metánná a 10.18. bruttó kémiai egyenlettel jellemezhető. Ez a reakció a valóságban azonban meglehetősen bonyolult. A négy hidrogénmolekula természetesen a hidrogenázenzimek hatására, mint 8e és 8H+ kerül be a folyamatba. Az élő szervezetekben pedig a többelektronos redukció a nagyobb sebesség és hatékonyság, valamint a folyamat szabályozhatósága érdekében mindig több (lehetőleg egyelektronos) lépésben megy végbe. A folyamat részlépéseinek többségét metalloenzimek katalizálják. Ezen metalloenzimek körében a már korábban is részletesen tárgyalt vas-kén fehérjék (7.1. fejezet), ill. a később ismertetendő molibdén és kobalttartalmú koenzimek (11.3. és 13.2. fejezetek) mellett két, szerkezetileg és funkciójában is nagyon érdekes nikkeltartalmú enzim található: a metil-koenzim M reduktáz és az acetil-koenzim A szintáz. A továbbiakban ezen két enzim/kofaktor rövid ismertetésével foglalkozunk.

10.4.1. A metil-koenzim M reduktáz

A metil-koenzim M reduktáz enzim bonyolult felépítésű, érzékeny metalloprotein. 2x3 alegységből áll, Mr ~ 68, 47, ill. 38 kDa alegységenként. A természetes enzimből két ekvivalensnyi kis molekulatömegű sárga színű (F430) kofaktor izolálható, mely nevét fényelnyelési maximumának hullámhosszáról kapta. A sárga szín egy hidrokorfin vázba épült síknégyzetes elrendezésű Ni(II)-ionnak tulajdonítható (10.9. ábra). A tetrapirrol nikkel komplex szerkezetét NMR spektroszkópiával nagymértékben hidrogénezett porfin rendszerként írták le (hidrokorfin - összekötő láncszem a tetrapirrolok evolúciójában a porfirinek és a korrinok között), anellált δ-laktám és ciklohexanon gyűrűkkel. Jelentős szerkezeti mozgékonyság jellemzi, így mind a kisspinszámú (S = 0) Ni(II) (oxidált forma), mind a d9 konfigurációjú Ni(I) (redukált forma) állapotú fémiont képes koordinálni, annak ellenére, hogy a két esetben a Ni N távolságok lényegesen különböznek (190, ill. 200 pm). A koenzim működésének érdekessége, hogy a katalitikus ciklus során a Ni(III) oxidációs állapot, mint átmeneti termék létezését is feltételezik.

10.9. ábra: Az F430 koenzim sematikus szerkezete.

10.4.2. CO dehidrogenáz = CO oxidoreduktáz = Acetil CoA szintáz

E fejezetben egy összetett, két fontos katalitikus funkcióval bíró enzimet mutatunk be. Az enzim komplex volta az elnevezésében felmerült bizonytalanságban is tükröződik. A CO dehidrogenáz elnevezés abból adódik, hogy, bár a szén-monoxidból nem lehet hidrogént elvonni, a biológiában a dehidrogénezési és az oxidációs folyamatok gyakran egymás szinonímáiként használatosak. Valószínűleg helyesebb lenne a CO oxidoreduktáz elnevezés. Azonban az enzim tanulmányozása során kiderült, hogy az további funkcióval is rendelkezik, és emiatt javasolták az acetil-koenzim A szintáz elnevezést. A szakirodalomban ezen elnevezések gyakran keverednek.

A szén-monoxid dehidrogenáz funkciót ellátó rész a 10.19. reakciót katalizálja. A másik reakciót, az acetil-koenzim A szintézisét a szintáz funkció teszi lehetővé korrinoid proteinekkel (metil transzferáz, ld. 13. fejezet), valamint Fe/S tartalmú diszulfid reduktázokkal együttműködve (10.20. egyenlet).

Az ilyen, meglehetősen különlegesnek látszó enzimek nagy valószínűséggel az evolúció korai szakaszaiban képződtek, és a fejlődés során többféle szervezet is felhasználta azokat. Így pl. az első autotróf élőlények, az anaerob acetogén baktériumok a CO, ill. CO2 felvétele és aktivált acetilcsoportokká történő alakítása során, ill. a metanogén archae baktériumok az ecetsav CO2-dá és metánná történő fermentációja során.

A C. thermoaceticum acetogén baktérium enzime az egyike a legrészletesebben vizsgáltaknak, azonban egyértelmű szerkezet még ebben az esetben sem áll rendelkezésünkre. Az enzim (αβ)x formában dimer fehérjealegységekből áll, ahol egy-egy α vagy β egység molekulatömege kb. 60 80 kDa. Dimerenként tizenkét vasiont tartalmaz három Fe4S4 klaszter formájában, melyek közül kettőhöz nagyspinszámú Ni(II)-ion is kapcsolódik ligandumhídon keresztül, valamint Zn(II)-ionok jelenlétét is kimutatták.

A másik katalizált reakció mely az előző funkciótól nem választható el, az acetil CoA szintézise CoA jelenlétében. A feltételezett reakciómechanizmus a 10.10. ábrán látható.

10.10. ábra: Az acetil-koenzim A szintáz enzim feltételezett működési mechanizmusa.

A C. hydrogenoformans baktérium a CO-t használja fel egyedüli szén-, és energiaforrásként. E baktérium genomjában a CO-dehidrogenáz, az acetil-CoA szintáz, egy kobalttartalmú korrinoid Fe/S fehérje és egy metiltranszferáz enzim génjei egymáshoz szoros közelségben találhatók, ami alátámasztja ezen fehérjék együttműködését. A baktérium CO jelenlétében a koenzim A szintáz fehérjét, míg kevés CO jelenlétében a koenzim A szintáz/CO dehidrogenáz fehérjekomplexet termelte. A koenzim A szintáz fehérjét újonnan sikerült kristályos formában kinyerni, és a röntgen-diffrakciós mérések alapján a 10.11. ábrán látható szerkezeteket határozták meg.

10.11. ábra: A C. hydrogenoformans acetil-koenzim A szintáz enzimének röntgen-diffrakció alapján meghatározott szerkezete (A) és az aktív központ sematikus ábrázolása néhány kiválasztott kötéstávolságot Å-ben feltüntetve [V. Svetlitchnyi, H. Dobbek, W. Meyer-Klaucke, T. Meins, B. Thiele, P. Römer, R. Huber and O. Meyer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 446 451].

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Az oxigenázok jelentősége és a citokróm P450 működési mechanizmusa.

- A réz lehetséges szerepei a biológiai oxidációs folyamatokban.

- A peroxidion koncentrációját „szabályozó” enzimek.

- A szuperoxid dizmutázok típusai és szerkezeti jellemzői

- A CuZn-szuperoxid dizmutáz enzim működése és szerkezeti jellemzése.

- A molibdén lehetséges szerepe biokémiai folyamatokban.

- A nitrogenáz enzim jelentősége és szerkezete.

- A hidrogenázok jelentősége és szerkezeti típusai.

- A szén-monoxid és a metán bioszervetlen kémiája.

Chapter 11. 11. EGYÉB REDOXI ENZIMEK A BIOLÓGIAI FOLYAMATOKBAN

Kulcsszavak: vas-fehérje kölcsönhatás, molibdén, szerves kofaktor, szerves gyökök, DNS szintézis, sztereoszelektivitás, nagytávolságú elektrontranszfer, metanotróf baktériumok, FeIV-oxo átmeneti forma, oxigénatom-transzfer

Az alábbiakban néhány olyan, redoxi funkcióval bíró enzimet mutatunk be, melyeket valamilyen különleges sajátságuk miatt nem soroltunk be az előző fejezetek egyikébe sem. Ilyen tulajdonságok, pl. az aktív központ felépítése, a reakció mechanizmusa, szerves kofaktorok részvétele a katalizált reakcióban, vagy a szubsztrátum tulajdonságai.

11.1. A nukleotidok átalakítása: a ribonukleinsav reduktáz enzimek

A ribonukleotid reduktáz (RR) enzimek ribonukleotidok redukciója során a DNS szintéziséhez szükséges dezoxiribonukleotidokat állítják elő, melyek koncentrációaránya igen fontos a DNS szintézis hibátlan megvalósulásához. Ezért ezen enzimek működését a szervezet szigorúan szabályozza. E szabályozás egyik eleme pl., hogy az egyes dezoxi-ribonukleotidok (pl. dATP) allosztérikus kötődése elősegíti más dezoxiribonukleotidok (dTTP és dCTP) képződését. A legtöbb RR enzimben az aktív központ mellett tehát egy specificitást és egy aktivitást meghatározó allosztérikus kötőhelyet is találunk.

Ezt az alapvető folyamatot minden esetben fémion-tartalmú enzimek katalizálják. A fém-kofaktorok alapján a RR-ok három fő alosztályát különböztetjük meg (egyes baktériumban mangántartalmú enzimet is megfigyeltek):

I. alosztály: A fehérje oldallánchoz kötött kétmagvú vascentrum (fejlettebb élőlényekben);

II. alosztály: B12 koenzimet igénylő enzim (baktériumokban);

III. alosztály: Fe/S tartalmú enzim (anaerob jellegű baktériumokban).

Minden RR enzim közös mechanizmus szerint katalizálja a reakciót. Első lépésként egy szabadgyök jön létre, ami a legújabb eredmények szerint valószínűleg egy ciszteinil gyök. A szubsztrát átalakulását e gyök iniciálja, méghozzá úgy, hogy a 3'-szénatomról hidrogénatomot szakít le. Ezután történik meg a 2'-OH leszakadása a gyökös átmeneti termékről víz formájában, majd a gyök redukciója dezoxiribonukleotiddá egy elektrondonor-csoport oxidációjával párhuzamosan. A reakció javasolt mechanizmusát a 11.1. ábra mutatja be. Az ábrán jól látható, hogy ez az elektrondonor csoport az I. és II. típusú RR enzimekben egy ditiol, míg a III. típusúaknál a hangyasav.

11.1. ábra: A RR enzimek működési mechanizmusának sematikus ábrázolása.

Az is megfigyelhető, hogy egy savas jellegű fehérje oldallánc elősegíti a reakció lejátszódását, míg a fémionok közvetlenül a katalizált reakcióban nem vesznek részt, csak a ciszteinil gyök generálásában.

11.2. ábra: (A) I, ill. (B) III. csoportba tartozó bakteriális RR enzimek aktív helye röntgendiffrakciós mérések alapján.

A 11.2. ábrán feltüntetett enzimek aminosav sorrendje nem mutat jelentős hasonlóságot, de az aktív központ szerkezete lényegében megegyezik: 10 β-redőzött részlet hoz létre egy üreget, melynek a közepébe egy cisztein aminosavat is tartalmazó hurok nyúlik. Ugyanilyen szerkezetet találtak az első II. típusú kristályos enzim központjában is. Az A ábrarészleten a GDP, mint szubsztrát elhelyezkedése azt is mutatja, hogy a (C439) ciszteinből képződik a reakciót iniciáló szabadgyök. Az elrendeződés a reakció sztereoszelektivitását is biztosítja, azaz megakadályozza a 2' C atom racemizációját. A B ábrarészleten a C439-hez hasonló helyzetű C290 cisztein képez gyököt. Itt a további elektrondonor redoxi partner a hangyasav (11.1. ábra).

Az RR enzimek I. csoportjába tartozó vastartalmú ribonukleotid reduktázok kétmagvú vascentrumot tartalmaznak. Az oxidált formájú enzimben a két nagyspinszámú Fe(III)-iont egy oxo és egy glutamáto ligandum köti össze kb. 3,3 Å távolságban (11.3. ábra).

11.3. ábra: Az E. Coli vastartalmú ribonukleotid reduktáz enzimének kétmagvú vascentruma.

A kétmagvú központtól mintegy 5 Å távolságban egy tirozilgyök található. A gyök kioltása az enzim működésének megszűnését vonja maga után, ami azonban reverzibilisen visszaállítható a vasionok redukciója és O2 hozzáadása révén. A redukált Fe(II)-Fe(II) formájú vasközpont O2-t képes megkötni (oxo-híd formájában), miközben Fe(III)-Fe(III) formává oxidálódik, valamint a tirozilgyök is újraképződik (11.1. egyenlet).

Ez a gyök azonban meglehetősen távol van (kb. 35 Å) a szubsztrátkötő helytől, ami azt valószínűsíti, hogy nem közvetlenül vesz részt a reakcióban, hanem nagytávolságú elektrontranszfer folyamat révén áttételesen generálja az aktív ciszteinil gyököt. A 11.2. A ábrán látható szerkezet alapján feltételezik, hogy e folyamatban az Y730 és Y731 tirozin oldalláncok közvetítőként szerepelnek.

Érdemes megjegyezni, hogy a III. típusú enzim szerkezetében a Fe/S centrum által generált glicil-gyök (amit a 11.2. B ábrán egy G580A helyettesítéssel a kristályosíthatóság céljából alaninra cseréltek) 3-5 Å távolságban található az aktív cisztein oldallánctól. Ugyanez igaz a II. típusú RR enzimekben a korrinoid kofaktor (B12 származék, ld. 13. fejezet) által létrehozott gyökre is.

11.2. A metán monooxigenáz

A metanotróf baktériumok a metánból építik fel a szerves anyag készletüket, és ez az egyetlen energiaforrásuk. E folyamatok első lépése a metán oxidációja metanollá, ami gyakorlatilag a RR enzimek által végrehajtott O atom elvonásnak a fordított folyamata. Kevés olyan enzim ismeretes, mely a nehezen reakcióba vihető, apoláros, nagy kötési energiájú és nem koordinálódó alkánokat oxidálni képes. A 11.2. reakciót a metán-monooxigenáz (EC 1.14.13.25) katalizálja. A metán-monooxigenázok oldható (sMMO), ill. sejtmembránhoz kötött (pMMO) családjait ismerjük.

Az oldható metán monooxigenáz (sMMO) egy háromkomponensű enzim, mely egy hidroxiláz (MMOH), egy kofaktor nélküli fehérje (MMOB) és egy Fe2S2 és FAD tartalmú reduktáz (MMOR) alkot. A reakcióhoz szükséges 2 elektront egy NADH biztosítja. Az elektronokat a reduktáz (MMOR) részben előbb a FAD, majd a Fe2S2 rész veszi át, és továbbítja az MMOB fehérjén (szabályozó szerep) keresztül a hidroxiláz (MMOH) rész felé, ahová az elektronok csak a szubsztrát megkötődés után jutnak el, megakadályozandó a fehérje roncsolódását. A dioxigén, ill. a szubsztrát kötése és aktiválása a hidroxiláz rész feladata. E fehérje aktív központja kétmagvú nem-hem típusú vaskomplex, melyben a vasionokat karboxilát-híd köti össze kb. 3,5 Å távolságban. Valószínűsíthető, hogy a vasionok Fe(IV)-oxo átmeneti formában aktívak. (ld. citokróm P450 - 10. fejezet).

A reakció lejátszódásához az O2, ill. a metán egyidejű megkötődésére van szükség, egyébként a fehérjemolekula maga is oxidálódhat. A MMOH α-alegységben három hidrofób üreget találtak egy az aktív helyhez vezető csatornában. Az 1-es számú üreg magát az aktív helyet tartalmazza. Ezt a 2-es számú üregtől egy változó konformációjú leucin oldallánc, mint egy „kapu” választja el. A 2-es és 3-as üregekben alkánok kötődhetnek meg, mutatván, hogy ez a hidrofób csatorna a szubsztrátum útja az aktív központ felé. A reakció mechanizmusát a 11.4. ábra mutatja.

11.4. ábra: A sMMO enzim működési mechanizmusának sematikus ábrázolása.

Az MMOB jelenlétében az MMOH komponens megköti a dioxigén molekulát, és sorozatos lépésekben Fe(III)Fe(II))-szuperoxo, Fe(III)Fe(III)-peroxo, majd Fe(IV)Fe(IV)-oxokomplexeket képez. Ez utóbbi állapot képes a metán metanollá alakítására, miközben Fe(III)Fe(III)-OH forma alakul ki belőle, melyet azután az MMOR enzim redukál vissza a Fe(II)Fe(II) állapotba.

A metán-monooxigenázok egy másik családja a sejtmembránhoz kötötten fordul elő (pMMO). Ezen fehérjék Cu(II)-ionok jelenlétében képződnek, és a metán oxidációjában nagyobb részt vállalnak, mint az oldható enzimek. Aktív központjukban rézionokat tartalmaznak a citokróm-C-oxidáz enzimhez hasonló elrendezésben. Bár ez az enzimcsalád sokkal több metanotróf baktériumban fordul elő, mint membránprotein, izolálása, és ezért tanulmányozása is nehéz. Maga az enzim egy 300 kDa molekulatömegű trimer α3β3γ3 összetétellel (11.5. ábra). A cinkionok szerepe valószínűleg a szerkezet stabilizálása. Működéséről, valamint a természetes elektrondonorokról és az elektrontranszport folyamatról ma még nagyon keveset tudunk.

11.5. ábra: A sejtmembránhoz kötött metán-monooxigenázok egyik képviselőjének kristályszerkezete (PDB kód: 1YEW).

11.3. Oxotranszferáz enzimek

A dioxigén molekula egyik vagy mindkét oxigénatomjának a szubsztrátumba történő beépülését az oxigenáz enzimek katalizálják (ld. 9. fejezet). Az ilyen folyamatokat többnyire vas (pl. citokróm P-450, v. MMO), ill. réztartalmú (pl. tirozináz) enzimek katalizálják. Az oxigénatom-transzfert katalizáló enzimeknek egy másik nagy csoportja molibdén jelenlétét igényli a működéshez.

A molibdén a 4d átmenetifémek közül az egyedüli létfontosságú elem. Ez minden bizonnyal annak tudható be, hogy bár az elem a földkéregben meglehetősen ritka, a tengervízben viszonylag könnyen hozzáférhető a vízoldható MoO42 -ion formájában. A felszívódását elősegítheti a létfontosságú szulfátionhoz való hasonlósága is. Ezen baktériumok némelyike pl. a CO2 redukcióját a szulfidionok oxidációjával kapcsolja össze a napfény energiájának hasznosítása során, mely folyamat a fotoszintézis ősének tekinthető (8. fejezet). Érdemes még megemlíteni, hogy ugyanakkor, pl. a 3d homológ kromátion (CrO42 ) viszont erélyes oxidálószer, ezért fiziológiás körülmények között instabilis és mérgező.

A molibdén további különlegessége abban rejlik, hogy a négyes és hatos oxidációs állapotok között reverzibilis kételektronos folyamatokban (11.3. egyenlet) vehet részt (

0,300 V). Az oxidion átadással egyidejűleg az elektronok átvétele formálisan oxigénatom transzfernek tekinthető. Ilyen folyamatokat segítenek elő pl. a xantin oxidáz, szulfit-oxidáz, aldehid oxidáz, arzenit oxidáz, nitrát reduktáz, formiát dehidrogenáz, dimetil-szulfoxid dehidrogenáz, trimetilamin-N-oxid reduktáz, biotin-szulfoxid reduktáz (H vitamin képződés) enzimek. A dehidrogenáz, ill. reduktáz enzimek természetesen az oxigénatom szubsztrátumból történő elvonását katalizálják.

A Mo-tartalmú oxotranszferázok mind ugyanazzal a kofaktorral aktiválhatóak. E Mo-kofaktorban a molibdén egy szubsztituált pterin molekulához kötődik (11.6.ábra) annak kén donoratomjain keresztül. (Ez a kofaktor nem keverendő össze a nitrogenáz enzimmel kapcsolatban említett Fe-Mo tartalmú kofaktorral (10. fejezet).) Az X ligandum a különböző enzimekkel együttműködő Mo-kofaktorokban S vagy O donoratom lehet.

11.6. ábra: A molibdopterin kofaktor sematikus szerkezete.

A pterin szerepe: (i) részt vehet az elektrontranszport folyamatokban, (ii) a molibdén tárolása, valamint szállítása az enzimekhez, ill. beépítése az aktív központba. Az utóbbi e kofaktor nélkül nehézkes lenne, a Mo ugyanis vizes oldataiban nem koordinálódó oxoanionjai formájában fordul elő.

Két részletesebben tanulmányozott példán keresztül mutatjuk be az enzimek működését.

A xantin oxidázt elsőként tehéntejből izolálták. A dimer fehérje mindkét alegysége egy molibdént, egy FAD molekulát és két Fe2S2 központot tartalmaz. A Mo körül három S, ill. egy O donoratom található. 18O-nel jelzett kísérletek arra utaltak, hogy a szubsztrátba, a fémionhoz kötődő oxocsoport épül be, vagyis az oxigén nem a molibdén által aktivált oldószermolekulából származik. A reakció során a Mo oxidációs állapota VI-ról IV-re változik, ESR vizsgálatokkal sikerült Mo(V) köztiterméket is kimutatni.

A szulfit oxidáz dimerje monomer egységenként a Mo kofaktor mellett egy-egy hemet is tartalmaz. A katalizált reakció javasolt mechanizmusát a 11.7. ábra szemlélteti. Az enzim a szulfit oxidációját a két molekula citokróm c redukciójával köti össze.

11.7. ábra: A szulfit oxidáz enzim működésének javasolt mechanizmusa.

11.4. Az alkohol dehidrogenáz enzimek

A primer alkoholok metabolizmusának első lépése azok oxidációja aldehiddé, amit a cinktartalmú alkohol dehidrogenáz (ADH) enzim katalizál. Az aldehideket ezután aldehid oxidázok alakítják tovább karbonsavakká. Az alkoholokat gyártó, vagy lebontó enzimeknek különleges jelentőségük van kérődző állatok, vagy az erjesztő (mint pl. az élesztő) mikroorganizmusok részére, de az alkoholokat az emberi szervezetben is a fent említett ADH enzim alakítja át. Míg a metanol az ADH hatására lassan alakul át - innen az erős idegméreg jellege - addig a hosszabb láncú alkoholok gyorsabban. Viszont az aldehidek továbbalakítása meglehetősen lassú folyamat, ami pl. egy mámoros nap utáni „másnaposságot” eredményezi. A több mint 20 ismert ADH izoenzim különböző sebességgel oxidálja az alkoholokat.

A lómájból izolált alkohol dehidrogenáz két azonos alegységből álló dimer (2×40 kDa). Alegységenként két-két cinkiont tartalmaz. A katalitikus aktivitással bíró fémközpontot a fehérjéhez egy hisztidin és két ciszteinát oldallánc kapcsolja (melyek a fémion bruttó töltéssemlegességét biztosítják). A negyedik koordinációs helyen vízmolekula található. A másik cinkiont négy hisztidin oldallánc veszi körül, ez a fémion nem vesz részt a katalitikus folyamatban - valószínűleg szerkezetalakító hatása van.

Mivel a Zn(II) nem vesz részt redoxi folyamatokban, a 11.4. reakció lejátszódásához szükség van egy koenzimre is a NAD+/NADH rendszer formájában. A fémion szerepe a szubsztrátmolekula megkötése, orientációja, valamint elektrosztatikus aktiválása. A koenzim megkötése után az enzim konformációja ún. zárt formába alakul át. A szubsztrátmolekula egy hidrofób csatornán keresztül jut az aktív központba ahol deprotonálódással egyidejűleg a cinkion koordinációs szférájában lévő vizet helyettesíti. Az így képződő bruttó negatív töltés (a cinkkomplex semleges volta miatt) egy formális hidridion-transzfer folyamatot segít elő.

Mind a szubsztrátmolekula, mind pedig a NAD+ egyidejűleg többféle kölcsönhatásba lép az enzimmel, és ez a többpontos kötődés szigorú térbeli elrendeződést biztosít (11.8. ábra), azaz a lejátszódó reakció sztereospecifikusságot mutat.

11.8. ábra: Az Pseudomonas aeruginosa ADH enzimének szerkezete ill. a NADH kötőhelye.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Hogyan szabályozzák a ribonuklotid-reduktázok a képződő különböző dezoxiribonukleotidok arányát?

- Milyen fémtartalmú kofaktorok találhatók a ribonuklotid-reduktázokban?

- Mi a szerepe a fémionoknak az RR enzimekben?

- Mire használják a metanotróf baktériumok a metánt?

- Milyen komponensekből épül fel az oldható metán monooxigenáz, és milyen fémiont tartalmaz?

- Milyen oxidációs állapotokban található a vas a metán monooxigenáz hidroxilázban a katalizált reakció során?

- Mi a hidroxiláz rész feladata az oldható metán monooxigenázban?

- Mi a reduktáz rész feladataaz oldható metán monooxigenázban?

- A dioxigén molekula egyik vagy mindkét oxigénatomjának a szubsztrátumba történő beépülését az oxigenáz enzimek katalizálják. Milyen fémionokat tartalmazhatnak ezek az enzimek? Soroljon fel egy egy példát a különböző fémiontartalmú oxigenáz hatású enzimekre!

- Milyen enzimek kofaktora a Mo-kofaktorban, melyben a molibdén egy szubsztituált pterin molekulához kötődik?

- Milyen oxidációs állapotokban szerepelhet a szulfit-oxidáz enzim által katalizált reakció során a molibdén?

- Milyen fémiont tartalmaz az alkohol dehidrogenáz? Mi a szerepe a fémionnak? Hogyan lehetséges redoxi reakció katalízise?

Chapter 12. 12. A METALLOHIDROLÁZOK

Kulcsszavak: hidrolitikus reakció, Lewis sav, szénsavanhidráz, DNS, RNS, foszforán köztitermék, S N 2 mechanizmus, foszfatáz, forszforsav-diészteráz, nukleáz, ping-pong mechanizmus, kétszeres Lewis-sav aktiválás, β-laktám antibiotikum rezisztencia, ribozim.

A hidrolitikus reakciók jelentős szerepet töltenek be a biológiai folyamatok minden szintjén. A metallohidrolázok leggyakrabban Zn(II) és Mg(II)-ionokat tartalmaznak, mellettük csak a Ca(II)-ionnak jut jelentősebb szerep. E fémionok egyrészt könnyen hozzáférhetőek, másrészt kedvező kémiai sajátságokkal rendelkeznek. Közülük is kiemelkedő a Zn(II) a következő tulajdonságai miatt:

(i) redoxi szempontból inert,

(ii) erős Lewis-sav,

(iii) erős koordinatív kötéseket alakít ki,

(iv) telített d-pályái miatt a kristálytér stabilizációs energia megjelenésével nem kell számolni, így koordinációs száma és geometriája könnyen megváltoztatható.

A Mg(II) és Ca(II) ionok gyengébb Lewis savak, és a Zn(II)-nél kisebb stabilitású koordinatív kötések kialakítására képesek, azonban e hátrányokat ellensúlyozza nagyobb biológiai hozzáférhetőségük. A Zn(II)-hez hasonlóan a Ca(II)-ionnak sincs kitüntetett stabilitású koordinációs geometriája. Ugyanakkor a Mg(II)-ion a szabályos oktaéderes szerkezetet részesíti előnybe. Ezért a Mg(II)-tartalmú hidrolázokban a fémion a fehérjéhez való kötődés során csak részben veszti el hidrátburkát.

A 12.1. táblázatban néhány példát mutatunk be a hidrolitikus enzimekre. Ebből jól látható, hogy a fentiektől eltérő fémionok közül a Mn(II) (melynek félig betöltött d-pályái a Zn(II)-hez nagyon hasonló sajátságokat eredményeznek), Fe(III) és Ni(II) is előfordulhat a metallohidrolázok aktív központjában, melyek inkább a szabályt erősítő kivételnek számítanak.

12.1. táblázat: Néhány példa fémion(ok) által aktivát hidroláz enzimekre.

A hidrolázok szubsztrátjai igen különbözőek: makromolekulák és kis molekulatömegű vegyületek egyaránt megtalálhatóak közöttük. A továbbiakban ezen szubsztrátok szerint fogjuk a metallohidrolázokat tárgyalni.

12.1. A szénsavanhidráz

Elsőként a szénsavanhidráz nevű enzimet tárgyaljuk, kiemelve, hogy ez az enzimek szisztematikus besorolása szerint nem a hidrolázok, hanem a liázok csoportjába tartozik (EC 4.2.1.1). Viszont a katalizált reakció mechanizmusa alapvetően a hidrolázokhoz teszi hasonlóvá. A szénsavanhidráz a szén-dioxid hidratálását katalizálja (12.1. egyenlet).

A szén-dioxid a fotoszintézis kiinduló vegyülete, valamint terméke a katabolizmus reakcióinak. Így ez az enzim rendkívül fontos szerepet tölt be az élő szervezetekben. A szén-dioxid közismerten viszonylag rosszul oldódik vízben. Ezért a légzés során keletkezett szén-dioxid 80 %-át hidrogén-karbonátként szállítja a vér a tüdőbe (a maradék 20 % CO2-t a hemoglobin szállítja, 9. fejezet). Mind a hidrogén-karbonát képződését mind az ellenkező irányú reakciót (a tüdőben) a szénsavanhidráz katalizálja. A katalizált reakció továbbá a protonkoncentráció szabályozásában is lényeges szerepet tölt be. Az emberi szervezetben a legismertebb formája a humán szénsavanhidráz II (12.1. ábra).

12.1. ábra: A humán szénsavanhidráz II és aktív központjának sematikus szerkezete.

A szénsavanhidráz II molekulatömege kb. 30 kDa, és molekulánként egy Zn(II)-iont tartalmaz. A fémion tetraéderes környezetben található, három imidazolgyűrű és egy vízmolekula veszi körül (12.1. ábra). Az enzim működésének kulcslépése a fémionhoz kötött vízmolekula deprotonálódása (12.2. ábra). A cink Lewis-sav jellege (elektronpár-vonzó sajátsága) révén a víz oxigénjének egyik nemkötő elektronpárját magához vonzva csökkenti az O-H kötés erősségét. A kialakuló Zn-OH egység egy közeli treonin (Thr-199) hidroxilcsoportjával H-kötést kialakítva stabilizálódik (12.2. ábra). Ez a folyamat 6,8-as pKs értékkel jellemezhető, azaz a fémionhoz kötött víz pK-ja több mint 7 logaritmus egységgel csökken a szabad vízmolekulához képest.

12.2. ábra: A humán szénsavanhidráz működésének sematikus ábrája.

A szén-dioxid megkötődését az aktív központ közelében a Val-121, Val-143, Leu-198 és Trp-209 aminosavak oldalláncai által kialakított hidrofób 'zseb' segíti elő (12.2. ábra). A mechanizmus következő lépése pedig a cinkionhoz kötött hidroxidion nukleofil támadása a szubsztráton. A Zn(II)-ion további szerepe, hogy a negatív töltéssel bíró átmeneti állapotot stabilizálja. Az utolsó lépésben képződő hidrogénkarbonát már nem alakít ki H-kötést környezetével, így könnyen távozhat az aktív központból.

A reakció sebességmeghatározó lépése a cinkhez kötött hidroxidion újraképződését eredményező protontranszfer. A cink Lewis-sav jellegét elsősorban a hozzá kötődő ligandumok határozzák meg. A kristályszerkezet alapján a koordinálódó imidazolgyűrűk térbeli helye H-hidas kölcsönhatások révén rögzített. Ezen H-kötések közül egy-egy megszűnése 1-2 nagyságrenddel csökkenti a fehérje cinkhez való affinitását valamint az enzim aktivitását, ill. egy nagyságrenddel növeli a cinkhez kötött víz pK-ját.

A natív enzim kb. 7-8 nagyságrenddel gyorsítja fel a katalizált reakció sebességét fiziológiás körülmények között. Figyelembe véve, hogy jelen esetben már a nem katalizált reakció is viszonylag gyors (k ~ 0,1 s-1) a szénsavanhidráz egyike azon kevés enzimeknek, melyek katalitikus hatékonysága közelít a diffúziógátolt határértékhez.

12.2. Foszforsavészterek enzimatikus hidrolízise

A foszforsav-észterázok a foszforsavészter-kötések hidrolitikus hasításáért felelős enzimek. Beszélhetünk foszforsav-monoészterázokról (foszfatázok), ill. foszforsav-diészterázokról. A legtöbb biomolekulában a foszforsavészter kötés kinetikailag inert. Pl. egy DNS molekula félélettartama fiziológiás körülmények között 100000 és néhány milliárd év, míg az RNS félélettartama 10-100 év között változik. Ez a genetikai információ megőrzése szempontjából létfontosságú az élő szervezetek számára. Ugyanakkor sok esetben szükség lehet a nukleinsavak lebontási folyamataira is, pl. az idegen vírusok elleni védekezésben, az esetlegesen mégiscsak bekövetkező mutációk korrekciójában, vagy a már szükségtelen DNS, RNS lebontása során.

A foszforsavészterek enzimatikus hidrolízise SN2 mechanizmust követ, melyben a nukleofil reaktáns, a legtöbb esetben hidroxidion. Köztitermékként egy trigonális bipiramisos foszforán alakul ki, majd lehasad a távozó csoport (12.3. ábra).

12.3. ábra: A foszforsav-diészterek katalizált hidrolízisének vázlatos mechanizmusa.

E folyamatokhoz az élő szervezetek rendkívül hatékony enzimeket fejlesztettek ki, melyek többsége fémion(ok) által aktivált enzim. A fémion(ok) szerepe a foszforsavészterek hidrolízisében általában:

(i)a szubsztrát elektrosztatikus aktiválása koordináció révén (Lewis-sav aktiválás), ami a P O kötés polarizálódását, azaz a foszforatomon mérhető parciális pozitív töltés növekedését eredményezi, megkönnyítve ezzel a nukelofil reaktáns támadását

(ii) a nukleofil reaktáns (többnyire hidroxidion) kialakítása

(iii)a foszforán intermedier stabilizálása koordináció és töltéskompenzáció révén

(iv)a távozó csoport stabilizálása koordináció révén

(v)többmagvú aktív központok esetén a fémionok fenti feladatok ellátásában együttműködhetnek, ill. megoszthatják azokat egymás között.

12.2.1. Foszforsav-monoészterázok

A biomolekulák reverzibilis foszforilációja a sejtfunkciók szabályozásának egyik legfontosabb mechanizmusa. A különböző foszforsav-monoészteráz (foszfatáz), ill. kináz enzimek segítik a metabolitok helyes egyensúlyának fenntartását (pl. glukóz oxidációja, glikogén formájában történő tárolása, aminosavak bioszintézise, a nukleozidok aktiválása a fehérjék, ill. nukleinsavak felépítéséhez). Erre a foszfátcsoportnak az aminosav oldalláncokétól eltérő kémiai sajátságai adnak lehetőséget: a foszforsav-monoészter két negatív töltéssel bír fiziológiás pH-n, így erős elektrosztatikus vagy hidrogén-hidas kötésekkel képes a fehérjelánc különböző részeit összekötni.

A foszforsav-monoészterázok aktív központjában leginkább többmagvú fémion-centrum található. Működési mechanizmusuk sok részletben eltér egymástól. A következőkben két jellegzetesen eltérő mechanizmus kerül bemutatásra.

Az alkalikus foszfatázok

Az alkalikus foszfatázok egyrészt a foszforsav-monoészterek hidrolízisében, másrészt a foszforilcsoport átadásában (transzferében) vesznek részt. Maximális aktivitásukat lúgos körülmények között, pH 9-10-nél érik el. Az E. coli-ból izolált alkalikus foszfatáz homodimer enzim, mindkét aktív központjában két Zn(II) és egy Mg(II) ion található (12.4. ábra).

12.4. ábra: Az E. coli alkalikus foszfatáz vázlatos működési mechanizmusa.

A reakció két lépcsős, ping-pong mechanizmus szerint játszódik le. A szabad enzimben a szubsztrát megkötődésének helyén 3 vízmolekula található, a Mg2+-ionhoz koordinálódó egyik vízmolekula deprotonálódott. (Ez magyarázza az alkalikus működési optimumot.) A képződött hidroxidion protont hasít le a Zn2-hez koordinálódó Ser102 OH-csoportjáról. A szubsztrát 1,3-hidas formában kötődik a két Zn(II)-ionhoz (az észteres oxigén a Zn1-hez koordinálódik), a megkötődést elősegíti még az Arg166 guanídium csoportjával kialakított két H-híd is). A Ser102 OH-csoportjából képződött alkoholátion nukleofil támadást hajt végre a foszforatomon. Így a foszforán intermedieren kerztül az észteres oxigén P O kötésének felhasadásával egy kovalens átmeneti termék alakul ki. Mivel a Zn1-hez kötődő vízmolekula protont adott át a távozó R O- csoportnak, az így képződő hidroxidion egy következő nukleofil támadást hajt végre a kovalens intermedier foszforatomján. Ez egy újabb foszforán intermedieren keresztül a szervetlen hidrogén-foszfátion lehasadását eredményezi. A fent vázolt mechanizmusban a fémionok szerepe összetett: (i) a foszforsav-monoészter elektrosztatikus aktiválása (Zn1 és Zn2), (ii) a nukleofil reaktáns kialakítása (előbb Zn2 és Mg, majd Zn1), (iii) a foszforán intermedierek stabilizálása (Zn1 és Zn2), valamint a távozó R-O- csoport stabilizálása proton transzfer révén (Zn1).

A bíborsavfoszfatáz és a foszfoprotein-foszfatázok

A bíborsavfoszfatázok baktériumokban, növényekben és állatokban egyaránt előforduló enzimek, melyek az arilfoszfátok, foszforsavanhidridek és foszfoproteinek hidrolízisében vesznek részt savas (pH ? 5) pH optimummal. A különböző enzimekben az aktív központot kialakító aminosavak szinte teljesen azonosak, és mindegyikük két fémiont (Fe(III) és M(II) ahol M = Fe, Zn, Mn) tartalmaz. A spanyolbabból származó enzim kristályszerkezete alapján az aktív központban Fe(III) és Zn(II)-ionok találhatók egymástól 3,3 Å távolságra (12.5. ábra).

12.5. ábra: A spanyolbabból származó bíborsavfoszfatáz enzim aktív központja, a szubsztrát megkötődésének módja, ill. a Fe(III)-ionhoz kötődő hidroxidion szerepe a mechanizmusban.

A névadó intenzív bíbor színt a fenolát?Fe(III) töltésátviteli sáv eredményezi. A két fémiont egy karboxilát- és egy hidroxo-híd köti össze. A javasolt mechanizmus szerint a két fémion, eltérő kémiai tulajdonságukat kihasználva, egymást kiegészítve működik. A Fe(III)-ion erős Lewis-sav sajátsága révén a nukleofil hidroxid generálásáért (emiatt van a savas pH optimum), míg Zn(II) a szubsztrát megkötéséért és elektrosztatikus aktiválásáért (12.6. ábra) felelős. A foszforán intermedier stabilizálásában mindkét fémion részt vesz. Két, az aktív központhoz közeli hisztidin imidazolgyűrűje is részt vesz az átmeneti komplex stabilizálásában, ill. a távozó csoport (R O-) protonálásában.

A szerin/treonin foszfoprotein foszfatázok szekvenciája jelentős hasonlóságot mutat a fenti bíborsav foszfatázokkal. Legismertebb közülük a kalmodulin-függő kalcineurin, amely a bíborsav foszfatázhoz hasonlóan kétmagvú Fe(III)-Zn(II) aktív központot tartalmaz. Ebben az enzimben a tirozin egy vízmolekulán keresztül kapcsolódik a Fe(III)-hoz, emiatt a bíbor szín nem jelenik meg. A nyúlizomból izolált foszfoprotein foszfatáz I enzim aktív központjában kristályszerkezeti adatok alapján két Mn(II) helyezkedik el. Így, bár az enzim működési mechanizmusa hasonló a 12.5. ábrán bemutatotthoz, az optimális működés pH-ja jóval magasabb mint a kalcineurin vagy a bíborsavfoszfatázok esetén.

12.2.2. Foszforsavdiészterázok

Ezen enzimek legjelentősebb csoportját az ún. nukleázok alkotják, melyek az RNS, ill. a DNS lebontásában játszanak szerepet. A DNS polimeráz I enzimek csoportja mind a DNS-lánc szintézisét mind annak hidrolízisét katalizálja. Az E. coli DNS polimeráz I egyik részletesen vizsgált alegysége, az ún. Klenow-fragmens, polimeráz, ill. 3'-5'-exonukleáz (a DNS láncvégi nukleotidját hasító) aktivitással bír. A két funkciót két egymástól kb. 30 Å távolságra lévő aktív központ látja el. A 3'-5'-exonukleáz aktivitásért felelős egység működéséhez két M(II)-fémion szükséges: Mg(II), Mn(II) vagy Zn(II), melyek egymástól 3,9 Å távolságra helyezkednek el (12.6. ábra). A fémionok megkötésében csak O-donorokkal rendelkező oldalláncok vesznek részt. MA a szubsztrát távollétében is erősen kötődik a proteinhez, míg MB csak annak jelenlétében (viszonylag gyengén). A két fémiont egy karboxilát, ill. a szubsztrát foszforsavdiészter egy m-1,1-hidas módon kötődő oxigén atomja köti össze, ami annak ún. kétszeres Lewis-sav aktiválását eredményezi. A mechanizmusban az MA alakítja ki a nukleofil reaktánst, amit a közeli Glu357 karboxilcsoportja és az MA-OH között kialakuló H-híd is elősegít. A foszforán intermedier stabilizálásában is MA fémioné a főszerep.

12.6. ábra: Az ún. Klenow-fragmens 3'-5'-exonukleáz alegységének aktív központja, a szubsztrát megkötődésének módja, ill. az MA-hoz kötődő hidroxidion szerepe a mechanizmusban.

Számos egymagvú foszforsavészteráz is ismert. A sztafilokokusz endonukleáz (a DNS láncközi nukleotidjainak foszfodiészter kötéseit hasítja) a nukleinsavak lebontásában vesz részt. A hidrolízis nem hely-specifikus, viszont rendkívül gyors. Az aktív központ javasolt szerkezetét a 12.7. ábra mutatja. A foszfodiészter-csoport elektrosztatikus aktiválásáért a központi Ca(II)-ion és két közeli arginin pozitív töltésű guanídiumcsoportjai közösen felelnek. A nukleofil hidroxidion kialakítása szintén kooperációban, a Ca(II)-ion, ill. a Glu-43 karboxilátcsoportja segítségével történik. A foszforán intermedier stabilizálásában a fémion és mindkét arginin részt vesz, a távozó csoport stabilizásásában csak Arg-87 játszik szerepet.

12.7. ábra: A sztafilokokkusz nukleáz aktív központjának sematikus szerkezete.

Említést érdemelnek még az ún. restrikciós endonukleázok, melyek a baktériumok fágok elleni védekezésében játszanak szerepet. Működésük közben egy 4-8 bázispárból álló specifikus szekvenciát ismernek fel, s e szekvencián belül vagy ahhoz közel hasítják el a DNS foszforsav-diészter kötéseit. Az ún. II. típusú restrikciós enzimek fémionok (döntően Mg2+) által aktivált enzimek (12.8. ábra), melyek kiterjedt alkalmazást nyertek a molekuláris biológiában (ld. 17. fejezet). Legtöbbjük homodimer, azaz két azonos szerkezetű aktív központot tartalmaz. A hidrolízis mechanizmusa hasonló a korábban említettekhez.

12.8. ábra: Az EcoRV restrikciós endonukleáz enzim aktív központjának szerkezete.

12.3. Peptidek, fehérjék enzimatikus hidrolízise

A peptideket és fehérjéket felépítő aminosav-egységeket savamid (peptid)kötések kötik össze. Fiziológiás körülmények között a peptidkötés is rendkívül inert, átlagos félélettartama 100-1000 év. Enzimatikus hidrolízisüket a proteázok végzik, melyek jelentős része egy vagy két Zn(II)-iont tartalmaz. Az egymagvú enzimek jelentős hasonlóságot mutatnak. A szubsztrát távollétében a fémion körül többnyire tetraéderes szerkezet alakul ki, (His,His,Glu/Asp,H2O) vagy (His,His,His,H2O) donorcsoportok részvételével. További hasonlóságot jelent, hogy a fémionhoz koordinálódó vízmolekulához egy Glu/Asp egység kötődik H-hidas formában, aminek szerepe a nukleofil hidroxidion kialakulásának elősegítése (erre már több példát láttunk az előző fejezetekben is).

A legismertebb metallopeptidáz a karboxipeptidáz A, egy emésztő enzim, mely a peptidek, proteinek C-terminális egységét hasítja, főként, ha az egy nagy térkitöltésű hidrofób oldalláncot tartalmaz (pl. fenilalanin). Az enzim működési mechanizmusa még ma is vitatott. A legvalószínűbb forgatókönyvet a 12.9. ábra mutatja be.

12.9. ábra: A karboxipeptidáz A aktív központja és a reakció vázlatos mechanizmusa.

(http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/724/741576/Instructor_Resources/Chapter_24/Ch24MR.ppt#39)

A szubsztrátot az aktív központ közelében lévő pozitív töltésű Arg127 guanídium csoportja elektrosztatikusan aktiválja a karbonil-oxigénnel kialakított H-hidas kötés révén. A szubsztrát szelektív megkötődését, valamint annak megfelelő orientálását elősegíti még egy hidrofób zseb, valamint a szubsztrát karboxil- és karbonil-csoportjai által létrehozott H-hidas kötésrendszer. Ezután a fémionhoz kötött víz deprotonálódása játszódik lemajd a nukleofil hidroxidion támadást hajt végre a részlegesen pozitív töltésű karbonil-szénen. A C-N kötés felhasadásával párhuzamosan a Glu270 valamint a kialakuló új C-terminális egység karboxilcsoportja protont ad át a peptidkötésben résztvevő nitrogénnek. Így teljessé válik a hidrolízis és a termékek eltávoznak az aktív központból. A fémion szerepe a folyamatban tehát a nukleofil reaktáns generálása, valamint az átmeneti állapot stabilizálása.

További két metallopeptidáz családról teszünk röviden említést. A termolizinekben (hőstabil endopeptidázok, melyek láncközi peptidkötéseket hidrolizálnak) a Zn(II)-ion mellett található négy Ca(II)-ion biztosítja az enzim hőstabilitását. A Zn(II) koordinációs szférája igen hasonló a karboxipeptidáz A-hoz (12.10.a ábra). Működési mechanizmusukban két fő eltérés: (i) a szubsztrát elektrosztatikus aktiválásában (a C=O kötés polarizálásában) részt vesz a fémion is, (ii) ezt a folyamatot (és az átmeneti állapot stabilizálását) egy közeli hisztidin és tirozin is elősegíti H-hidak kialakítása révén (a karboxipeptidáz A-ban, ezeket a funkciókat egy guanídiumcsoport látta el).

12.10. ábra: A termolizin (a) és az adamalizin II (b) enzimek aktív központja (termolizin esetén a kristályszerkezet a fémionhoz kötött vízmolekula két lehetséges helyét mutatja).

A retrolizinek a kígyómérgek összetevői, melyek közül az egyik legveszélyesebb az Adamalizin II. Mérgező hatása az extracelluláris mátrix fehérjéinek (pl. kollagén) hidrolízisében nyilvánul meg. A tetraéderes geometriájú központi fémiont 3 imidazolgyűrű és egy vízmolekula veszi körül, s itt is megtalálható a koordinált vízhez kötődő Glu karboxilát (12.10.b ábra). Működési mechanizmusa analóg a termolizinével, azonban a szubsztrát elektrosztatikus aktiválásához (valamint az átmeneti állapot stabilizálásához) nincs szükség a termolizineknél jelentős szerepet betöltő hisztidin és tirozin oldalláncokra. A retrolizinek egyébként jelentős szerkezeti és funkcionális hasonlóságot mutatnak a sokkal 'békésebb természetű' mátrix metalloproteinázokkal.

12.4. Egyéb metallohidrolázok

12.4.1. Az ureáz

Az ammónia rendkívül fontos alapanyaga a legkülönbözőbb anyagok bioszintézisének, ugyanakkor erősen mérgező, főként az idegrendszer számára. Az ammóniakoncentráció megfelelő szinten tartásának egyik legfontosabb módja az, hogy a májban belőle karbamid (urea) szintetizálódik, melynek aztán nagy részét a vese kiválasztja. A karbamid kisebb része a bélrendszerbe kerül, ahol az ott található baktériumok ureáz enzimjei elbontják s belőle újra ammónia képződik. A karbamid (urea) igen stabil vegyület, félélettartama fiziológiás körülmények között kb. 4 év. Nem katalizált hidrolízise ammóniát, vízet és izociánsavat eredményez (12.2. egyenlet). Az enzimatikus hidrolízis teljesen más úton megy végbe, átmeneti termékként az instabil karbaminsav képződik, ami spontán módon bomlik, így a végtermék ammónia és szén-dioxid (12.3. egyenlet).

Az ureáz volt az első kristályos formában előállított enzim (J. Sumner, 1926), azonban a nikkel jelenlétét mintegy ötven évvel később igazolták (B. Zerner, 1975). Ez az egyetlen nikkeltartalmú metallohidroláz.

12.11. ábra: Az ureáz enzim vázlatos működése (S. Benini, W. Rypniewski, K. Wilson, S. Ciurli, S. Mangani, Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism, Journal of Biological Inorganic Chemistry,2001, 6, 778-790).

Az ureáz kétmagvú aktív központot tartalmaz (12.11. ábra). Az egymástól 3,5 Å távolságra lévő fémionokhoz két-két imidazolgyűrű és egy-egy vízmolekula koordinálódik. A két nikkelt egy aminocsoportján karbamilált lizin köti össze hídként. Ni2 koordinációs szféráját egy Asp karboxilát egészíti ki. A szubsztrát karbamid a karbonilcsoportján keresztül kötődik Ni1-hez. A megkötődést, ill. a térbeli elrendeződést elősegíti még a karbamid oxigénjét, ill. mind a négy hidrogénjét magában foglaló H-hidas rendszer. A Ni2 segítségével kialakuló nukleofil hidroxidion támadást hajt végre a részlegesen pozitív töltésű szénatomon. A tetraéderes átmeneti komplex egyik C-N kötésének felhasadásával, valamint a lehasadó nitrogén megprotonálódásával kialakul az ammónia, ill. a karbaminsav. Fenti mechanizmus szerint a Ni1 felelős a szubsztrát Lewis sav aktiválásáért, Ni2 generálja a nukleofil reaktánst, míg az átmeneti komplex stabilizálásában mindkét fémion részt vesz.

12.4.2. A β-laktamáz

Az első gyógyszerként is alkalmazott antibiotikumot, a penicillint, I. Fleming izolálta 1929-ben a Penicillium notatum nevű gombából. A penicillin gátolja a baktériumok sejtfalának kiépítését, így azok könnyen elpusztulnak. Azonban az antibiotikumok tömeges, és sokszor felelőtlen, alkalmazása oda vezetett, hogy bizonyos baktériumok rezisztensé váltak egy vagy több antibiotikummal szemben. A b-laktám alapú penicillinféleségek elleni rezisztencia kifejlődésének fő oka a b-laktamáz enzim megjelenése a rezisztens fajokban, melyek elhidrolizálják az amúgy sem túlságosan stabilis laktámgyűrűt (12.12. ábra).

A ma ismert kb. 200 b-laktamázt 4 csoportba szokás sorolni (A - D). A B típusú enzimek aktív központjában egy vagy két Zn(II)-ion található. Ezen enzimek különös veszélyt jelentenek, minthogy ma még nem ismert a klinikai gyakorlatban is használható inhibitoruk.

12.12. ábra: Néhány széles körben használt b-laktámgyűrűt tartalmazó antibiotikum.

A Bacteroides fragilis-ből izolált b-laktamáz kétmagvú központot tartalmaz (12.13. ábra). Zn1 tetraéderes környezetét három hisztidin imidazolgyűrűje és egy hidroxidion alakítja ki, az utóbbi hidat képezve a két fémion között. Zn2 koordinációs geometriája trigonális bipiramis, a fémionhoz egy-egy karboxilát- és tiolátcsoport, imidazolgyűrű, hidroxidion, valamint egy vízmolekula koordinálódik. A fehérje oldallánci csoportjai nem vesznek részt a két fémion összekapcsolásában, ami kétmagvú aktív központok esetén igen ritka. A mechanizmus hasonló az eddigiekhez, az olvasó a 12.13 ábrát értelmezve megfejtheti azt.

12.13. ábra: A B. fragilis-ből izolált b-laktamáz enzim vázlatos működése

(Jennie Weston, Mode of Action of Bi- and Trinuclear Zinc Hydrolases and Their Synthetic Analogues, Chem. Rev. 2005, 105, 2151-2174).

12.5. A ribozimok

Az 1980-as évek elején fedezték fel, hogy bizonyos RNS molekulák képesek kémiai reakciók katalízisére. E felfedezésért T. R. Chec és S. Altman 1989-ben kémiai Nobel-díjat kapott. A ribonukleinsav enzimek, az ún. ribozimok felfedezése a földi élet kialakulására vonatkozó elméletek területén is alapvetően új gondolatokat vetett fel (4.2 fejezet). Az RNS biológiai katalizátorként való működése sokáig elképzelhetetlen volt. Ennek okai:

(i) a négy lehetséges oldallánc (bázis) a fehérjékhez képest jóval kisebb szerkezeti változatosságot eredményez,

(ii) a bázisok alapesetben nem képesek proton felvételére, ill. leadására a fiziológiás pH-tartományban (ami elősegítené sav-bázis folyamatok katalízisét),

(iii) az RNS-lánc meglehetősen flexibilis (nehézkessé teszi a specifikus kölcsönhatást a szubsztráttal), és

(iv) nagy negatív töltéssel rendelkezik (ami a töltéssel bíró szubsztráttal nem-specifikus kölcsönhatást eredményez).

Később kiderült, hogy a H-hidas kölcsönhatások változatos és stabilis harmadlagos szerkezetet alakíthatnak ki, valamint a bázisok egy-egy nitrogénjének sav-bázis tulajdonságát jelentős mértékben befolyásolhatják. A természetben előforduló ribozimok szinte kizárólag sav-bázis reakciókat katalizálnak, mint a foszforsavészterek átészterezése, ill. hidrolízise. Ez alól riboszómális RNS kivétel, melyek a peptidek (fehérjék) szintézisében (peptidil transzfer) vesznek részt. A természetes ribozimok nagy része saját foszforsavészter kötéseit alakítja át sztöchiometrikus reakcióban, ezért valódi katalitikus folyamatról csak az RNáz P, ill. a már említett riboszómális RNS esetén beszélhetünk. A nagyméretű ribozimok (300-3000 bázis) képviselői pl. az RNáz P vagy az ún. I és II típusú intronok. Az általuk katalizált reakció a 12.14.a ábrán látható. A kisebb méretű 'hajtű' (hairpin) és 'kalapácsfej' (hammerhead) ribozimok a 12.14.b ábrán bemutatott folyamatot segítik elő.

12.14. ábra: A ribozimok által katalizált reakciók két jellemző típusa

(a) a nagyméretű ribozimok működésének reakciómechanizmusa (BOH = H2O (RNáz P), BOH = a guanozin kofaktor 2'-hidroxil csoportja (I-es típusú intron))

(b) a kisebb méretű ribozimok által elősegített folyamat reakciómechanizmusa.

A 12.14. ábra alapján megállapítható, hogy az eddig ismert ribozimok közül csak az RNáz P tekinthető hidroláznak. A foszforsavészter kötés átalakításában szerepet játszó többi ribozim egy átészterezési folyamatot (foszforil transzfert) segít elő. Az RNáz P a tRNS "érésének" egyik lépését, prekurzor tRNS (pre-tRNS) molekulák 5'-végéhez közeli P-3'O kötés hidrolízisét segíti. A reakció eredményeképpen kialakuló tRNS végén egy 5'-foszfát-, a lehasadó oligonukleotidon 3'-hidroxilcsoport alakul ki. A baktériumok RNáz P ribonukleoproteinjei a 350-400 nukleotidból álló RNS-lánc mellett egy viszonylag kis (15kDa) bázikus fehérjét is tartalmaznak, mely, bár elengedhetetlen az RNáz P működéséhez in vivo, az RNS alegység önmagában is képes a foszforsavdiészter kötés hidrolízisére in vitro. Az E. coli RNáz P RNS-ének szerkezete 18 helikális részre tagolható (P1-P18) (12.15. ábra).

12.15. ábra: A kólibaktérium RNáz P RNS-ének másodlagos és harmadlagos szerkezete.

A katalitikus folyamat csak Mg(II) (esetleg Mn(II)) ionok jelenlétében játszódik le. A ribozimok esetén a fémion három alapvető funkciót láthat el: (i) az RNS harmadlagos szerkezetének kialakításában, (ii) a szubsztrát megkötésében, valamint (iii) a katalitikus folyamatban vehet részt. Az RNáz P esetén a Mg(II)-ionok mindhárom funkció ellátásában szerepet vállalnak. A reakció mechanizmusa SN2, hasonlóan a legtöbb metallohidroláz által katalizált folyamathoz. A nukleofil reaktáns a fémionok segítségével kialakuló hidroxidion. A feltételezett mechanizmus szerint két fémion vesz részt a szubsztrát aktiválásában, három fémion az átmeneti állapot, míg a negyedik a távozó csoport stabilizálásában.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Mely fémionok fordulnak elő leggyakrabban a metallohidrolázok aktív központjában? Mely fő tulajdonságaik teszik őket erre alkalmassá?

- Milyen folyamatot katalizál a szénsavanhidráz? Hol van ennek szerepe az élő szervezetekben?

- Mi a cinkion két fontos szerepe a szénsavanhidráz mechanizmusában?

- Hogyan csoportósítjuk a foszfoészterázokat? Mely biológiai molekulák ezen enzimek szubsztrátjai?

- Mi a fémion(ok) szerepe általában a foszfoészterázokban?

- Mi az oka annak, hogy az alkalikus foszfatáz pH 9-10 között, míg a bíborsavfoszfatázok pH ~ körül?

- Miért jelentősek számunkra a specifikus DNS szekvenciákat felismerő restrikciós endonukleázok?

- Milyen hasonlóságokat mutat a szénsavanhidráz és a karboxipeptidáz A működési mechanizmusa?

- Milyen peptidkötést hasító fémtartalmú enzimeket ismert meg a fentiekben? Ezeknek milyen élettani hatása van?

- Mi a baktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztanciája kialakulásának egyik legfőbb oka bioszervetlen kémiai szempontból?

- Mik a ribozimok?

Chapter 13. 13. CSOPORTTRANSZFER ENZIMEK

Kulcsszavak: csoporttranszfer, ATP, foszforiltranszfer reakció, protein kináz, kobalamin, B 12 koenzim, fémorganikus vegyület, izomeráz

A katalitikus folyamatok egy része valamilyen atomcsoport beépülésével, egyik molekuláról a másikra való átvitelével (transzferével) jár. Az ilyen folyamatokban résztvevő enzimek legtöbbje a kérdéses csoportot aktív formában tartalmazó segédmolekulát, koenzimet v. kofaktort, igényel a működéshez (13.1 táblázat). Jelen fejezet a csoportátvivő enzimek néhány képviselőjét mutatja be, az atomok (helyesebben egyatomos ionok, pl. hidrid-, ill. oxoanion) átvitelére alkalmas enzimeket a 10, ill. 11. fejezetben láthattunk.

13.1. táblázat: Néhány atom-, ill. csoporttranszferben résztvevő enzim és segédanyagai.

13.1 Az ATP és a foszforiltranszfer reakciók

Az ATP, mint energiahordozó, hidrolízise során energia szabadul fel, ami az élettani folyamatok energiaszükségletét fedezi (13.1. egyenlet). Egy átlagos felnőtt kb. a testsúlyának megfelelő ATP-t szintetizál naponta, így az egyszerre jelenlévő mintegy 50 g ATP minden molekulája naponta átlagosan 1400-szor alakul át ADP-vé, majd vissza. Az ATP a szervezetben szinte kizárólag Mg2+ komplexe formájában fordul elő (néha ezt a szerepet átveszi a Mn(II)-ion), azonban e komplex szerkezetét nem ismerjük pontosan. Más fémionok ATP komplexeinek szerkezete alapján a 13.1. ábra a Mg-ATP komplex két lehetséges szerkezetét mutatja.

13.1. ábra: A Mg-ATP komplex lehetséges szerkezetei.

Az ATP legnagyobb mennyiségben az oxidatív foszforiláció során képződik a mitokondriumban, de pl. a Na+,K+ ATPáz fordított működése (6.2. fejezet) is ATP-t eredményez. Az ATP-ben tárolt energia felhasználása is igen sokcélú lehet:

(i) az energia raktározása egy későbbi felhasználás céljából (kreatin?kreatin-foszfát),

(ii) egy fehérje konformáció változása, az enzimaktivitás, ill. transzport folyamatok szabályozása, vagy mechanikai munka végzése,

(iii) egyes metabolikus folyamatok energiaigényének fedezése, stb.

A lejátszódó kémiai folyamat sok esetben igen hasonló: az ATP terminális foszfátcsoportja átkerül a reakciópartnerre (foszforil-transzfer). Pl. a Na+,K+-pumpa működésében meghatározó jelentőségű konformációváltozást egy karboxilcsoport foszforilálása indítja el (6.2. fejezet). A legtöbb ionpumpa működését hasonló folyamat szabályozza (13.2. egyenlet).

Az enzimek oldalláncaiban található csoportok reverzibilis foszforilálása (13.3. egyenlet), melyet az ún. protein kinázok katalizálnak, az enzimműködés szabályozásának egyik legfontosabb mechanizmusa (4.5, 12.2.1. és 14.2. fejezetek). E folyamat során leggyakrabban a fehérjelánc egy szerin, vagy tirozin alegységének OH-csoportja foszforilálódik, s így egy foszforsav-monoészter (X = O) alakul ki, de karboxilátcsoport (X = CO), ill. guanídiumcsoport (X = NH-C(NH2)NH) is részt vehet hasonló reakciókban. A kinázok által katalizált foszforilációnak nagy szerepe van a metabolikus folyamatokban is, mint pl. a glikolízis. A hexokináz az indító lépést katalizálja (13.4. egyenlet). A foszforiláció aktiválja a reaktánst, mely további folyamatokban vesz részt, de a kialakuló negatív töltés befolyásolhatja az adott vegyület membrántranszportját is. A kinázok az ellenkező irányú foszforiltranszfert, az ATP képződését is katalizálják (így válhat a glikolízis egészének energiamérlege pozitívvá). A glikolízis első ilyen lépése során az 1,3-biszfoszfoglicerát nagyenergiájú, a karboxiláttal vegyesanhidridet képző foszfátcsoportja (ún. makroerg foszfát) kerül át az ADP-re (13.2. ábra).

13.2. ábra: Az 1,3-biszfoszfoglicerát és az ADP reakciójának sematikus ábrázolása.

A Mg-ATP komplexnek az aktív központban való megkötődésében mind a fémion, mind az ATP részt vesz, az aminosav oldalláncokkal kialakított koordinatív, H-hidas, ill. hidrofób kölcsönhatások révén. A fehérjéhez kötött Mg-ATP komplexben a Mg(II)-ion már nem a 13.1. ábrán bemutatott módon kötődik az ATP-hez, ami lehetővé teszi az XH csoport nukleofil támadását a terminális (g) foszforatomon. Ezt a folyamatot általában a fehérje egy oldallánci csoportja (pl. karboxilát), ill. egy másik fémion is elősegíti (13.3. ábra). Az ellenkező irányú folyamatot is hasonlóképpen értelmezhetjük, ekkor azonban az ADP terminális foszfátjának oxigénje a nukleofil reaktáns.

13.3. ábra: A protein kinázok működésének egy lehetséges mechanizmusa.

A glutamin szintetáz által katalizált reakció (13.4. ábra) két lépésben játszódik le: előbb a glutamátnak egy foszfáttal alkotott vegyesanhidridje képződik, majd e reaktív köztitermék reakcióba lép az ammóniával, ami egy tetraéderes aktív komplex kialakulásán keresztül, a glutamint eredményezi.

13.4. ábra: A glutamin szintetáz által katalizált reakció.

A folyamatban két Mg(II)-ion vesz részt, melyek egymástól viszonylag távol, 5,8 Å-re vannak (13.5. ábra). Az ATP terminális foszfátcsoportjának aktiválásában mindkét fémion szerepet vállal, ugyanakkor a glutamát nukleofil karboxilcsoportjához csak egy Mg(II)-ion kötődik. A karboxil-oxigén nukleofil támadása után mindkét fémion részt vesz a foszforán intermedier stabilizálásában, majd a másik Mg(II)-ion segíti elő a távozó csoport (ADP) leszakadását. Az így kialakuló savanhidridhez mindkét fémion koordinálódik, s ez elősegíti az ammónia nukleofil támadását a karboxilátcsoport szenén. Végül a C-O kötés felhasadásával távozik a hidrogén-foszfátion. Az enzim fontos szerepet játszik a szervezet számára rendkívül toxikus szabad ammónia koncentrációjának alacsony értéken tartásában, működése pedig a reakciópartner foszforiláció általi aktiválásának szép példáját mutatják be.

13.5. ábra: A glutamin szintetáz vázlatos működése.

13.2 A metilkobalamin és a B12 koenzim

1926-ban fedezték fel, hogy az egyébként halálos vészes vérszegénység gyógyítható állati májból készített extraktum adagolásával. Később kiderült, hogy a hatóanyag egy Co(III)-tartalmú vegyület. Tiszta formában csak 1948-ban izolálták. Szerkezetét röntgendiffrakciós módszerrel határozták meg 1956-ban. A B12 koenzim mérete (Mr = 1350) miatt azonban a szerkezet azonosítása nagy kihívás volt, D. Crowfoot-Hodgkins 1964-ben kémiai Nobel-díjat kapott ezért.

A B12 koenzimben a porfinhez hasonló korringyűrű (13.6. ábra) veszi körül a kobaltiont. Eltérés a porfintól, hogy a korringyűrű ún. külső szénatomjai sp3 hibridállapotúak. Ennek következtében a korringyűrűben kilenc királis szénatom van, a porfinben viszont egy sem. A korringyűrű továbbá egy szénatommal kevesebbet tartalmaz, így az általa kialakított belső üreg mérete kisebb, mint a porfiné. A korringyűrű négy ekvatoriálisan koordinálódó nitrogénje mellett az egyik axiális helyzetben egy, a gyűrűhöz kapcsolt, benzimidazolgyűrű nitrogénje koordinálódik, míg a hatodik pozícióban több ligandum is kötődhet a fémionhoz. Az elsőként azonosított szerkezet itt egy cianidiont tartalmazott, valószínűleg az izoláció során alkalmazott eljárás következményeként. Ezt a vegyületet B12 vitaminnak nevezték el, mivel az emberi szervezet a korringyűrűt nem képes előállítani, erre csak az egészséges ember bélflórájában lévő baktériumok képesek. Azonban a biológiailag aktív formák vagy egy metilcsoportot (metilkobalamin), vagy 5'-dezoxiadenozil szubsztituenst (B12 koenzim) tartalmaznak.

13.6. ábra: A metilkobalamin szerkezete (X = CH3).

Meglepő, hogy a metilkobalaminban és a B12 koenzimben tehát a fémionhoz közvetlenül egy metil-, ill. egy metiléncsoport kötődik. E vegyületek máig kizárólagos példái a stabilis fémorganikus vegyületek megjelenésének az élő szervezetben. A fémorganikus molekulák döntő többsége elhidrolizál vizes oldatban.

Mindkét biológiailag aktív forma koenzimnek tekinthető, azaz különböző enzimekhez kapcsolódva fejtik ki hatásukat. A csoporttranszfer enzimek kapcsán a metilkobalaminnak van kulcsjelentősége, míg a B12 koenzim néhány izomeráz és dehidratáz enzim működésében játszik meghatározó szerepet.

A metilkobalamin a metilezési reakciókban a metilcsoportot szolgáltatja (pl. koenzim A szintáz a 10. fejezetben), de a katalitikus reakcióban közvetlenül nem vesz részt. Bár több biológiai metilforrás is ismert (pl. S-adenozil metionin), a kobalamin az egyetlen, amely a kobalt vegyértékváltó sajátsága révén a karbanionos (CH3) forma mellett, karbokationos (CH3+) vagy gyökös alakban (CH3?) is képes a metilcsoport átadására. Ez a Co-C kötés homo-, ill. heterolitikus felhasadása révén lehetséges (13.5. egyenlet). A kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a metilkobalamin reakciói esetén döntően kobal(I)amin és karbokation (CH3+), míg a későbbiekben tárgyalandó B12 koenzimnél kobal(II)amin és alkilgyök (R-CH2?) képződik.

A homocisztein metilezésében, mely folyamatot a homocisztein-metil-transzferáz katalizálja, a metilkobalamin vesz részt (13.7. ábra).

13.7. ábra: A homocisztein metilezésének folyamata.

A reakcióhoz szükséges metilkobalamin a

kobalamin + 5-metil-tetrahidrofolát ? tetrahidrofolát + metilkobalamin(13.6.)

reakcióban képződik, így a metilkobalamin és a tetrahidrofolát mennyisége a szervezetben szoros kapcsolatban áll egymással. Mivel a tetrahidrofolát fontos szerepet tölt be a nukleotidok bioszintézisében, a kobalamin hiánya abban súlyos zavarokat okoz, s ennek egyik kórképe a vérszegénység egy fajtája.

A B12 koenzim az izomerázok működésében játszik szerepet. Nagyszámú enzim működését segíti elő (13.2. táblázat), melyek által katalizált reakciók mechanizmusa gyökös típusú 1,2-átrendeződés (13.9. ábra). A B12 koenzim Co(III)-C kötésének homolitikus disszociációja egy alkilgyököt eredményez, ami H-atomot szakít le a szubsztrátról. A visszamaradó gyök 1,2-átrendeződésen megy keresztül, majd visszaveszi a H-atomot. Ezzel az izomerizáció teljessé válik, és a B12 koenzim regenerálódik.

13.9. ábra: A B12 koenzim-függő izomerázok működésének általánosított mechanizmusa.

13.2. táblázat: A B12 koenzim-függő izomerázok általánosított mechanizmusa, valamint néhány képviselőjük.

Az 1,2-diolok dehidratálásának (13.10. ábra) első lépése a B12-függő dehidratázok által a fentiekkel teljesen analóg módon játszódik le. A folyamatban képződő geminális diol azonban spontán vízvesztéssel tovább alakul aldehiddé.

13.10. ábra: A B12 koenzim-függő dehidratázok által katalizált reakció (első lépés) terméke spontán vízvesztéssel aldehiddé alakul.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Soroljon fel néhány atom-, ill. csoporttranszfer folyamatban résztvevő segédanyagot!

- Milyen szerepe van a szerveteben az ATP molekulának?

- Hogyan képződik az ATP?

- Milyen folyamatot katalizálnak a protein kinázok?

- Milyen fémionok vezsnek tészt a fenti folyamatokban?

- Rajzolja fel a metilkobalamin vázlatos szerkezetét! Milyen fémiont tartalmaz, és e körül milyen donoratomok találhatók?

- Milyen enzimek működését segíti a B 12 koenzim? Soroljon fel néhány példát! Milyen biológiai folyamatokban vesznek részt ezek?

- Írja le röviden a B 12 koenzimmel együttműködő izomerázok által katalizált reakciók mechanizmusát! Milyen típusú reakciókról van szó? Hogyan segíti ezt a B 12 koenzim?

Chapter 14. 14. A FÉMIONOK ÖSSZETETT FIZIOLÓGIÁS HATÁSAI

Kulcsszavak: szerkezetstabilizálás, szerkezetépítés, cink-inzulin hexamer, cink-ujj fehérjék, Ca 2+ jelátvivő, Ca 2+ -fehérjék, kalmodulin, akonitáz enzim.

14.1. A fémionok szerkezetépítő szerepe

A fémionok ionos kölcsönhatásaik, ill. koordinatív kötéseik révén alkalmasak lehetnek egy-egy makromolekula vagy szupramolekuláris egység szerkezetének kialakítására, ill. annak stabilizálására. A korábban már említettek szerint ilyenek lehetnek:

(i) Szerkezetstabilizálás töltéskompenzáció révén. A polielektrolitként viselkedő makromolekulák (DNS, RNS, poliszaharidok), ill. sejtalkotók (pl. foszfolipid membrán) felületén rendkívül nagy negatív töltés töltés halmozódik fel. A biológiai szempontból kívánatos szerkezet (pl. a DNS kettős spiráljának) megtartása érdekében, nagyszámú ellenion (főként alkálifém-ion) nem-specifikus kötődése szükséges.

(ii)Szerkezetépítés koordinatív kötések révén. Főként a fehérjékre, ill. RNS molekulákra jellemző, hogy a megfelelő harmadlagos szerkezetet kialakításában fémionok is szerepet játszanak, az oldallánci csoportokhoz való koordináció révén összekapcsolják, a térben egymáshoz képest rögzítik az egyes molekularészeket. Bár a korábbiakban főként az aktív centrumban helyet foglaló fémionokról tettünk említést, néhány esetben szóba kerültek már katalitikus funkcióval nem bíró, kizárólag a szerkezetépítésben részt vevő fémionok is, például a ribozimok, ill. az alkohol dehidrogenáz esetén.

Egy további érdekes és fontos példa lehet a koordinatív kötések révén megvalósuló szerkezetépítésre, a Zn(II)-inzulin kölcsönhatás. Az inzulin egy a glukolízis és a glukoneogenezis szabályzásában résztvevő hormon, amely a vércukorszint emelkedésekor lép működésbe. A szervezet, hogy mindig megfelelő mennyiségű inzulin álljon rendelkezésre, a Golgi-készülékben tárolja az előállított és még fel nem használt inzulint, egy (Zn2)(Ca)(inzulin)6 összetételű hexamer formájában. A két Zn(II)-ionhoz 3-3 imidazolgyűrű (mindegyik inzulinról egy-egy) koordinálódik. E hexamer három szerkezetet vehet fel. A Golgi-készülékben a fizikai és kémiai behatásoknak leginkább ellenálló, ráadásul rosszul oldódó R6 forma tárolódik (14.1.a ábra). Az R6 hexamer stabilitásához a 6 db hidrofób zsebben megkötődő aromás vegyület (pl. fenol vagy krezol, 14.1.c ábra), ill. a két fémionhoz kötődő szervetlen anion (pl. klorid vagy rodanid, 14.1.e ábra) is hozzájárul, minthogy kötődésük révén a hexamer szerkezet zártabb lesz, s a tetraéderes koordinációjú Zn(II)-ionokat elzárják a hexamer felbomlását eredményező, cinkhez erősen kötődő ligandumoktól (14.1.e ábra). Az alloszterikus hidrofób zsebekben kötődő aromás vegyületek disszociációja a hexamer jelentős konformációváltozását idézi elő. Az átalakulás két lépésben (R6 ? R3T3 ? T6) történik meg. A T6 hexamer szerkezetének egésze s a fémionok közvetlen környezete is jóval nyitottabbá válik R6-hoz képest, ami megkönnyíti a biológiailag aktív inzulin monomerek képződését. A vércukorszint emelkedésének hatására a Golgi-készülékben tárolt R6 kilökődik a sejten kívüli térbe. Minthogy itt az alloszterikus ligandumok koncentrációja jóval kisebb, azok disszociálnak R6-ról s lejátszódik az R6 ? R3T3 ? T6 átalakulás. A hexamer felbomlását elősegíti az új környezet alacsonyabb pH-ja, ill. hogy az ott jelenlévő erős fémkötő ligandumok leszorítják a cinket az inzulinról. A vizsgálatok szerint a vércukorszint megemelkedése után 10 másodperc múlva megjelenik a véráram által szállított inzulin a májban, így fent említett folyamat csak néhány másodpercet vesz igénybe.

14.1. ábra: A (Zn2)(Ca)(inzulin)6 hexamer R6 (a) és T6 (b) formájának szerkezete (a két fémion fedi egymást), az azokat felépítő alegységek szerkezet (c,d), ill. a Zn(II)-inok közvetlen környezete (e,f).

(Michael F. Dunn, Zinc ligand interactions modulate assembly and stability of the insulin hexamer   a review, BioMetals (2005) 18:295 303)

14.2. A fémionok fiziológiás szabályzó szerepe

Az előző fejezetekben tárgyalt metalloenzimekben, ill. fémionok által aktivált enzimekben/fehérjék-ben a fémion(ok) kofaktorként szerepel(nek), így szélesebb értelemben természetesen részt vesz(nek) az adott enzim/fehérje működésének szabályzásában. Jelen fejezet témája azonban, a fémionoknak azon szerepe, amely egy bonyolult folyamat (pl. transzkripció) vagy egy nagyobb működési egység (pl. több száz enzim működésének összehangolása) szabályzását teszi lehetővé.

14.2.1. A Zn(II) szerepe a genetikus információátadásban

Köztudott, hogy a cink hiánya növekedési rendellenességeket okoz. Talán kevésbé ismert, hogy igen nagy koncentrációban található meg a spermában, ill. a növényi pollenekben, ill. hogy az peptidhormonok felszabadításában szinte kizárólagos szereppel bír. Mindezek már régen arra engedtek következtetni, hogy e fémionnak szerepe lehet a a metabolikus folyamatok szabályzásában és a genetikus információ átadásában. Azonban csak 1983 fedezték fel először jelenlétét egy DNS-kötő transzkripciós faktorban (TFIIIA). A fehérje kilenc, 30-30 aminosavból álló, közel azonos felépítésű egységet tartalmaz. Ezen ismétlődő szekvenciák mindegyikében 2-2 hisztidin és cisztein található. Emiatt a fehérje kilenc fémion megkötésére képes. A négy donorcsoport tetraéderes környezetet alakít ki a fémion körül (14.2.a ábra). A fémionok hatására egy-egy 12-15 aminosavból álló hurok (ujj) alakul ki, melynek jól megőrzött pozícióiban aromás gyűrűt tartalmazó aminosavak (fenilalanin, tirozin) helyezkednek el. Ezek az ujjak az említett oldalláncok révén képesek megkötődni a DNS nagy árkában (14.2.b ábra). Azóta igen nagyszámú hasonló szerkezetű cinkkötő transzkripciós faktort izoláltak (a humán DNS állomány kb. 1 %-a ilyen fehérjéket kódol), melyeket közös néven cink-ujj fehérjéknek neveznek.

14.2. ábra: Egy cink-ujj szerkezet (a), ill. a cink-ujjak megkötődése a DNS nagy árkában (b).

A cink-ujj fehérjék az eukarióta sejtek transzkripciós folyamatának egyik szabályzó mechanizmusát szolgáltatják. A transzkripció alatt a DNS genetikai információjának RNS-sé való átírását értjük. A folyamat során az RNS polimeráz segítségével képződő mRNS a riboszómába jut, ahol elindul a genetikai kódnak megfelelő fehérje szintézise. Minthogy minden fehérje ilyen módon képződik, a folyamatnak rendkívül nagy szerepe van a biokémiai folyamatok kontrolljában. A transzkripciós faktorok a DNS ún. promoter régiójához (a transzkripció kezdeti pozícióját kódoló DNS szakaszhoz) kötődnek, és az RNS polimeráz működését segítik elő. Utóbbi működésének szabályzása a fémion koncentrációjának változtatásával lehetséges, hiszen a fehérje csak megfelelő számú cink-ujj kialakulása után képes a DNS-hez kötődni.

14.2.2. A Ca2+-ion, mint a sejten belüli jelátviteli rendszer egyik meghatározó eleme

A kalcium esetében a sejtmembrán két oldala között mérhető koncentráció gradiens kiugróan nagy. Koncentrációja a citoplazmában ~ 10-7 M, míg a sejten kívüli térben 1-2 mM. Ez a nagy koncentrációkülönbség ad lehetőséget a hírvivő (jelátvivő) szerepre. Ugyanis már igen csekély mennyiségű Ca2+ bejutása a citoplazmába elegendő ahhoz, hogy az ún. nyugalmi Ca2+ koncentráció akár százszorosára növekedjék. Maga a jelátvitel annak révén lesz lehetséges, hogy a citoplazmába beáramló kalciumion kölcsönhatásba lép vagy magukkal az egyes funkciókat ellátó enzimekkel/fehérjékkel, vagy olyan anyagokkal melyek hatással vannak az enzimek/fehérjék működésére. Ennek a kölcsönhatásnak erősnek és nagyon szelektívnek kell lennie, hiszen a citoplazmában kb. 1 mM Mg2+ és 100 mM K+-ion is jelen van, ugyanakkor a csak néhány pillanatig kialakuló legnagyobb Ca2+ koncentráció kb. 10-5 - 10-6 M. A 6.3.2. fejezetben, az izomműködés tárgyalása kapcsán már találkoztunk a Ca2+-ion jelátvivő szerepével: a depolarizációs hullám (akciós potenciál) hatására Ca2+-ion jut a szarkoplazmába, kölcsönhatásba lép a troponin C nevű fehérjével, s az ennek hatására bekövetkező konformációváltozás lehetővé teszi az aktin és miozin kapcsolódását, majd az izom összehúzódását. Ez a mechanizmus sok hasonlóságot mutat a jelen fejezetben tárgyalandó jelátviteli rendszerekkel, a különbség csak annyi, hogy a Ca2+ koncentráció növekedése jóval összetettebb hatást fejt ki.

A citoplazmában megjelenő Ca2+-ionok főként (de nem kizárólag) három forrásból származhatnak: (i) az extracelluláris térből, valamint a sejten belüli 'raktárakból', pl. (ii) az endoplazmás retikulumból (ER), ill. (iii) az izomsejtekben az ER-hez hasonló szerepet betöltő szarkoplazmás retikulumból (SR). Az ER-ben és az SR-ben a fémion nem szabad állapotban, hanem kalciumkötő fehérjékhez (pl. kalszekveszterin) kötve található. A kalszekveszterin rendkívül sok karboxilátcsoportot tartalmaz, és érdekes sajátsága, hogy akár 40-50 kalciumiont is képes megkötni. A fehérje viszonylag gyengén köti a kalciumot (log K ~ 3), így azok könnyen mobilizálhatóak.

A Ca2+-ionok rendkívül fontos jelátvivő szerepére, de a jelátviteli rendszer meglehetősen összetett voltára találhat az érdeklődő olvasó szép példát jelen anyag alapirodalmának tekinthető 1. irodalom 198-201. oldalán ahol az inozitol-1,4,5-trifoszfát (IP3) által közvetített jelátviteli rendszert ismertetjük.

A jelátvitelben alapvető szerepet játszó Ca2+-kalmodulin-fehérje kölcsönhatás szerkezeti vonatkozásairól fontossága miatt, szólnánk itt is. A kalmodulin szerkezete egy súlyzóra hasonlít, két globuláris alegységet egy rövid, hélix szerkezetű lánc köt össze (14.3. ábra). A globuláris alegységek 2-2 oktaéderes fémkötő-helyet tartalmaznak, melyeket 4-5 karboxilát és 1-2 amid-oxigén alkot. A fémkötő-helyek jellegzetes hélix-hurok-hélix szerkezettel rendelkeznek, s a fémion a hurok környezetében kötődik meg. Ezt a szerkezetet az irodalomban 'EF-hand' Ca2+-kötő motívumnak nevezik, amely igen nagyszámú kalciumkötő fehérjében megtalálható (pl. a kalbindinben, vagy az izomösszehúzódás kapcsán tárgyalt troponin C-ben és parvalbuminban, ld. 6.3.2. fejezet). A koordináció hatására a két hélix egymáshoz viszonyított helyzete megváltozik, ami a kalmodulin egészének a konformációját megváltoztatja. A két globuláris alegység közelebb kerül egymáshoz, s az így kialakuló üreg belső felületén apoláris oldalláncok kerülnek túlsúlyba. Ebben a belső üregbe kötődik meg számos enzim hélix szerkezetű alegysége, aminek eredményeként a kalmodulidin újabb konformáció változást szenved, és teljesen körülöleli a fehérje hélix szerkezetű alegységét. Ez a kölcsönhatás eredményezi az enzim aktiválását/inaktiválását. Említést érdemel, hogy a három komponens (Ca2+-ion, kalmodulin, fehérje) asszociációja kooperatív módon játszódik le, azaz a fehérje jelenlétében a kalmodulin kalcium affinitása jóval nagyobb, mint annak távollétében.

14.3. ábra: A kalmodulidin konformációváltozása a kalciumionok valamint egy kalmodulin-függő enzim hatására (a fehérjét az ábrán egy hélix szerkezetű peptid modellezi).

14.3 Az aktív centrum finomhangolásával elérhető speciális sajátságok

Az eddigiekben már sok metalloenzim kapcsán részleteztük, hogy a fémion koordinációs szférájának kismértékű megváltozása milyen jelentős hatással lehet a fehérje sajátságaira. Erre vonatkozóan számos példa akad pl. az elektronszállító fehérjék között (7. fejezet). A citokrómokban a vashoz axiális pozíciójában kötődő egyik imidazolgyűrűt egy metionin tioéter donorcsoportjára cserélve, a redoxi potenciál akár 400-600 mV-tal is megnőhet. Hasonló változást idéz elő a [2Fe-2S] centrum két terminális tiolát csoportjának imidazolgyűrűre való cseréje (nem is beszélve arról, hogy ez a csere pH-függő sajátságot kölcsönöz a Rieske-centrummal rendelkező fehérjéknek). Ugyanakkor az ún. 'normális' Fe4S4 és a HIPIP elektronszállító fehérjék aktív centruma teljesen azonos donorcsoportokat tartalmaz. Különbség csak a koordinálódó tiolátcsoportokat elválasztó aminosav-egységek számában, ill. ennek következtében az Fe4S4-klaszter körüli környezet hidrofób jellegében mutatkozik. Mindez a klaszterek szerkezetének csak kismértékű eltérését eredményezi. Ennek ellenére a két enzimcsalád redoxipotenciálja akár 500 mV-tal is eltérhet egymástól.

A következőekben, maradva a vas-kén klasztereknél, arra mutatunk példát hogy a fémionok koordinációs szférájának viszonylag csekély megváltozása alapvetően eltérő funkciót eredményezhet.

A vas-kén klaszterrel rendelkező elektronszállító fehérjék már a földi élet kezdeti szakaszában kialakultak, s az evolúció hosszú évmilliói alatt gyakorlatilag alig változtak. Ezért a 80-as évek elején kisebb szenzációnak számított az a bejelentés, hogy a Krebs-ciklus egyik kulcs enzime, a citrát-izocitrát átalakulást (14.4. ábra) katalizáló ún. akonitáz aktív centrumában egy nem-redoxi funkciójú Fe3S4 klaszter található. Ma már több ilyen vas-kén klasztert tartalmazó dehidratázt ismerünk, melyek szép példái az aktív centrumok 'evolúciójának'.

14.4. ábra: a citrát-izocitrát átalakulás.

Az akonitáz enzim működésének leírását jelen anyag alapirodalmának tekinthető 1. irodalom 203. oldalán ismertetjük.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Milyen szerkezetstabilizáló, ill. szerkezetépítő szerepe lehet a fémionoknak az élő szervezetben?

- A Zn(II) ionok szerepe az inzulin szabályozott felszabadulásában.

- A cink-ujj fehérjék szerepe a genetikai információ átirásában.

- A Ca(II)-fehérjék szerepe az élő szervezetben.

- A citrát izocitrát átalakulás jelentősége az élő szervezetben.

Chapter 15. 15. A FÉMIOHÁZTARTÁS ZAVARAI. TOXIKUS FÉMIONOK

Kulcsszavak: hiánybetegség, fölöslegbetegség, ajánlott napi dózis, kelátterápia, táplálék-kiegészítők, Thalasszémia, Wilson-kór, Keshan-kór, oszteoporózis, organofém-vegyületek toxicitása, LD 50 , toxikus szoft fémionok, toxikus hard fémionok.

15.1. Fémionok hiánya és fölöslege

Amint azt a 2.1. fejezetben tárgyaltuk még a létfontosságú elemek is csak egy adott koncentrációtartományban fejtenek ki pozitív biológiai-fiziológiai hatást. Ez a koncentrációtartomány egyedenként kisebb-nagyobb eltéréseket mutat. A kívánatosnál kisebb koncentrációban hiánybetegségeket okoz, míg nagyobb koncentrációknál fölösleg betegségek lépnek fel.

15.1. táblázat: Egyes létfontosságú elemek hiány- és fölöslegbetegségei.

A hiánybetegségek általános kezelési módja a nyomelemek pótlása. Fontos kérdés a megfelelő, biológiailag hozzáférhető formában való bevitel, ami a nyomelem gyors lehetőleg minél teljesebb felszívódását teszi lehetővé. A gyógyszertárakban kapható nyomelem készítmények (Centrum, Béres cseppek) ma már általában biztosítják ezt, azonban a nem gyógyszertárakon keresztül terjesztett „csodaszerektől” inkább tartózkodjunk, mert esetleg több kárt okoznak, mint hasznot. A kívánatosnál nagyobb koncentráció, akár a nem megfelelő kiválasztás, akár a túlzott felvétel miatt, mérgezési tüneteket válthat ki. Az ilyen mérgezések a bioszervetlen kémia eredményeinek felhasználásával is kezelhetőek, például, amikor az illető nyomelemnek az antagonistáját adjuk, amely képes a fölöslegbe került nyomelemet kiszorítani a biológiai kötési helyeiről és az kiürülhet a szervezetből. Másik lehetőség az úgynevezett „kelátterápia”, amikor a toxikus elemet megfelelő, az illető elemre specifikus komplexképző-szerrel visszük a szervezet által kiválasztani képes, megfelelő termodinamikai és kinetikai tulajdonságokkal rendelkező komplex vegyületbe. A kelátterápiával kapcsolatosan a specifitás az alapvető probléma. A komplexképződés ugyanis inkább tekinthető egy-egy elemcsoportra nézve szelektív folyamatnak, mint kizárólagosan egy elemre specifikusnak. Ennélfogva egy adott káros elemnek vagy egy elem fölöslegének a specifikus eltávolítása anélkül, hogy más esetleg létfontosságú elemek anyagcsere-egyensúlyait megzavarnánk a módszer lényegi követelménye. A 15.2. táblázatban néhány ilyen, a kelátterápiában használatos komplexképzőt és az általa eltávolítani képes fémiont tüntettük fel.

15.2. táblázat: A kelátterápiában használatos néhány ligandum.

A továbbiakban néhány elem anyagcserezavarából fakadó hiány- és fölöslegbetegségről teszünk említést.

Vas

A vas hiánya, hemoglobinhiányt, vérszegénységet idéz elő. Az anyagcsere-folyamatok bonyolult kapcsolatrendszere miatt azonban nem csak a vas hiánya idézi elő a vérszegénységet, hanem a réz, vagy a kobalt hiánya vagy az Al(III) felhalmozódása. A vashiányos vérszegénység megszüntetése a vas megfelelő formában való pótlásával érhető el. Különösen fontos ez a terhesség időszaka alatt, amikor a magzat fejlődése az anyánál fokozott vasfelvételt tesz szükségessé.

A vasfölösleg kialakulásához (hemokromatozis, hemosziderosis) általában a rendszeres vértranszfúzió vezet. Amint azt az 5. fejezetben ismertettük, az egészséges szervezet csak 1-2 mg vasat választ ki naponta, ugyanakkor 30-40 mg vörös vérsejtet bont le és ennek vastartalmát mind a ferritinben tárolja. A β-Thalassemia, mely elsősorban a mediterrán égövben elterjedt, kóros hemoglobintermeléssel járó betegség, ma elsősorban csak rendszeres vércserével gyógyítható. Ez viszont idővel a vas rendkívüli felhalmozódásához vezet. Ezeknél a betegeknél 2?-3? év alatt 8?-1?? g-ra is megnőhet a szervezett vastartalma. Ez súlyos érrendszeri elváltozásokat idéz elő, nemkívánatos vaslerakódások révén (ennyi vasat nem képes a szervezet az oldható ferritinben tárolni és a rosszul oldódó hemosziderin veszi át a vas jórészét, hemosziderózis), ami lassanként halálhoz vezet. Az egyetlen megoldás a fölös vas kelátkomplex formájában való eltávolítása. A közelmúltig kizárólag a 15.2. táblázatban feltüntetett dezferrioxamint alkalmazták. A dezferrioxamin az egyetlen klinikailag elfogadott vas-kelátor, amit egyéb vastúlterhelés betegségek és a malária kezelésére is használnak. Ez utóbbi hatása feltehetően a vas metabolizmus széteséséhez rendelhető. A dezferrioxamimmal képződött vaskomplex stabilitása széles pH-tartományban (1-12) igen nagy. A kialakuló 1:1 sztöchiometriájú komplexben a három hidroxamátcsoport koordinálódik a fémionhoz. A dezferrioxamin farmakológiai tulajdonságai nem ideálisak: szájon át történő adása esetén csak nagyon lassan szívódik fel, nagy része a gyomorban lebomlik, és így csak injekció formájában adagolható. Másrészről a szer elég drága (ami az érintett szegény ázsiai országokban való használatát erősen korlátozza. Nagy az igény új, szájon át adható kelátképzők iránt. Az ez irányú kutatások eredményre vezettek és ma már két új vegyület (15.1. ábra) is forgalomba hozatalra vár.

15.1. ábra: A vasfölösleg eltávolítására alkalmazható új, orális komplexképzők.

Réz

A táplálék réztartalma a bélből szívódik fel döntően aktív transzport révén, a membránon való áthaladásban Cu-ATP-áz enzimek közreműködésével. Ezután a véráram révén jut el a májba, ahol redoxi átalakulások után végül Cu(II) formában tárolódik a ceruloplazminban, ill. a tioneinekben. Rézhiány alakulhat ki az élő szervezetekben a réz biohozzáférhetőségének csökkenése miatt. A táplálékkal felvett réz például csapadékképződés miatt elveszhet. Molibdénben gazdag legelőkön tartott állatoknál figyelték meg azt például, hogy Cu2MoS4, ill. egyéb tiomolibdátok képződése vezethet rézhiányhoz. Hasonlóan rézhiány alakulhat ki fölös mennyiségű vas, cink és kadmium esetén, ezen elemek antagonisztikus hatása miatt. Embernél, az újszülötteknél fenyegethet az akut rézhiány kialakulása, mivel a réztranszport és tárolás összetett rendszere, beleértve a szérum albumint, a ceruloplazmint és a metallotioneineket, csak a születés után néhány hónappal stabilizálódik. A réznek a légzési láncban játszott alapvető szerepe (citokróm c oxidáz) miatt, a rézhiány elégtelen oxigén-hasznosítási problémákat vethet fel az agyban, ami súlyos károsodásokat okozhat. Az újszülöttek hasonlóképpen nagyon érzékenyek a túlzott rézfelvételre is, gyakran a májban magas rézion-koncentráció alakul ki közvetlenül a születés után.

A Menkes (göndör haj) betegség a sejten belüli réztranszport örökletes rendellenessége. Az ennek következtében kialakuló rézhiány súlyos elváltozásokat idézhet elő a szellemi és fizikai fejlődésben (ennek egyik kísérő tünete a göndör haj). A hatékony terápia a rézhiány intravénás pótlása alkalmas rézvegyület formájában. A göndör haj tünet egyben arra is utal, hogy a réz részt vesz a kötőszövetek (kollagén keratin) képződésében.

A Wilson kór a szervezet réztárló képességének (a ceruloplazmin termelésnek) örökletes zavara. Ennek következtében az albuminban kötött réz nem a ceruloplazminba kerül, hanem a máj és agyszövetekben kötődik, súlyos agyi rendellenességeket előidézve. Elbutuláshoz, ill. a máj működésképtelenségéhez és ennek következtében hamar halálhoz vezet. A betegség kezelése kelátterápiával történhet. A D-penicillamin (lásd 15.2.táblázat) 2x(N,S) koordinációja révén a Cu(I)/Cu(II) állapotra elfogadható specifitást nyújt (bár a Zn(II) háztartást megzavarja; csökkentésének egy lehetősége, hogy a penicillamin mellett Zn(II)-t is juttatnak a szervezetbe) és a karboxilátcsoport biztosította hidrofilitás révén a képződő komplex a vesén keresztül könnyen kiválasztódik. Teljesen új megközelítést jelentett, amikor egy kanadai kutatócsoport a szérum rézszállító fehérjéjének specifikus rézkötőhelyét lemásolva a GlyGlyHis tripeptidet ajánlotta rézeltávolításra.

Cink

A megközelítőleg 2 g-nyi mennyiségével a cink az emberi szervezetben előforduló második leggyakoribb átmenetifém. Mintegy 200 cinktartalmú fehérjében kötve fordulnak elő (csak egyetlen oxidációs állapotban, Zn(II) formájában) és látnak el változatos biológiai feladatokat. A szervezet napi átlagos cink szükséglete kb. 15 mg (terhes anyáknál ennek közel kétszerese). Az alkoholos állapot szintén növeli a szervezet cinkszükségletét, hiszen egyik fontos előfordulása az alkohol lebomlását katalizáló alkohol dehidrogenáz enzimben van. Hiánya a növekedési hormonokban játszott szerepük miatt, növekedési rendellenességet (törpenövés), terméketlenséget, az immunrendszer gyengülését, a szervezet gyulladásos megbetegedésekre való fokozott hajlamát idézi elő. A cinktartalmú kenőcsök a sebgyógyulás folyamatát előnyösen befolyásolják. A cink hiányt jelezheti az étvágytalanság, az ízlelési érzék csökkenése. Az élő szervezet viszonylag nagy mennyiségű cinket képes tolerálni, így specifikus fölösleg betegsége nem nagyon ismeretes.

Szelén

A szelén létfontosságú elem, de hasznos koncentrációtartománya nagyon szűk (a napi szükséglet ?5? μg/nap) és 5?? μg/nap dózis fölött mérgező, súlyosan károsítja a központi idegrendszert, és jellemző elváltozásokat idéz elő a diszulfidkötéseket tartalmazó hajban és szőrben, így azok kihullnak. Emellett jellegzetes tünete még a szelénmérgezésnek a (CH3)2Se jellegzetes fokhagyma szaga, amely a leheleten, de a bőrön át is érződik. A jól ismert szerepű glutation peroxidáz enzim mellett egyes hidrgenázokban és hidrolázokban és máig ismeretlen funkciójú fehérjékben fordul elő. Ezekről egy összeállítást tartalmaz a 15.3. táblázat.

15.3. táblázat: Ismert szeléntartalmú fehérjék és enzimek, ill. feltételezett funkciójuk.

Hiánybetegsége a Keshan kór, ami izomfejlődési zavarokat idéz elő (pl. a szívizom működésének vészes legyengülése), léphet fel szelénben szegény talajú vidékeken (pl. Kína egyes északi vidékein). A Keshan kór sikeresen kezelhető volt a talajba adott NaSeO3 vagy NaSeO4 vegyületekkel. A szelénhiány máj-nekrózishoz és májrákra való nagyobb hajlandósághoz vezethet emlősökben. Epidemiológiai összefüggést találtak embernél az ivóvíz megfelelő szeléntartalma és a mell- és vastagbélrák előfordulási gyakorisága között. Normál étrend esetén szelénhiány nem léphet fel. Szelénben gazdag a gomba, a fokhagyma, a hal, és az állatok mája, veséje. A szelén terápiás koncentrációtartományának kis szélessége miatt, kifejezett orvosi javallat hiányában kiegészítő adása a normál étrend mellett, nem ajánlott.

Kalcium

A kalcium a táplálékban elegendő mennyiségben van jelen, ennek ellenére a kalciumhiány nem ismeretlen. Felszívódását a táplálékban jelenlevő anionok (főleg a foszfát) jelentős mértékben befolyásolják. A Ca2+ felvétele aktív transzporttal megy végbe. A folyamatot a D vitamin és a paratiroid hormon szabályozza csakúgy, mint a csontok képződését és feloldódását. Bizonyos kalciumanyagcsere-betegségek és tartós Ca2+-hiányos táplálkozás hatására a csontok kalciumtartalma mobilizálódhat. A környezet kalciumtartalmától függetlenül (pl. az ivóvíz keménysége) az élő szervezetek kalcium háztartása igen szoros kontroll alatt van. Az extracelluláris Ca2+ ?1?-3 M, ez egyrészről biztosítja a szilárd vázanyag (emberben a csont) normális képződését, másrészről nem vezet oldhatatlan kalciumsó kiváláshoz a szervezet más helyein, pl. a kötőszövetekben (meszesedés, kőképződés). Nagyon szűk az optimális koncentrációtartomány, amint azt az idősödő népességnél fellépő csontritkulás (oszteoporózis), ill. meszesedő erek is jeleznek.

Egyéb fémionok

Amint arra röviden kitérünk a következő fejezetben, egyes elemek, pl. az Al, Si, Zn és Ca nem megfelelő eloszlása, lokális fölöslegének kialakulása, a membránokon fokozhatja a rossz oldékonyságú neuron hidrolízis termékek aggregációját és az úgynevezett plakkok és fonadékok kialakulását, melyek az Alzheimer kór egyértelmű velejárói az agyszövetekben.

15.2. Toxikus fémionok

A nem létfontosságú elemeknek két csoportja különböztethető meg: egyrészről azok, amelyekről még nem igazolták, hogy hasznosak az élethez (vagy annak bizonyos formáihoz), mert kicsi az előfordulásuk, ill. a biohozzáférhetőségük (pl. pH?7-en az oldhatóságuk kicsi), másrészt azok, amelyeknek csak negatív hatását mutatták ki eddig, azaz mérgezőek.

Potenciálisan toxikus elemek a nehézfémek, mint pl. az Sb, Sn, Bi, Zr vagy a lantanoidák. A kifejezetten toxikus elemek között inkább szoft fémeket találunk, mint a Hg, Cd, Tl, Pb, de hard fémeket is, mint a Be vagy az Al. Az egyes elemek hasznosság vagy károsság szerinti besorolása nem tekinthető örökéletűnek. Például a szelén hosszú ideig mérgező elemnek számított és csak az ötvenes évek vége felé mozdult először a potenciális, majd a valóságosan is létfontosságú elemek csoportja felé, amikor kiderült többek között, hogy a glutation oxidáz enzim alkotóeleme. Az analitikai kémiai módszereink érzékenységének fejlődése még lehet, hogy más elemekről is ki fogja deríteni, hogy igen kis koncentrációban hasznos biológiai funkcióval bírnak, csak ma ezeket a koncentrációkat nem tudjuk biztonságosan detektálni, vagy megkülönböztetni a háttér-szennyezéstől.

Az elemek toxikus hatása általában ahhoz rendelhető, hogy hasonlóságuk révén létfontosságú elemeket szorítanak ki biológiai funkciót ellátó helyükről, és így fontos folyamatokat blokkolnak. Ilyen párokat alkotnak, pl. a Zn vs. Cd? Ca vs. Pb, Cd, 9?Sr? K vs. Tl, 134/137Cs? Mg vs. Be, Al? Fe vs. 239Pu.

Az elemek toxikusságában meghatározó szerepe van azok aktuális kémiai formájának (speciációjának). Pl. általánosan kimondható az, hogy a fémionok szerves, fémorganikus származékai, a bioalkilezett ionok, RnM+ sokkal mérgezőbbek, mint a hidratált szervetlen kationok Mn+ (RHg+vs. Hg2+). Vagy a króm a VI oxidációs állapotban részben nagyobb hozzáférhetősége miatt toxikusabb, mint a Cr(III). Az élő szervezetek különböző energiaigényes méregtelenítő rendszereket fejlesztettek ki a nemkívánatos szervetlen elemek/vegyületek eltávolítására:

  • Enzimatikus átalakításuk kevéssé toxikus formákba: pl. Hg2+ ? Hgo, As(OH)3 ? AsO43-, SeO32- ? Me3Se,

  • Biológiai membránok megakadályozzák, hogy a töltéssel rendelkező fémionok bejussanak egyes nagyon védett szervekbe, sejtekbe vagy, sejtalkotókba, pl. az agyba, a magzatba, vagy a sejtmagba.

  • Ionpumpák működhetnek, melyek a nemkívánatos vegyületeket/ionokat, pl. az AsO43--ot eltávolítják az érzékeny sejt-területekről, vagy kevéssé ártalmas formába viszik őket komplexképződés vagy csapadékképződés révén (pl. Cd2+ + S2- ? CdS?).

  • Egyes fehérjék, pl. a metallotioneinek, képesek lehetnek a nemkívánatos fémionok megkötésére és így a keringési rendszerből való eltávolítására.

  • Minthogy az egyes egyedi szervezetek érzékenysége egy adott mérgező anyagra változó lehet, a toxicitás jellemzésére az LD5? értéket használjuk (egy adott populáció 5?%-ára nézve halálos). A toxikus elemekre a különböző egészségügyi határértékeket állapítottak meg a környezetünkben (a szennyvizekben, a levegőben, az ivóvízben, az élelmiszerekben, stb.). Például a 15.4. táblázat a ivóvizekben megengedhető maximális nehézfém mennyiségeket adja meg.

15.4. táblázat: Ivóvizekben megengedett maximális nehézfém mennyiségi határértékek (201/2001. (X.25.) Korm. rendelet).

A következőkben röviden néhány mérgező elemről a legfontosabb tudnivalókat foglaljuk össze.

Ólom

A történelem során, sokoldalú felhasználása révén (vízvezetékek, betűfém, elemek és akkumulátorok, forrasztóanyagok, festékek, üzemanyag adalék) a bioszférában meglehetősen elterjedt elemmé vált. Az elmúlt 3??? évben a levegő Pb tartalma több mint 1??0-szeresére nőtt, ?,4 ng/m3-ről 5??-1?.??? ng/m3-re az erősen szennyezett helyeken.

Korábban zsíroldékonysága miatt természetes zsiradékot (pl. vajat) használtak méregtelenítésre, ma specifikus komplexképzők, pl. 2,3-dimerkapto- 1-propanol (BAL), vagy a CaEDTA, ill. az újabban kifejlesztett jó specifitású tiohidroxamát származékok alkalmazása a standard módszer (lásd kelátterápia).

A szerves ólomkationok (pl. R3Pb+) súlyos elváltozásokat idézhetnek elő a környéki vagy a központi idegrendszerben. Ezen szerves kationok fokozott toxicitása azzal magyarázható, hogy a membrán-áthatoló képességük nagy, így könnyen átjutnak a vér-agy gáton is. Emellett az ólom elsősorban a vérképző- és a gyomor-bél rendszerre hat. Viszonylag kis koncentrációban is hatékony enzim-inhibitor képessége miatt gátolja a porfirin szintézisét, ill. a ferrokelatáz inhibiálása révén a vas beépülését a porfirin vázba. Ennek megfelelően a hosszútávon jelentkező neurológiai tünetek előtt a vérszegénység kialakulása figyelmeztet a Pb mérgezésre. Ennek következtében krónikus ólommérgezés esetén a vizelet porfirintartalma jelentősen nőhet. A szerves ólomvegyületeknek, mint a kopogásgátlóként használt Pb(Et)4-nek a száműzése az üzemanyagokból, jelentősen megjavította az utóbbi évtizedben a környezet ólomterhelését, jól szemléltetve azt, hogy milyen hatékonyan tudunk szennyezett környezetünk állapotán javítani.

Kadmium

A Cd(II)-ion (ionsugár 95 pm) jelentős kémiai hasonlóságot mutat mind a Zn(II)-ion (75 pm), mind a Ca(II)- ionnal (1?? pm). A Cd(II)-ion, mint szoftabb fémion képes a cinket kiszorítani a Cys koordinált kötőhelyekről (pl. Zn-ujj fehérjék), vagy a kalciumot a csontokból. A kadmium sokkal mérgezőbb, mint az ólom. A kadmium mérgezés a csontok törékenységét fokozza, és a csontozat igen fájdalmas torzulását idézheti elő. Amint az Japánban is előfordult, ahol az un. Itai-itai (Japán egy adott területére utal) betegség elsősorban az idősebb nőket támadta meg, amikor az ötvenes években kadmiummal erősen szennyezett vízzel öntözték a rizsföldeket. Ezekben a betegekben a csontok Cd-tartalma az 1%-ot is elérte. Ha a kadmium egyszer beépült a csontrendszerbe, onnan igen lassan távozik, mert a kiürülés felezési ideje évtizedekben mérhető. Újabb civilizációs veszélyt jelentett a Ni/Cd akkumulátorok elterjedése, melyeket ma egyre inkább kiváltanak kadmiumot nem tartalmazó elemekkel.

A kadmium elsősorban a májban és a vesében halmozódhat fel, ahol eltávolításában a metallotioneineknek (5. fejezet) van jelentős szerepe. Más nehézfémekkel ellentétben a kadmium nem nagyon jut el a központi idegrendszerbe, mivel fiziológiás körülmények között az ionos Cd2+ alig tud a könnyebb membrán-áthatolóképességű fémorganikus R2Cd vagy RCd+ származékká alakulni.

Higany

Rendkívüli toxicitása (korábban emberen a szifilisz kezelésében, a növények körében, pedig fungicidekként alkalmazták) csak akkor vált közismertté, amikor Japánban a Minamata öböl vize, melyet 1948 és 196? között Hg-tartalmú katalizátor hulladékkal szennyeztek, tömeges mérgezést okozott. A higanyt a klór-alkáli ipar használja legnagyobb mennyiségben a NaOH előállítására, de éppen rendkívüli mérgező hatása miatt ez a technológia visszaszorulóban van, és egyre inkább a membráncellás eljárás (lásd a szervetlen kémiai és technológia könyveket) váltja fel.

A Hg cseppfolyós halmazállapotú, eléggé illékony, így gőzei belélegzéssel is bejutnak a szervezetbe, ahol tioláttartalmú biomolekulák (pl. a vérszérum Cys aminosavja) elősegítik kismértékű oldódását és a szervezetben való felhalmozódását. Minthogy a fizikai és kémiai laboratóriumok sok helyen, műszerekben, berendezésekben használnak higanyt, ennek a veszélynek elsősorban az ott dolgozók vannak kitéve. A krónikus Hg-mérgezés tünetei a fogak szemmel látható feketedése mellett, a vérkeringés gyengülése, a szellemi koncentráció és mozgás-koordináció képességének csökkenése, a hallás és a látás gyengülése és végül halál. A higanyt ma is nagy mennyiségben alkalmazzák amalgám formájában a fogak tömésére, az amalgámokból a higany felszívódása gyakorlatilag elhanyagolható. Bár a nyállal hosszú időn át érintkezve, igen kismértékű oldódása nem zárható ki; ennek egészségügyi kockázata ma is vitatott kérdés.

A szokásos ionos formája Hg2+ mérgező, mivel pH 7-en jól oldódik, és nem képez csapadékot a biológiailag releváns anionokkal. Sokkal veszélyesebb azonban a fémorganikus RHg+ formája, amely lipofil/hidrofil kettős sajátsága révén át tud jutni a vér/agy gáton is, és így megtámadja az idegrendszert. A Hg toxikusságát a tiolát csoportokhoz való nagy affinitása okozza, már pedig a Cys elég elterjedt aminosav az enzimek, létfontosságú fehérjék aktív centrumában, különösen a metalloproteinek között. Koordinációs száma kettő, kelátkomplexeket nem képez, de így is igen stabil kötést alakít ki a tiolátokkal, 1?16-1?22 nagyságrendű a stabilitási állandója. Koordinációs geometriája miatt a metallotioneinek nem igazán hatásosak a higany méregtelenítésében. Nagy kinetikai labilitása miatt gyorsan eloszlik a szervezetben, fő felhalmozódási területe azonban a máj, a vese és az agy.

Méregtelenítése meglehetősen összetett folyamat. Két enzim az organomerkuri-liáz és a Hg(II)-reduktáz vesz részt benne. Az organomerkuri-liáz egy kis molekulatömegű (22 kDa) fehérje, és az egyébként inert Hg-C kötés hasadását katalizálja (15.1. egyenlet). A fehérje négy Cys-t tartalmaz, mely alapvető szerepet játszik az enzim működésében. A koordinative kötött Hg(II) redukcióját a kevésbé mérgező elemi Hg-nyá a Hg(II)-reduktáz enzim végzi, amely egy FAD és NADPH tartalmú dimer fehérje 2x6? kDa molekulatömeggel (15.2. egyenlet). Egy FAD ás négy Cys oldallánc található a két alegység (α1 és α2) határán elhelyezkedő aktív centrumában. A Hg(II) koordinációs számának növekedése, valamint a két alegység közötti koordinációja (a Hg(II) aktiválása) része a ma még jórészt ismeretlen reakciómechanizmusnak.

Tallium

Az eddig tárgyalt mérgező fémekhez hasonlóan a Tl+ is erősen tiofil. Egyvegyértékű kationja Tl+ formájában fordul elő fiziológiai körülmények között. A K+-hoz való nagy hasonlósága miatt a kálium-csatornán keresztül jut be a sejtekbe, és ott megkötődve fejti ki zavaró hatását. A Tl neurotoxikus elem, és krónikus mérgezésben bénulást okoz, de az első tünetei a haj kihullása és gyomor-bél rendszeri zavarok. Tallium-mérgezés esetén a megfelelő ellenintézkedés a dialízis, a K+ pótlása nagy mennyiségű vegyes vegyértékű Fe(II)-Fe(III)-cianid kolloid adásával. Ez a komplex egy nem mérgező cianid vegyület, szerkezeténél fogva, mint kationcserélő működik, és képes a nagyméretű kationok, a Tl+ és a K+ eltávolítására a szervezetből.

A berillium és az alumínium

A periódusos rendszerben megfigyelhető diagonális hasonlóság révén ez a két fémion mérgező tulajdonságaikban is hasonló. Mindkettő kifejezetten hard természetű, így az előző fémionokkal ellentétben nem a tiolát, hanem a negatívan töltött oxigén donoratomokon való megkötődés révén ártalmas.

A berillium elsősorban, mint ötvözőanyag terjedt el. A szervezetbe bejutva (pl. gőzei révén) elsősorban a tüdő megbetegedését idézi elő (berillózis) amely könnyen a tüdő rákos elváltozásához vezet. A Be(II) a Mg(II)-ot helyettesítve képes a DNS és az RNS szintézis befolyásolására, ennek révén karcinogén. A Be(II) drasztikus hatással van a foszfátok és a kinázok aktivitására.

Az Al(III) tulajdonságai révén, hasonló mérgezést kiváltó beavatkozásokra képes. Azonban a rosszabb biohozzáférhetősége és a szervezet hatásosabb védekező mechanizmusa (a rosszul oldódó hidroxidok és foszfátok a gyomor-bél rendszerben megakadályozza felszívódásukat) révén kevésbé tűnik veszélyesnek. Neurotoxikusságára a veseelégtelenség miatt rendszeres hemodialízisen áteső (nagy Al(III)-tartalmú kezeletlen csapvízzel) betegeknél megfigyelt neurológiai elváltozások (dialízis demencia) hívta fel a figyelmet. A keringési rendszerben a vérszegénységnek egy speciális fajtáját (nem vasfüggő mikrocitikus anémia) okozza, feltehetőleg a hemoglobin szintézisében és működésében szerepet játszó 2,3-difoszfogliceráttal való kölcsönhatás révén. A csontrendszerben a Ca2+-ot helyettesítve okoz rendellenességet (osteomalachia). Ez utóbbi hatást kivéve mérgező tulajdonsága elsősorban a Mg(II) helyettesítésén alapszik, mivel a szerves foszfátokhoz (pl. ATP) való affinitása 7 nagyságrenddel nagyobb, mint a Mg(II)-vé, ezzel elvileg minden ATP részvételével lejátszódó (ilyen a szervezetben végbemenő reakciók 60%-a) reakciót megzavarhat. Még ma sem tisztázott a szerepe az időskorú elbutulás egy speciális fajtájában az Alzheimer kórban. A legelfogadottabb vélemény ma az, hogy az Al(III) nem kiváltója a kórnak, de a negatívan töltött hard oxigén donoratomot tartalmazó donorcsoportokhoz ismert nagy affinitása miatt az agyban keletkező rendellenes fehérje-aggregátumok (foszforilált, ill. karboxilát és szerin-OH oldallánc donorcsoportokban gazdag neuron lebomlási termékek, mint az amiloid plakkok és neurofibrilláris fonadékok) képződését fokozhatja, és mint rizikófaktorral kell vele számolni. Más elemek, pl. a Zn(II), Cu(II) lokális fölöslegének kialakulása az agy bizonyos részein hasonló hatást válthat ki.

Króm

Fiziológiai körülmények között kétféle oxidációs állapotban fordulhat elő, a Cr(III) és a Cr(VI). A Cr(III) biohozzáférhetősége a rosszul oldódó hidroxidja miatt rossz, ugyanakkor a CrO42- szerkezeti hasonlósága révén a szulfát és a foszfát csatornán keresztül viszonylag könnyen fel tud szívódni, és el tud jutni a sejtmagba is, hacsak gyorsan nem redukálódik hem- és flavoproteinek, ill. glutation által Cr(III) állapotba. A Cr(VI)?Cr(III) átmenet igen reaktív gyökképző köztitermékei a sejtmag DNS-ét támadhatják meg, és így karcinogének. Nem kevésbé veszélyes a sejtmagban a Cr(III), amely ligandumcsere reakcióit tekintve igen inert, és így irreverzibilisen kötődve a DNS foszfátcsoportjain, befolyásolni tudja a DNS-t genetikai funkciójában (15.2. ábra).

15.2. ábra: A kromát felvétele és redukciója a sejt különböző részeiben.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Említsen néhány jellemző példát a fémionok hiányának és fölöslegének káros bilológiai hatására!

- A fémionok hiányának és fölöslegének hatására kialakuló rendellenességek megszüntetésének lehetőségei.

- A vas és a réz hiányának és fölöslegének betegségei és kezelése.

- A kelátterápia.

- A legfontosabb toxikus fémionok és hatásuk az élő szervezetekre: általános elvek és konkrét hatások.

Chapter 16. 16. FÉMKOMPLEXEK GYÓGYÁSZATI JELENTŐSÉGE: DIAGNOSZTIKAI ÉS TERÁPIÁS SZEREK

Kulcsszavak: ciszplatin, ruténiumkomplexek, DNS, technécium, radioaktív izotópok, röntgen és MRI kontrasztanyagok, ezüst, arany, bizmut. lítium, vanádium.

Bár a szervetlen anyagokat ősidők óta alkalmazzák a gyógyászatban, a gyógyszeripart ma is a hagyományos szerves vegyületek és a szerves kémia uralja és jelentős idegenkedés tapasztalható fémvegyületek gyógyszerként való alkalmazása terén. Ezt az idegenkedést fokozzák azok a felismerések, amelyek egyes nehézfémek toxicitásával és egyéb környezeti ártalmaival vannak összefüggésben. A higany-, ólom- vagy talliumvegyületek különféle alkalmazásai ugyan valóban egyre nagyobb mértékben visszaszorulnak, a bioszervetlen kémia újabb eredményei ugyanakkor jelentős felhasználási lehetőségeket is kínálnak a gyógyászatnak. Ez nem csupán a 25 körüli létfontosságú elemre korlátozódik, hanem számos nem létfontosságú, de fiziológiai hatású és radioaktív elemre, ill. ezek meghatározott vegyületeire is.

A szervetlen vegyületek vagy méginkább a szervetlen és koordinációs kémiai ismeretek gyógyászati alkalmazásainak az alábbi főbb területei lehetségesek:

  a létfontosságú elemek hiányának pótlása (pl. a Fe, Cu, Zn, Se kiegészítő adagolása)

  a fémfölöslegnek kelátképző ligandumokkal történő eltávolítása (beleéretve a toxikus és létfontosságú elemek fölöslegének eltávolítását)

  nem létfontosságú elemek vegyületeinek (pl. Pt, Li, Au, Bi) terápiás alkalmazása

  a fémkomplexek diagnosztikai alkalmazása, pl. röntgen (pl. Ba, I) és NMR (pl. Gd, Mn) kontrasztanyagok

  radioaktív elemek komplexvegyületeinek diagnosztikai (pl. 99mTc) vagy terápiás (186Re) alkalmazása

  az enzimatikus folyamatok befolyásolása: enziminhibíció és aktiválás.

A felsorolt területek közül az első két kérdéscsoportot, azaz a fémionok hiányával vagy fölöslegével összefüggő betegségeket és azok gyógyításának lehetséges módozatait a 15. fejezetben már tárgyaltuk. A továbbiakban a teljesség igénye nélkül összefoglaló áttekintést adunk a fémkomplexeknek a gyógyászat különböző területein való alkalmazásának mai állásáról, vagy az alkalmazást célzó ma is folyó kutatások helyzetéről.

16.1. Rákellenes szerek

A gyógyászatban alkalmazott legismertebb komplexvegyületek vagy komplexképző ligandumok képletét a 16.1. ábrán foglaltuk össze. Ezek között legnagyobb számban rákellenes szerekkel találkozunk és közöttük is a platina különböző komplexvegyületei a legkiterjedtebben használatosak. A ciszplatin (cisz-diammin-dikloro-Pt(II) vagy cisz-DDP¸ 1) rákellenes hatását még az 1960-as évek elején fedezték fel (B. Rosenberg és munkatársai) és napjainkban ez a vegyület (vagy származékai) az egyik legszélesebb körben és legsikeresebben alkalmazott gyógyszer a rák kemoterápiájában. Az 1983-as bevezetése óta csak az USA-ban évente kb. 30 000 beteg gyógyulása köszönhető e szernek, és ez egyben évi 100 millió USD bevételt jelent a gyógyszergyáraknak. Számos rosszindulatú daganattal szemben igen hatásos, különösképpen a hererák kezelésében mutat jó eredményt, de más szerekkel (pl. bleomicin, vinblasztin, adriamicin, doxorubicin, 5-flouracil) kombinációban hatásos a fej, nyak, a petefészkek és a húgyhólyag rákos elváltozásainak kezelésében. A kezelés hatásosságát sok esetben a ciszplatin-rezisztens daganatok kifejlődése gátolja.

16.1. ábra: A fontosabb gyógyászati hatású fémkomplexek és komplexképző szerek.

A ciszplatin-terápia leggyakoribb mellékhatásai a vese és az emésztőszervek problémái, mint a legáltalánosabban ismert hányinger, a Pt(II)-nek enzimfehérjék tiolátcsoportjaival való kölcsönhatásán keresztül ezen enzimek funkcióinak gátlásában nyilvánul meg. A ciszplatin második generációs analógjai, mint a diammin-ciklobutadién-karboxiláto-Pt(II) (carboplatin, 2), a glikoláto komplex a nedoplatin (3) és az oxaláto komplex az oxaliplatin (4) hasonló antitumor aktivitásúak, de toxicitásuk lényegesen alacsonyabb, és különösen a tüdő, a vastagbél, és a petefészek rákos megbetegedéseiben alkalmazzák sikerrel. Az eddig említett első- és második generációs Pt(II)-komplexek csak intravénásan adhatók (oldhatósági problémák és kis hidrolitikus stabilitásuk miatt). A Pt(IV) vegyületek egy új csoportját már szájon át (orálisan) lehet adni. Ilyen például a JM216 elnevezésű, klinikai tesztelés alatt lévő, oktaéderes Pt(IV) komplex (5).

A platinakomplexek hatásmechanizmusát ma is kitrerjedten vizsgálják és a főbb reakcióutak a 16.2. ábra szerint értelmezhetők: (1) kelátképződés, egy guanin (G) bázis nitrogén (N7) és oxigén donoratomjához való koordináció révén, (2) intrastrand keresztkötés egy DNS-szál két szomszédos purinbázisának N7 atomjával, (3) interstrand keresztkötés a DNS-molekula két szálának guanin vagy citozin bázisának N donoratomjával és (4) egyfogú Pt G (P) adduktum képződés, általában fehérje részvétellel. A (2) kölcsönhatás a legkedvezményezettebb és a Pt komplex ? 85% kötődik ily módon.

16.2. ábra: A ciszplatinnak a DNS-hez való kötődésének lehetőségei: (1) a guanin bázishoz való kötödés (2) DNS szálon belüli intrastrand kötődés, (3) DNS szálak közötti interstrand kötődés, (4) DNS-hez és fehérjéhezhez való vegyes kötődés.

A cisz és transz izomerek hatékonyságában általában meglévő igen jelentős különbség a szerkezeti különbségek mellett, kinetikai tényezőkkel is magyarázhatók, a transz komplexek kiürülése általában sokkal gyorsabb, utalva arra, hogy a DNS javító mechanizmusok sokkal inkább érzékelik a transz komplex okozta egyfogú kölcsönhatásokat, mint a cisz izomer intrastrand kölcsönhatását. A transz komplexek azonban nem mind hatástalanok és egyes komplexeikkel (pl. a 7M335, 6), nagyon biztató eredmények születtek ciszplatin rezisztens rákos sejtkultúrákon.

A kölcsönhatások sokszínűségét és a biológiai hatás összetettségét jól mutatja, hogy újabban figyelemreméltó eredményeket értek el többmagvú Pt(II) komplexekkel is (pl. a BBR3464, 7), melyeknél a +4 töltés növeli a komplex DNS-hez való affinitását, és így az egészen hat szomszédos bázispárra is kiterjedő interstrand keresztkötés(ek) kialakulásának a valószínűségét.

A többi platinafém közül egyes Ru(III) komplexek bizonyultak aktívnak és hatásosnak különösképpen, mint áttétek kialakulását gátló szerek. A transz-[Ru(III)Cl4(DMSO)(Im] (NAMI A, 8) a klinikai vizsgálatok szakaszában van. Bár a komplex készségesen köt a DNS guanidinjének N7 donoratomjához, és az adeninhez és citozinhoz is. A GG intrastrand keresztkötés kialakulása sztérikusan kedvezményezetlen, így biológiai hatása is feltehetően eltérő a Pt komplexekétől.

A platinatartalmú antitumor szerek újabb és újabb generációinak kifejlesztésével nagyszámú egyéb fémkomplexeket is teszteltek klinikailag rákellenes hatásra. Igen változatos kémiai tulajdonságaik révén ezek hatásmódjukban és biológiai aktivitásuk spektrumában is igen különbözőek lehetnek. Eltérő redoxi tulajdonságaik, hirolitikus reakcióik és kinetikai sajátságaik határozzák meg a kölcsönhatásukat a különböző lehetséges biológiai célmolekulákkal.

A titanocén-diklorid (9) rákellenes hatásának 1979-ben történt felfedezését követően jó néhány metallocén (V, Nb, Mo, Fe, Ce, Sn) aktivitását is igazolták. A bisz-diketonáto Ti(IV)-komplex, a budotitán (10) igen hatásosnak bizonyult a vastagbélrák kezelésében és klinikai kipróbálás alatt van.

A bisz(difoszfonil)Au(I)-komplexek (pl. 11) hatásmódja jelentősen különbözik a ciszplatinétól, nem a sejtmag DNS-re, hanem a mitokondriumra hat, annak membrán- potenciálját befolyásolja. A Ga(III)-sók széleskörű rákellenes hatást mutatnak. A szérum fehérje transferrin közvetítésével juthatnak el a rákos sejtekig. Figyelemreméltó eredményeket értek el velük a tüdő- és a csontrák kezelésében.

A vas, a ruténium és a réz potenciálisan interkalációs szerves ligandumokkal (mint a bleomicin, a Fe(III)-mal, vagy az 1,10-fenantrolin a Cu(I)-gyel vagy Ru(III)-mal képezett komplexei lehetnek hatásos rákellenes szerek. A redoxi aktív fémeknek meghatározó szerepe van a DNS oxidatív, vagy fotoindukált hasításában.

Bár az utóbbi évtizedekben számos rákellenes hatást mutató platina és nem-platina fém (gyakorlatilag a periódusos rendszer minden fémes elemének) komplexét állítottak elő, meg kell jegyeznünk, hogy in vitro sőt in vivo rákellenes hatást mutató komplexek előállítása, még nem jelenti a klinikai alkalmazhatóságukat. Oldhatósági, gyógyszerformázási problémák, a metabolitok nem kellő pontosságú jellemzése és egy sor más ilyen „gyakorlati” probléma meggátolja klinikai bevezetésüket.

16.2. Radioaktív diagnosztikai és terápiás szerek (nukleáris medicina)

A nukleáris medicina a betegségek diagnosztizálása vagy kezelése céljából radioaktív vegyületeknek a szervezetbe való juttatásával foglalkozik. Radioaktív magot tartalmazó fémkomplexek felhasználása, pl. a rák korai kimutatására a vegyület szelektív felvétele és a rákos elváltozás „láthatóvá” tétele révén jelentősen segíti az időbeli sebészeti beavatkozás vagy kemoterápiás kezelés alkalmazását, mielőtt a rák előrehaladottabb állapotba jutna. A diagnosztika céljából alkalmazott radioaktív izotópok, ideálisan rövid élettartamú, kis energiájú γ-sugárzó (α vagy β részecskéket lehetőleg nem kibocsátó) magok. A sugárzás jól detektálható, de nem erősen roncsoló. Az 16.1. táblázatban feltüntetett izotópok közül kiemelkedő jelentőségű a 99mTc, amelynek 140 keV energiájú γ-sugara szcintillációsan jól detektálható és éles képet ad. Hasonlóképpen használhatunk sugárzó izotópokat terápiás célra is, a kórós szövetek elroncsolása révén. Az e célból felhasznált izotópoknak az optimális élettartam mellett, roncsoló sugárzást (α vagy β) kell kibocsátania, hiszen a szövetek elpusztítása a cél. A 16.1. táblázatban néhány diagnosztikai és terápiás célra leggyakrabban alkalmazott radioaktív magot tüntettünk fel.

16.1. táblázat: Diagnosztikai és/vagy terápiás célra alkalmas radioaktív fémizotópok.

A rövid felezési idejű 99mTc előállítására kifejlesztett 99Mo → 99mTc generátor jelentősen megkönnyítette ezen metastabil izotóp széleskörű diagnosztikai alkalmazását a nukleáris medicinában. A generátorban lejátszódó bomlási folyamatot a 16.1 egyenlet szemlélteti. A radionuklidot a generátor Al2O3 kolonnáján kötött 99MoO42 -ból képződő 99mTcO4izotóniás sóoldattal történő szelektív eluálásával nyerjük az eltérő töltésviszonyok hasznosításával. Az eluált 99mTcO4-ot steril körülmények között redukálhatjuk a szükséges vízoldhatósági stabilitási és szövet-felhalmozódási specifitást biztosító ligandum(ok) jelenlétében. Az így előállított komplexeket injektáljuk 10 6 10 8 M koncentrációban. Például az izocianid komplex [Tc(CNR)6]+(R= t-Bu, CH2CO2But, stb.) a szívszövetben szelektíven halmozódik, így a szív leképezésére jól hasznosítható. A 99Tc(IV) különböző difoszfonáto komplexei a növekvő csontszövetekben akkumulálódnak így rákos csontáttétek diagnosztizálásában alkalmazhatók.

A rákos sejtek által a véráramból szelektíven felvevő molekulák között igen jelentős a rákellenes hatású antibiotikum a bleomicin, amely a számos koordinációs helye lévén a legtöbb radioaktív fémionhoz jól kötődik, az 57Co(III) komplexe mutatja a legjobb rákos sejt/vérszérum megoszlási arányt. Sajnos az 57Co hosszú felezési ideje miatt (lásd az 16.1. táblázatot) klinikai alkalmazhatósága korlátozott. A bleomicinhez kovalensen kapcsolt EDTA oldallánccal rendelkező ligandum 111In(III)-komplexe már kiváló használhatóságúnak bizonyult. A 67Ga(III)-citrát komplex szintén széleskörűen alkalmazható diagnosztikai készítmény.

A radioaktív izotópok alkalmazásának fő problémája az izotópnak a leképezendő vagy kezelendő szervbe való szelektív eljuttatása. Igen hatásos és egyre széleskörűbben alkalmazott módja ennek a kinetikailag kellően inert radionuklid komplexnek (poliaminokarboxilátok vagy foszfonátok) a rákos sejt antigénekre, receptorokra vagy hormonokra specifikus antitesthez való kovalens kötése. Pl. a DTPA kettős anhidridje könnyedén acilezheti az antitest fehérje szabad -NH2 csoportját kialakítva így, egy a radionuklid kötésére nagy stabilitású és kellő kinetikai inertségű funkcionális helyet.

16.3. Kontrasztanyagok

Testszöveteknek és testnedveknek az elektromágneses sugárzással való kölcsönhatása révén való leképezése az orvosi diagnosztika rutin eljárása. A röntgensugárzás diagnosztikai alkalmazása közel 100 éves múltra tekint vissza. A szervetlen vegyületek röntgen kontrasztanyagként való alkalmazása ugyancsak régi eredetű és a BaSO4 talán a legismertebb példa ezen a területen. A nagy rendszámú elemek általában nagy röntgenabszorpcióval rendelkeznek, ezen alapszik a csont (Ca- és P-tartalom) és lágy szerves részek (C, H, N, O elemek) röntgenképen való megkülönböztethetősége. Az egyébként mérgező Ba-vegyületek (Z = 56) közül a BaSO4 alkalmazhatósága a vegyület nagyon rossz oldékonyságával van összefüggésben. A kontrasztanyagok alkalmazhatóságának alapfeltétele ugyanis, hogy a fizikai alkalmasság mellett a szigorú toxicitási feltételeknek is megfeleljenek, azaz mellékhatás és lehetőleg maradék nélkül ürüljenek a szervezetből. Az újabb röntgenkontrasztanyagok között az említett célnak leginkább a szerves jódvegyületek (Z = 53) felelnek meg. Humán célokra ma két elfogadott kontrasztanyag létezik, a bárium-szulfát szuszpenzió a gyomor-bél traktus leképezésében és a szerves (tri)jód vegyületek az erek vizsgálatában (az angiográfiában).

Az NMR technikát is mintegy 30 éve alkalmazzák már az orvosi diagnosztikában. A 70-es, 80-as évek a technikai fejlődésben jelentettek nagy lépést. 2003-ban az NMR tomográfiában elért jelentős fejlődésért az amerikai Paul Lauterbur és az angol Sir Peter Mansfield orvosi Nobel díjat kapott. A detektorsorok és a gyors számítógépek alkalmazása a képfeldolgozásban az emberi test, testrészek, szervek keresztmetszeti (tomográfiás) leképezését tették lehetővé, ez a CT technika (computer tomography). Az NMR képalkotás (MRI) a normális és abnormális szövetek 1H NMR rezonancia sajátságában (elsősorban a szövetek víztartalma révén) levő különbségeket detektálja képalkotó paramágneses kontrasztanyag jelenlétében. A ma alkalmazott MRI kontrasztanyagok Gd(III)-, Mn(II)- vagy Fe(II)-ionokat tartalmaznak, melyek nagyszámú párosítatlan elektront (7, 5, ill. 5 elektront) tartalmaznak, és hosszú az elektron spin relaxációs idejük. Ezeket a fémionokat a kellő hatás eléréséhez nagy koncentrációban (0,5-1,0 mM) kell alkalmazni. Toxicitásuk csökkentése érdekében nagy stabilitású és inert komplexbe kell „csomagolni”, hogy az alkalmazás ideje alatt a fémionion ne váljon szabaddá, és így ne tudjon kölcsönhatásba lépni a különböző szérum és sejtfehérjékkel. Négy Gd(III)-komplexet használnak ma széleskörűen a klinikai gyakorlatban például a vér-agy gát rendellenességeinek kimutatására. A DTPA (Maquevist, 12) és a DOTA komplexe (Dotarem, 13) ionosak, míg a DTPA-BMA (Omniscan, 14) és a DOTA-HP komplexe (Prohance, 15) semlegesek, ezek alacsony ozmolaritása csökkenti az injekció okozta fájdalmat.

16.4. Fertőzésgátló szerek

Az ezüstvegyületeket (pl. AgNO3) már régóta használják fertőzések megakadályozására (mikrobák ellen) a gyógyászatban. Az ezüst-szulfadiazin (lásd 16.3. ábra) klinikailag széleskörűen használt baktérium- és gombaölő szer. Alkalmazását különösen az égési sebek kezelésével kapcsolatban tartják előnyösnek. Ez egy rosszul oldódó polimer vegyület, amiből lassan szabadul fel az AgI. Az AgI citotoxicitásának mechanizmusa nem ismert.

16.3. ábra: A szulfadiazin és Ag(I)-komplexének szerkezete.

Az antimont is évtizedek óta használják gyógyszerként. Az Sb(III) általánosan toxikusabb, mint a SbV, így gyakran ez utóbbit előgyógyszerként használják. Az Sb(V) szénhidrátokkal képezett vegyületei, mint az N-metilglükamin-antimonát, a Leishmaniasis, e sejten belüli élősködők által okozott fertőzés klinikailag alkalmazott gyógyszere.

A Fe(III)-at erősen kötő dezferrioxamint a malária ellen használják, hatása feltehetően a malária paraziták vas metabolizmusának megzavarásán alapszik.

A polioxometallátok (heteropolisavak) vírusellenes hatást mutatnak. Aktivitásuk függ a vegyület szerkezetétől, töltésétől és az elleniontól is. Hatásuk, a vírusnak a sejt felületén való adszorpciója befolyásolásától függ. A polioxometallátok gyengén szívódnak fel az orális adagolásukat követően, ill. még akkor is, ha közvetlenül a véráramba juttatjuk őket. Különböző plazmafehérjék visszatartják őket, és így nem érik el azt a helyet, ahol hatásukat kifejthetnék. Így fontos feladat a jobb biohozzáférhetőségű polioxometallátok kifejlesztése.

A makrociklusos biciklámok (pl. 16) a HIV leghatárosabb inhibitorai közé tartoznak. A Zn(II)-komplexeik szintén hatásosak. A biciklám a HIV-vírusnak a sejtbe való bejutását gátolja a retrovírus replikációs ciklusainak korai reakcióiban.

16.5. Gyulladásgátló aranykomplexek

Az arany az emberiség története során mindig kulcsszerepet játszó anyag volt, amelynek gyógyászati alkalmazása is ősidők óta ismert. Elsősorban fertőzésgátló és gyulladás-csökkentő hatására figyeltek fel és többnyire kolloid aranyszolokat alkalmaztak ilyen célokra. Ezen alkalmazásokkal kapcsolatban fontos kiemelni, hogy ilyen jellegű biológiai aktivitása szinte minden nehézfémnek és vegyületeiknek van, de a toxicitásból adódó súlyos mellékhatások általában kizárják a modern orvostudományban való felhasználhatóságot. A krizoterápia, az izületek gyulladásos megbetegedéseinek (rheumatoid arthritis) aranyvegyületekkel történő kezelése, azonban általánosan elfogadott gyógymód a mai orvosi gyakorlatban is. Elsősorban különböző Au(I)-tiolátok, mint az auranofin (2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-1-D-gluko-piranozato-S-trifenil-foszfináto-Au(I) 17) a leginkább alkalmazottak. Az aranyvegyületek gyulladásgátló hatásának mechanizmusa nem ismert, a feltételezett hatások között az egész szervezetre kiterjedő, mint például az immunrendszert befolyásoló, hatásokat, ill. teljesen specifikus biokémiai folyamatokat is feltételeznek. Újabb elképzelések szerint az alkalmazott aranykomplexek „előgyógyszerek”, melyek gyors metabolitikus átalakulásokon mennek át a szervezet biomolekuláival.

16.6. Bizmutvegyületek, mint gyomorsavmegkötő és fekélyellenes szerek

A bizmut régóta használatos elem a gyógyászatban. A XX. században különböző bizmutkomplexeket (szubnitrát, szubgallát, szubcitrát, tartarát, szubkarbonát és szubszalicilát) használtak a szifilisz, a magas vérnyomás, a fertőzések, a gyomor-bél rendellenességek kezelésére. Itt most csak a címben említett felhasználásait tárgyaljuk röviden. A szódabikarbóna kellemetlen mellékhatása és kis pufferkapacitása, ill. az Al(III) toxikus voltának felismerése óta a bizmutvegyületek, mint gyomorsav megkötők (antacidok) növekvő jelentőséget kaptak. Hozzájárult ehhez az is, hogy hatásosak gyomor- és bélfekélyek ellen is, így kettős hatásuk széleskörű alkalmazásukat vonta maga után.

A bizmuttartalmú gyógyszerek szerkezete pontosan nem ismert. A fém koordinációs száma 3 és 10 között váltakozik és a koordinációs geometria gyakran torzult. A Bi(III) igen savas vízben (pK1 ? 1,5), nagy a pufferkapacitása és könnyen képez hidroxo- és oxohidas klasztereket. A legjobban ismert a Bi(III) citráttal alkotott vegyülete. A domináns részecske a dimer, amelyben a citráthíd szerepet is betölt összekapcsolva a Bi-atomokat. Ezek a dimerek láncokká, lapokká aggregálódhatnak és a fekély felületére lerakódva fejthetik ki védőhatásukat.

16.7. Idegrendszerre ható fémvegyületek

Egyszerű szervetlen lítiumvegyületek, mint a Li2CO3 széles körben (a legtöbb országban a népesség 1 ezreléke esetében) használatosak a kétfázisú idegrendszeri elváltozások, mint a mániás depresszió megelőző kezelésében. A szokásos terápia grammnyi mennyiségű só adását jelenti, ami 1-2 mM vérszintet jelent a kezelés során. A Li(I) komplexeinek kis stabilitása és nagy labilitása eredményezi azt, hogy eloszlása a szervezetben széleskörű. A Li+ biológiai hatása a Mg2+ és a Ca2+ biokémiájába való beavatkozáson alapszik. Így pl. a Ca2+ inhibiálja az inozitol-foszfát két enzimjét, amely a Ca2+ sejten belüli mobilizálásáért felelős. A Li+ ugyanakkor nem-kompetitív inhibitora a Mg2+ függő inozitol-monofoszfatáz enzimnek, azáltal, hogy blokkolja a hidratált foszfát felszabadulását az enzim aktív helyéről.

16.8. Inzulinutánzó fémkomplexek

Közel 25 éve fedezték fel, hogy a V(IV)-, V(V)- és peroxo-V(V) komplexek képesek az inzulin fontos tulajdonságait utánozni, vagy fokozni (így pl. a zsír és izomsejtek glükóz felvételét és oxidációját, ill. a glikogén szintézisét). Ezeknek a komplexeknek nagy előnye, hogy szemben az inzulinnal szájon át adhatók. Az utóbbi 15 évben nagyszámú vanádiumkomplexet állítottak elő és teszteltek és megállapították, hogy alkalmas szerves ligandumhoz kötött vanádiumkomplexek a biológiailag releváns 1-10 μM koncentráció-tartományban nem mérgezőek, biológiai hatásuk pedig elérheti az inzulinét. A bisz(maltoláto)VO(IV) (BMOV, 18) a klinikai 1. fázis tesztelésen megfelelt.

A komplexek biológiai folyadékokban való speciációjára vonatkozó vizsgálatok arra utalnak, hogy a hordozó ligandum szerepe elsősorban a komplex gyomorban való felszívódását befolyásolja és a vérben való szállításában a vér kis és nagy molekulatömegű vanádiumkötő biomolekulái (citrát és transzferrin) a meghatározóak.

Valaha azt gondolták, hogy a glükóz tolerancia faktor, mely a szervezetben az inzulin hatását fokozza egy Cr(III) komplex. Ma már tudjuk, hogy ez nem igaz, a nagyon inert Cr(III)-pikolinát komplex, mely elsősorban a tengeren túl az elhízás megelőzésére használt népszerű gyógyhatású készítmény, sem igen tűnik hatásosnak a diabetes kezelésében. Újabban a természetben előforduló kis molekulatömegű krómkötő anyagról (LMWCr), amely úgy találták, hogy az inzulin működésében kulcsszerepet betöltő tirozin kináz enzim aktivitását befolyásolni tudja, is kimutatták, hogy a korai közlésekkel ellentétben nem tartalmaz krómot. A króm inzulinutánzó hatásával kapcsolatos feltevések alapos vizsgálatokkal való megerősítést igényelnek.

16.9. Szív- és érrendszerre ható szerek.

A nitroprusszid-Na (19), ez a kis spinszámú Fe(II)-komplex széles körben használatos emberben a vérnyomás csökkentésére. Hatása másodperceken belül jelentkezik. A terápiás hatása a NO felszabadulásához rendelhető, amely ellazítja a szív- és érrendszeri simaizmokat.

Azt találták, hogy egyes ruténiumkomplexek (20) igen jó NO-befogók, melyek képesek a NO-szintet orvosi körülmények között szabályozni. A 20 komplex igen gyorsan (k ? 108 M 1s 1 at 310 oC) és erősen K ? 108 M 1) köti a NO-ot egy lineáris nitrozónium Ru(II) NO+ adduktum képződése közben.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Ismertessen néhány alapvető, fémtartalmú rákellenes készítményt!

- A platinakomplexek rákellenes hatásának elvi alapjai.

- A technécium és vegyületeinek diganosztikai jelentősége.

- A kontrasztanyagok alkalmazási területei és működésük értelmezése.

- Az aranyvegyületek lehetséges gyógyászati alkalmazásai.

- A lítiumvegyületek gyógyászati alkalmazásai.

- Szervetlen vegyületek a fertőzéses és gyulladásos betegségek kezelésében.

Chapter 17. 17. TÁVLATOK

Kulcsszavak: interdiszciplináris tudomány, modellezés, makromolekulák, genomika és proteomika, mutáns fehérje, mesterséges enzimek

A bioszervetlen kémia a múlt század második felének egyik interdiszciplináris tudományterülete, kialakulása óta két fő megközelítésmódot alkalmaz. Az egyik a biológiai rendszerek folyamatait a lényegük megragadásán, modellezésén és ezen általában leegyszerűsített kismolekulájú modellek vizsgálatával tárja fel, míg a másik, magát az eredeti igen bonyolult rendszert tanulmányozva törekszik a valóság megismerésére. Korábban az első megközelítést inkább a (koordinációs) kémikusok választották, míg az utóbbit a biológusok, biokémikusok és kutatóorvosok. A bioszervetlen kémia fejlődésének iránya az elmúlt 10-20 évben alapvetően megváltozott. A vizsgálati módszerek fejlődése, ill. a molekuláris biológia eszköztárának átvétele a világ vezető bioszervetlen kémiai laboratóriumaiban azt eredményezte, hogy a makromolekulák és fémionok kölcsönhatásának, ill. metalloenzimek működésének, szerkezetének molekuláris szintű tanulmányozása felváltotta a kismolekulatömegű rendszerek vizsgálatának dominanciáját. Utóbbi változatlanul igen fontos területe a bioszervetlen kémiának, azonban a makromolekuláris biológiai rendszerek vizsgálata és a kétféle megközelítés együttes alkalmazása, ami kutatócsoport hálózatokon keresztül valósulhat meg, közelebb visz bennünket a biológiai rendszerek megismeréséhez. Érdemes itt megemlíteni, hogy Magyarországon is számos kutatócsoport foglalkozik ilyen irányú kutatásokkal.

17.1. A genomika és a proteomika kora

A molekuláris biológia új eszközei, melyekkel bővebben a függelékben foglalkozunk, lehetővé tették a fehérjéket kódoló gének izolálását, szükség szerint a módosítását, sokszorosítását, tisztítását, ill. a gének alapján a fehérjék gyártását. Így magukat a makromolekulákat állíthatjuk elő és tanulmányozhatjuk különböző fizikai-kémiai módszerekkel. Ennek is köszönhetően pl. ma már számos fehérjemolekula kristályszerkezetét ismerjük.

A DNS-szekvencia, és ez alapján a fehérjék aminosav sorrendjének ismerete nagymértékben megkönnyíti a fehérjék funkcióinak azonosítását. A genomokban az egymáshoz közel eső gének valószínűleg bonyolult folyamatokban résztvevő együttműködő fehérjekomplexumokat kódolnak. Másrészt a vizsgálni kívánt fehérje szekvenciáját összehasonlíthatjuk a ma már viszonylag nagyméretű adatbázisokban rendelkezésre álló egyéb fehérjékkel. Amennyiben az aminosav-sorrend hasonlóságot mutat - úgynevezett konzervatív, vagy megőrzött szekvenciák vagy aminosavak - feltételezhető, hogy az összehasonlított fehérjéknek hasonló funkciójuk van, azaz egy családba tartoznak. Ugyanezzel az eljárással a fémion-kötőhelyek is azonosíthatók. Pl. a Fe/S klasztereket kötő fehérjékben gyakoriak a ciszteinben gazdag szekvenciák, vagy pl. a különböző élőlényekből izolált bíborsavfoszfatáz enzimekben megtalálható megőrzött koordinálódó oldalláncokról (17.1. ábra) a kristályszerkezet-vizsgálatok valóban igazolták, hogy ezek egy kétmagvú aktív központ kialakításában vesznek részt (17.2. ábra).

17.1. ábra: A különböző élőlények bíborsavfoszfatáz (BSF) enzimeinek megőrzött aminosav oldalláncai (kiemelve) alkotják az enzim fémion-kötőhelyét. A számok a fehérjelánc adott részén fel nem tüntetett aminosav egységek számát adják meg.

17.2. ábra: A velőbab bíborsavfoszfatáz (BSF) enzimének kétmagvú aktív központja a röntgenkrisztallográfiai vizsgálatok nyomán.

A fehérjék módosításának lehetősége szintén elősegíti a fémkötőhely kiválasztását. A polimeráz-láncreakció segítségével ugyanis egy koordinálódó oldallánccal rendelkező aminosav pl. His vagy Cis rutinszerűen cserélhető pl. alaninra, vagy egyéb nem koordinálódó oldalláncú aminosavra. (Az ilyen cseréket (pontmutáció) a következő módon szokás jelölni: H128A ami a fehérje N-terminális aminosavjától számított 128. pozícióban lévő hisztidin aminosavjának alaninra történő cseréjét jelenti.) Ez feltételezhetően szerkezetváltással nem jár, azonban a koordinációs hely megszűnik. Amennyiben ez a csere a módosított fehérjében (mutáns fehérje) a fémion környezetének megváltozását, vagy a fémion-kötés megszűnését eredményezi, úgy valószínűsíthető, hogy az adott aminosav oldallánc részt vett a fémion megkötésében. Ugyanez a módszer az enzimek működési mechanizmusának felderítésében is nagy jelentőséggel bír. Segítségével azonosíthatóak a szubsztrát-kötőhelyek, a különböző proton-, elektron-, vagy csoporttranszport folyamatokban résztvevő aminosav oldalláncok, stb.

A genomika és proteomika azonban nemcsak a természetes rendszerek jobb megismerését teszi számunkra lehetővé, hanem azt is, hogy új funkciókkal rendelkező mesterséges enzimeket hozzunk létre, akár a természetes enzimek kisebb-nagyobb mértékű módosításával, akár a különböző funkciók ellátására képes fehérjedomének összeillesztésével, legyenek ezek természetes, vagy a bioszervetlen kémikusok által tervezett fehérjeláncok. Az ilyen mesterséges enzimeknek a közeljövőben nagy jelentősége lehet a kutatásban, a gyógyászatban, valamint az iparban is.

17.2. Gyakorlati alkalmazások

A bioszervetlen kémiai rendszerek számos ipari alkalmazást nyernek és nyerhetnek a közeljövőben. Ugyanis amíg ma az ipari folyamatok nagy részét csak különleges körülmények között valósíthatjuk meg, ami általában nagy nyomást, hőmérsékletet, vagy szerves oldószereket jelent addig ugyanezek a folyamatok az élő szervezetekben metalloenzimek hatására szobahőmérsékleten, atmoszférikus nyomáson és vizes oldatokban játszódnak le. Elég itt pl. a fotoszintézisre gondolni, amit gyakorlatilag egyenlőre sejten kívüli térben nem is tudunk reprodukálni, vagy pl. a nitrogén-fixálás folyamatára ami az iparban a Haber-Bosch féle szintézisen alapul (> 100 bar nyomás, 673 K hőmérséklet, ill. heterogén katalizátor szükséges hozzá). Ezen okokból kifolyólag a bioszervetlen kémikusok nagy része foglalkozik a biológiai katalizátorok megértésével, lemásolásával, modellezésével. Számtalan ilyen próbálkozásról számolhatnánk be, erre azonban e könyv keretén belül nincs módunk. A gyógyászati alkalmazásokról a 16. fejezetben már szóltunk, így azokat itt nem említjük. Az alábbiakban csak néhány olyan kiválasztott példát ismertetünk, amik az emberiség aktuális problémáinak megoldásához segíthetnek hozzá.

A H2 mint a nem is olyan távoli jövő fő energiahordozója, szabályozott körülmények között történő, hatékony előállításában játszott szerepük miatt a hidrogenázok potenciális gyakorlati alkalmazásra tehetnek szert. Emiatt széleskörű kutatások folynak mind a természetes enzimek megismerése, mind modellezésük területén. A hidrogén előállításának egyik lehetséges útja a napenergia hasznosítása, a zöld növényekéhez hasonló hatékonysággal. A probléma megoldására nem elegendő egy már ismert rendszert választani, hisz maga a fotoszintézis túl bonyolult. A zöld növények és algák jó része a megkötött fényenergiát első lépésben vízbontásra használja fel. A folyamat során azonban oxigéngáz, valamint a kémiai energiát hordozó elektronok és protonok keletkeznek és az elektronokban átmenetileg raktározott kémiai energia valamilyen szerves molekula szintéziséhez használódik fel, így végső soron egy új fotoszintetizáló élőlény képződik. A képződő biomassza jelentős mennyiségű, kémiai kötésekben raktározott napenergiát tartalmaz. Az ember számára hasznos energiaátalakító rendszerhez azonban elvileg az egész, bonyolult folyamat első része elegendő. A vízbontás során képződő elektronok és protonok egyesítésével a napsugárzás formájában rendelkezésre álló energiát oxigén- és hidrogéngáz előállítására fordíthatjuk. Az oxigén és hidrogén - egymástól elkülönítve - jól szállítható és tárolható, majd a felhasználás során a megkötött napenergia víz keletkezése során felszabadul. Így a gyakorlatilag kimeríthetetlen napfény-energiát egy kémiai körfolyamatban tesszük energetikailag hasznosíthatóvá, melyben a tároláskor vizet bontunk összetevőire, a felhasználáskor pedig a komponensekből vizet állítunk elő.

Könnyen belátható, hogy a feladat ellátására alkalmas biológiai rendszer a természetben nem létezik. Egy reprodukcióra, a saját faj minél szélesebb körben való elterjesztésére "programozott" élő rendszer a molekuláris szabályozó mechanizmusok bevetésével igyekszik elkerülni azt az állapotot, amelyben aktivitása arra fordítódna, hogy az élete és a faj fenntartása szempontjából értéktelen, ezért végső soron a környezetbe kibocsátott oxigént és hidrogént állítson elő a fixált napenergiából. Bár a természetben egy kívánatos rendszer elemeit megtaláljuk, de ezek (fotoszintetikus rendszer, elektrontranszport lánc, hidrogéntermelő enzimek) különálló fajokban fordulnak elő. Megoldást jelenthetne tehát egy olyan, mesterséges metalloenzimeken alapuló mikoroorganizmus kifejlesztése a bioszervetlen kémiai, ill. a molekuláris biológiai és genetikai módszerek segítségével, melyben vízbontással oxigént és hidrogént termelhetnénk. Ez elvileg és technológiailag ma már nem lehetetlenül bonyolult feladat, de a megoldásban és az optimális körülmények kidolgozásában akár az olvasónak is nagy szerepe lehet.

A metán monooxigenáz enzimek vizsgálata, ill. modellezése kiemelkedő fontosságú a metán nagymértékű üvegházhatása miatt (a metán molekula a CO2 molekulánál jóval több infravörös sugárzást nyel el), a földgáz gazdaságos felhasználása, szállítása és tárolása szempontjából (alkoholok formájában), vagy pl. a környezeti alkánszennyeződések bioremediációja (a szennyező anyagok biológiai lebontása, ill. hasznosítása) során. Érdekes megjegyezni, hogy bár ezen utóbbi szubsztrátok mérete lényegesen eltérhet a metán molekulától, az enzim képes a megfelelő csatorna méretét valamilyen mértékben megváltoztatni, úgy, hogy az aktivitás ne csökkenjen lényegesen. Metanotróf baktériumokat alkalmaznak pl. a talaj olajszennyeződéseinek felszámolására, melyekben az aktív enzim fémionokat is tartalmaz.

A baktériumokba a megfelelő fehérjék szabályozott génjeit bejuttatva elérhető, hogy az adott fehérjemolekula nagy mennyiségben képződjön a sejtekben. Így a sejtek tulajdonságai befolyásolhatóak. Elérhető, pl. hogy a baktériumsejt mérgező tulajdonságú szerves szennyeződések jelenlétében továbbéljen, úgy, hogy azokat lebontsa. A fehérjék fémion-kötő tulajdonságait kiaknázva lehetőség van arra is, hogy toxikus fémionokat kössünk meg a szennyezett vizekből, vagy éppen egy, növényekkel szimbiózisban élő baktérium segítségével a talajokból. Ilyen próbálkozásokat szintén ismerünk a legújabb szakirodalomból. Ráadásul ezen módosított baktériumok még ellenállóvá is tehetők a toxikus anyagokkal szemben, így képesek lehetnek azokat nagy mennyiségben felhalmozni, koncentrálni. Mindezen, a környezetvédelemben igen jelentős alkalmazásokhoz szintén nagymértékben hozzájárulnak a bioszervetlen kémiai kutatások.

Egy másik lehetséges ipari alkalmazás, mint azt a fentebbiekben is említettük, a nitrogén-fixálás problémája. Tudjuk, hogy a biológiai N2-megkötés során melléktermékként H2 is képződik, amit a jelenlévő hidrogenáz enzimek felhasználnak további nitrogénmolekulák redukálószereként. Azon baktériumok, melyekben ez a hidrogenáz enzim hiányzik, kisebb hatékonysággal képesek N2-t megkötni. Ezekben a hatékonyság növelhető, amennyiben a megfelelő hidrogenáz enzim genetikai kódját a baktériumba juttatjuk. Az ilyenfajta genetikai módosítások révén tehát még hatékonyabb nitrogénmegkötő baktériumok tervezhetők.

Számos kutatócsoport dolgozik a nitrogenázok modellezésével is. A kis molekulatömegű modellek olcsóbbak, ellenállóbbak, mint a fehérjék. A jól működő modellektől azt remélik, hogy új és hatékony katalizátorokként viselkednek, hiszen segítségükkel nagymennyiségű energiát lehetne megtakarítani. Ma már számos nitrogénmegkötő modellkomplexet ismerünk. Szilárd hordozóra rögzítve ezeket akár ipari katalizátorként is használhatják majd a jövőben (17.3. ábra).

17.3. ábra: Példa egy immobilizált bioszervetlen nitrogenáz modell katalizátorra.

Végül egy példa a lehetséges gyógyászati alkalmazásokra a fémtartalmú fehérjék felhasználásával. Tudjuk, hogy a DNS-t hasító nukleázok többnyire fémion tartalmaznak aktív központjukban. Amennyiben egy ilyen nukleázban található egy önalló katalitikus domén, az egy a DNS-t specifikusan megkötő fehérjerészlethez   pl. cink-ujj fehérjéhez   kapcsolva specifikus mesterséges nukleázként viselkedhet. Ilyen enzimekkel a genetikai hibás DNS-t a megfelelő helyen elhasítva indukálható a sejt saját javító mechanizmusa, ami képes a hibás (és sérült) DNS-t kijavítani.

Bár a legtöbb, a fentiekhez hasonló jellegű alkalmazás ma még gyerekcipőben jár, látható, hogy a jövő szempontjából milyen fontos problémákra nyújthatnának ezek a kísérletek megoldást.

Ellenőrző kérdések és feladatok

- Melyek a bioszervetlen kémia fő kutatási irányvonalai?

- Hogyan használhatók a molekuláris biológia eszközei a bioszervetlen kémiai kutatásokban?

- Milyen gyakorlati alkalmazás lehetőséget vetítik előre a bioszervetlen kémiai kutatások?

Chapter 18. M1. KOORDINÁCIÓS KÉMIAI ALAPOK

A fémionoknak a biológiai rendszerekben betöltött szerepének megértéséhez nélkülözhetetlen szervetlen kémiai, koordinációs kémiai speciális ismereteket tárgyaljuk a mellékletben. Itt találhat magyarázatot a részletes részben nem tárgyalt csak említett jelenségekre, tényekre is.

M1.1.Termodinamikai aspektus

M1.1.1. A hard-szoft sav-bázis elmélet

A fémionok biológiai rendszerekben mutatkozó preferenciái a hard-szoft sav-bázis elmélettel általában jól értelmezhetők. Az M1.1. táblázatban a biológiai szempontból fontos fémionokat (Lewis savakat) és a kötési helyeket (Lewis bázisok) ezen elv szerint csoportosítottuk.

M1.1. táblázat: A biológiai szempontból fontos fémionok és ligandumok (kötési helyek) hard-szoft csoportosítása.

Ezen elv szerint a szoft nagy és jól polarizálható, míg a hard kicsi és kevésbé polarizálható részecskét jelent. A hard és szoft savak és bázisok legfontosabb tulajdonságait az M1.2. táblázatban foglaltuk össze.

M1.2. táblázat: A hard és szoft savak és bázisok alapvető tulajdonságai.

Általános szabály az, hogy a hard savak hard bázisokkal, míg a szoft savak szoft bázisokkal létesítenek stabilis kölcsönhatást. Ennek következtében a hard savak, mint a Ca2+, a Fe3+, az Al3+ az oxigén-, a fluor és részben a N donoratomokkal, míg a szoft savak, mint a Cu+, a Pt2+, a Hg2+ és a Cd2+ a kén-, a foszfor és a jód-donoratomokkal adják a legstabilisabb komplexeket. A hard-szoft sav-bázis elméletnek egyik legjobb megnyilvánulása a biológiai rendszerekben a metallotioneinek példája. Ez a viszonylag kis fehérje kb. 3?-35%-ban Cys ligandumot tartalmaz, nagy tehát a tiolát oldallánc tartalma, így a szoft fémionokat, mint a Cd2+, Hg2+, Pb2+, Cu+, Tl+ elsődlegesen kötő fehérje. A metallotioneinek egyik funkciója, hogy megvédje a sejteket e mérgező fémionoktól.

M1.1.2. A kelát effektus és a makrociklusos effektus

A kelátképződés a több donoratomot tartalmazó (többfogú) ligandumokhoz kötődik, melyek fémkomplexének stabilitása jelentősen nagyobb, mint ha egyfogú ligandumok kapcsolódnának a fémionhoz. A stabilitásnövekedés elsősorban az M1.1. egyenlet által illusztrált kedvező entrópiaváltozásból (az egyfogú vízmolekulák szabaddá válása, a rendezetlenség növekedése) fakad (M1.1. egyenlet) A komplexstabilitást a kelátgyűrű nagysága is befolyásolja. Legstabilisabbak az öttagú gyűrűk.

A többfogú gyűrűs ligandumok fémkomplexei szintén nagyobb stabilitásúak, mint a többfogú, de nyílt láncú ligandumoké. Ezt a hatást makrociklusos effektusnak nevezzük. Ez nyilvánul meg például a tetrapirrol vázas (porfirin, korrin vagy klorin vázas) vegyületek nagy termodinamikai stabilitásában. Ezen kölcsönhatásban, a gyűrűben helyet foglaló fémion mérete is meghatározó, minél inkább beleillik (belefér és kitölti a gyűrűt) a fémion a makrociklusba, annál nagyobb a stabilitás. A méretspecifitásnak a szerepe a komplex stabilitásában a makrociklus merevségének növekedésével nő.

M1.1.3. A ligandumtér stabilizáció és az Irving-Williams sor

Az átmenetifém-ionok d pályáinak térbeli irányultsága miatt egy ligandumcsoport terében elveszítik az energia szerinti elfajultságukat. Azok a pályák, amelyek az adott geometriában ligandum felé mutatnak nagyobb energiájúak, és σ-kötés kialakítására lesznek képesek, míg, amelyek nem mutatnak ligandum elektronpár felé azok kisebb energiájúak, és π-kötés kialakítására lesznek képesek. A pályák energiájának felhasadása (Δ) függ maguktól a ligandmoktól és a fém-ligandum kölcsönhatás eredményeként kialakuló komplex geometriájától. A geometriának a hatását a d pályák elhasadására az M1.1. ábrán mutatjuk be.

M1.1. ábra: A d pályák energiájának felhasadása () különböző geometriájú ligandum terekben.

Amikor ezeket a d pályákat elektronok népesítik be, a pályák betöltődésének sorrendjét az energiaminimum elvének megfelelően a ligandum tér felhasadási energia (Δ) és a spin-párosodási energia (P) viszonya határozza meg. Az M1.2. ábrán a lehetséges elektron-konfigurációkat mutatjuk be oktaéderes geometria esetén.

M1.2. ábra: A d pályák betöltődése a ligandumtér felhasadási energia () és spin-párosodási energia (P) viszonya függvényében.

Figyeljük meg, hogy csak egyféle módja lehet a d1, d2, d3, d8, d9 és d1? konfigurációknak, de két mód van a d4-d7 konfigurációk esetén. Erős terű ligandumok esetén (nagy Δ) a kisebb energiájú pályák feltöltődésekor az energianyereség meghaladja az ugyanazon pályára belépő másik elektron taszítási energiáját (P), míg gyengeterű ligandmok esetén (kis Δ) a stabilizációs energia nem elég a spin-párosodási energia legyőzéséhez, így az elektronok a nagyobb energiájú üres pályákra lépnek előbb be. A párosítatlan spinek száma az előbbi esetben kisebb lesz, ezért ezeket kis spinszámú komplexeknek nevezzük. Hasonlóan, nagy spinszámú komplexekhez jutunk akkor, ha a párosítatlan spinek száma a legnagyobb.

A fémionok sok termodinamikai és kinetikai sajátsága származik a Δ nagyságától. A fémionok extra stabilitásra tesznek szert azáltal, hogy az energia szerint felhasadt pályákkal kötnek meg ligandumokat. Ezt összességében ligandumtér stabilizációs energiának (LFSE) nevezzük. Tulajdonképpen ez az alapja a kétvegyértékű átmenetifémek első sora megfigyelt stabilitási sorrendjének: Ca2+ ? Mg2+ ? Mn2+ ? Fe2+ ? Co2+ ? Ni2+ ? Cu2+ ? Zn2+, az ún. Irving-Williams sornak is.

M1.1.4. Biológiailag fontos fémionok koordinációs geometriája

A ligandumok, a biomolekulák kötési helyei többé-kevésbé meghatározott geometria szerint helyezkednek el a fémion körül, amit alapvetően befolyásol a koordinációs szám. Az átmenetifémek első sorának ionjai maximálisan hat helyet bocsátanak a kapcsolódó ligandumok rendelkezésére. A leggyakoribb koordinációs szám a négy, öt és hat. Az átmenetifémek második és harmadik soránál hatnál nagyobb koordinációs számot is találunk. Az adott koordinációs számhoz tartozó geometriai elrendeződéseket az M1.3. ábrán tüntettük fel.

M1.3. ábra: A 2-6 koordinációs számhoz tartozó legfontosabb geometriák.

Az M1.3. táblázatban biológiai rendszerekben leggyakoribb fémionok koordinációs számát, előnyben részesített geometriáját tüntettük fel.

M1.3. táblázat: Egyes fémionok leggyakoribb koordinációs száma és előnyben részesített geometriája.

M1.1.5. A redoxipotenciál szabályzása

A biológiailag fontos redoxirendszereknél különösen fontos, az, hogy a komplexképződés hogyan hat a redoxipotenciálra. A fémion körül elhelyezkedő ligandum donoratomok, és a geometriai elrendeződés nagy különbségeket idézhet elő azon potenciál értékében, amelyen az elektrontranszfer reakciók lejátszódnak.

Vizes oldatban a Fe3+ + e- ? Fe2+ rendszer standard redoxipotenciálja +?,77 V. Ez az érték azonban megváltozik, ha különböző ligandumokat adunk az oldathoz. Az M1.4. táblázatban néhány vaskomplex redoxipotenciálját adjuk meg.

M1.4. táblázat: Néhány vaskomplex standard redoxipotenciálja.

Az M1.4. táblázat alapján a következő főbb megállapításokat tehetjük: (i) a redoxipotenciál csökkenése azt jelenti, hogy a Fe(III) állapot stabilizálódik a Fe(II)-höz képest. Vagyis hidroxid, cianid, ill. oxalátionok jelenlétében a Fe(II) könnyen oxidálható Fe(III)-má, ill. a Fe(III) nehezen redukálható Fe(II)-vé. Lúgos közegben már egészen gyenge oxidálószerek, pl. a molekuláris oxigén, is oxidálják a Fe(II)-t Fe(III)-má. (ii) a redoxipotenciál növekedése azt jelenti, hogy a Fe(II) állapot stabilizálódik a Fe(III) állapothoz képest. 2,2'-dipiridil vagy 1,10-fenantrolin jelenlétében a Fe(II) csak nagyon erős oxidálószerekkel oxidálható Fe(III)-má.

Vizes oldatban a Cu2+ + e- ? Cu+ rendszer standard redoxipotenciálja +?,167 V. Ez az alacsony redoxipotenciál is arra utal, hogy vizes oldatban, ha komplexképző ligandum nincs jelen, a Cu(II)-ionok a stabilisabbak. Különböző ligandumok jelenlétében egyrészt a Cu(II), másrészt a Cu(I) stabilizálódhat. A standard potenciál adatokat az M1.5. táblázat tartalmazza.

M1.5. táblázat: Néhány rézkomplex standard redoxipotenciálja.

Az M1.5. táblázat adataiból az a biológiai rendszerekre nézve is fontos tény származik, hogy a réz alacsonyabb oxidációs állapota, a Cu(I) aromás nitrogénvegyületekkel (piridin, imidazol), továbbá kéntartalmú vegyületekkel való komplexképződés során stabilizálódik, a Cu(II) pedig nitrogén- és oxigénvegyületekhez (pl. aminosavak, mint az alanin) való kapcsolódáskor válik stabilabbá.

M1.2. Kinetikai aspektus

A biológiában a fémionok ligandum-környezete gyakorta a változások állapotában van. Ezen ligandumok cserefolyamatainak és reakciómechanizmusaiknak az ismerete fontos a bioszervetlen kémiai viselkedésük megértéséhez. A reakciók lejátszódhatnak a belső koordinációs szféra megváltozásával. Belső koordinációs szférának tekintjük a fémion körül a ligandumok rendezett szerkezetét, melyek közvetlenül kötődnek a fémionhoz. A fémion pozitív töltése az oldószer-molekulák, vagy ellenionok bizonyos mértékű rendezettségét idézheti elő a belső koordinációs szférát övező térben is, ez a külső koordinációs szféra.

M1.2.1. A ligandumcsere reakciók sebessége

A legegyszerűbb cserefolyamat az oldószer (víz) cserereakció, melynek sebességét nagyszámú fémionra az M1.4. ábrán mutatjuk be.

M1.4. ábra: A belső szféra vízmolekulák cseresebességi állandói.

Általában elmondható, hogy a cseresebesség kisebb a kevésbé szorosan kötött kisebb töltésű ionokra, mint a nagyobb töltésűekre. A nagyon inert első sorbeli Cr3+ és Co3+ fémionoknak nincs különösen jelentősége a biológiai rendszerekben. Hasonlóképpen kevesebb a jelentősége az átmenetifémek második és harmadik sorának inertebb fémionjainak.

Az első átmenetifém-sor labilis fémionjainak gyors cseresebessége jelentősen lelassulhat, ha többfogú ligandum komplexében kötődik. Pl. a metalloporfirinek kinetikailag meglehetősen inertek. A makrociklusban nem kötött axiális ligandumok azonban gyors cseresebességgel reagálhatnak. Sok metalloprotein igen erősen köti a fémionját, amit csak hosszú, erős komplexképzőszerrel szemben végzett dialízissel lehet eltávolítani.

Egy ligandumnak egy másikkal való cseréje akár asszociatív (másodrendű) akár disszociatív (elsőrendű) úton lejátszódhat. Ezeknek kinetikai és mechanisztikus jellemzőik a szerves vagy szervetlen kémiából jól ismert SN1 vagy SN2 szubsztitúciós reakciók sajátságaival egyezőek. A kisebb koordinációs számú (? 4) fémkomplexek előnyben részesítik az asszociatív, míg a nagyobb koordinációs számú (? 6) fémkomplexek a disszociatív utat. A bioligandmokhoz kötött fémionok szubsztitúciós reakciói, azonban általában ennél sokkal bonyolultabbak a jövő ligandum és a távozó ligandum közötti kölcsönhatások, valamint a gyakori konformációváltozások lehetősége miatt.

M1.2.2. Elektrontranszfer reakciók

Két fő útjuk lehetséges, a belső szféra, és a külső szféra típus, az elektronnak az egyik centrumból a másikba való átmenete szempontjából. A belső szféra típusúakat a reaktánsok koordinációs szféráját hídként összekötő közös ligandum(ok) jelenléte jellemzi. Klasszikus példája ennek a reakcióútnak a labilis Cr(II)-komplexből egy elektron átadása az inert Co(III)-komplexnek, ami által az a labilis Co(II)-vé redukálódik, miközben maga az inert Cr(III)-komplexszé alakul (M1.2. egyenlet).

A külső szféra típusú reakcióknál a két redoxi partner a hidratációs szféráján keresztül kapcsolódva alakítja ki a közös „prekurzor komplexet”. Az elektronátadás a koordinációs szférák között mindenféle ligandumcsere nélkül zajlik le az oxidáló és a redukáló ágens között. A külső szféra típusú elektrontranszfer reakciók egyensúlyi állandója és sebességi állandói között Marcus elméleti összefüggést alkotott. Az ily módon számolt sebességi állandók igen jó egyezésben vannak a kísérletileg mértekkel.

A metalloproteinek körében eddig nem találtak példát belső szféra típusú redoxi reakcióra. A ligandumhidas köztitermék képződésének sztérikus gátja nagymértékben csökkenti, bár nem zárja ki, ennek az útnak a megvalósulását. A metalloproteinek közötti elektronátadási reakcióknak a biológiai jelentősége igen nagy. Nagy távolságú (? 3?? pm) elektrontranszfer reakciók igen gyorsan (?1? s-1) megvalósulhatnak.

M1.2.3. Koordinált ligandumok reakciói

A fémionok azon képessége, hogy a koordinált ligandumok reakcióképességét megváltoztassák a metalloproteinek működésének egyik kulcslépése. Egy ilyen reakció a koordinált ligandum savasságának a növekedése. Amint az M1.6. táblázat adataiból kitűnik a koordinált víz és egyéb molekulák pK-ja csökken a szabad ligandumhoz képest, mivel a pozitívan töltött fémcentrum stabilizálhatja a konjugált bázist (ami negatív töltésű).

M1.6. táblázat: Ligandumok pK értéke biológiailag releváns fémionok távollétében és jelenlétében.

Hasonló reakció a koordinált szubsztrát molekuláknak a nukleofil támadással szembeni érzékenységének a növekedése. Biológiai szempontból ez az alapja többek között a savanhidridek, az észterek, az amidok, a foszfátészterek hidrolízisének. Egy példa lehet erre a fémion Lewis savként való viselkedése az aminosav észterek semleges pH-n történő hidrolízise (M1.3. egyenlet). A reakció sebessége az M = Cu2+?Co2+?Mn2+?Ca2+?Mg2+ sorrendben változik, ami az Irving-Williams sorrendnek felel meg. A nem katalizált reakció semleges pH-n gyakorlatilag mérhetetlen.

További reakciókat jelentenek a fémionok által közvetített templát reakciók (lásd 4. fejezet), a kis molekulák aktiválási folyamatai (lásd 1. fejezet), vagy a kémiai reaktivitásnak a maszkírozása komplexképződés által (enziminhibíciós folyamatok például) (lásd 4.5. fejezet), vagy a távozó csoport reaktivitásának növelése. Az alábbi reakció, a foszfátészterek Cu-katalizálta hidrolízisét mimikálja (ligandum a 2-(imidazol-4-il)fenilfoszfát), amikor a Cu(II) komplexképzése a távozó csoporttal a hidrolízis sebességét 1?3 -1?4-szeresére növeli pH 4-7 tartománybanm (M1.4. egyenlet).

Chapter 19. M2. A BIOSZERVETLEN KÉMIA FIZIKAI ÉS BIOLÓGIAI VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI

Az élő szervezetekben lévő különböző fémion-tartalmú egyszerű és összetett részecskék összetételének, szerkezetének és stabilitásának meghatározása nehéz feladat. A rendelkezésre álló spektroszkópiai vizsgálati módszerek egy része csak a fémcentrumokról ad viszonylag pontos képet, de nem mutatja meg a fehérjeszerkezet részleteit. A modern molekuláris biológiai technikák viszont csak a fehérjéről nyújtanak információt. A vizsgálatok során tehát mindenképpen kétirányú megközelítésre van szükség a fémeket kimutató biofizikai módszerek és a fehérjeszerkezet tanulmányozására kifejlesztett spektroszkópiai és molekuláris biológiai technikák együttes alkalmazásával. Ahhoz, hogy közelebb jussunk a valósághoz, mindenképpen szükség van oldatbeli egyensúlyi vizsgálatokra is. Az alábbiakban a teljesség igénye nélkül néhány olyan módszert ismertetünk, melyek egyrészt szélesebb körben hozzáférhetőek, másrészt segítségükkel többé-kevésbé teljes kép nyerhető a fémion-kötő biológiai makromolekulák szerkezetéről.

M2.1. Az elektromágneses sugárzás és az anyag kölcsönhatása

A molekulaszerkezet tanulmányozására alkalmas módszerek többsége az elektromágneses sugárzás és az anyag kölcsönhatásán alapszik. Az M2.1. táblázatban az elektromágneses sugárzás különböző energiatartományai szerint csoportosítottuk az alkalmazható módszereket, feltüntetve a kinyerhető információt és az egyes módszerek időskáláját.

M2.1. táblázat: A különböző hullámhosszú (energiájú) elektromágneses sugárzások forrása (ez egyben azt is előrevetíti, hogy mely molekuláris tulajdonságok vizsgálhatók), ill. az alkalmazásuk révén létrejött ismertebb szerkezetvizsgáló módszerek.

M2.2. A molekulaszerkezet tanulmányozása röntgensugárzást alkalmazó módszerekkel

A röntgensugárzás hullámhossza a kémiai kötéshosszak nagyságrendjébe esik. Ez az oka annak, hogy a többi elektromágneses hullámhoz képest különlegességét a sugárzás szóródása mutatja, kristályos minták esetében karakterisztikus diffrakciós képet eredményez ve. Ebből optimális esetben a molekula térbeli szerkezete meghatározható. A röntgensugarak abszorpciója, és a spektrumok finomszerkezetének vizsgálata vezetett el az EXAFS vagy XANES módszerek kifejlődéséhez.

M2.2.1. Röntgen krisztallográfia

Az elmúlt években óriási fejlődés történt a röntgendiffrakciós méréstechnikában, kezdve a goniométerek precizitásától a szinkrotron sugárzásos stabilis, nagy intenzitású és hangolható röntgensugár-forrásokig. Ezzel párhuzamosan fejlődött a számítógépes adatfeldolgozás, mely az óriási adathalmazokat kezelni képes. Manapság egy fehérjemolekula térbeli szerkezetének meghatározása egy hétnél is kevesebb időt vehet igénybe, míg ugyanez a feladat kevésbé jó felbontás mellett is a közelmúltban akár több évig is eltarthatott. A modern készülékekkel már a fehérjék szerkezeténe változásai is figyelemmel kísérhetők akár pikoszekundumos időbeli felbontással (!). Ez lehetőséget biztosít a folyamatok mechanizmusának jobb megértésére.

A röntgendiffrakciós módszer elve tehát, hogy a röntgensugárzás a vizsgált minta elektronban gazdag helyein szóródik. A szórt hullámok interferenciája során azok erősítése, gyengítése, vagy kioltása jön létre, a megtett úthosszkülönbségétől függően. Az M2.1. ábra alapján ez az úthosszkülönbség Δs = 2d?sin? ahol d a rácspontok távolsága, ? pedig a sugárzás beesési szöge. A Bragg-egyenlet alapján, ha az úthosszkülönbség a hullámhossz egész számú többszöröse, azaz nλ = 2d?sin?, akkor a visszaverődő nyaláb maximális intenzitást mutat. Ahhoz, hogy értékelhető diffraktogramot kapjunk, a minta szerkezetének periodikusan rendezettnek kell lennie, ami az ún. egykristályokban valósul meg. Az egykristályok elemi cellái lehetnek a fehérjemolekulák maguk, vagy a molekulák csoportjai.

M2.1. ábra: A röntgensugárzás visszaverődése párhuzamos síkokban elhelyezkedő nagy elektronsűrűségű rácspontokról.

A gyakorlatban a mérést a kristály legalább három különböző irányban történő elforgatása mellett megismételve a kapott diffraktogram ún. Fourier szintézise során megalkotható az elemi cellák elektronsűrűség térképe. Ehhez rendelik hozzá a megfelelő atomokat. A fehérjemolekulák összetettsége miatt ez az aminosavsorrend ismeretének hiányában szinte lehetetlen.

A röntgendiffrakciós kép értékelhetőségét nagyban befolyásolja a készülék felbontása. ~5Å felbontás esetén a molekula alakjának kontúrjai láthatók, pl. a hosszabb α-hélixek kis rudacskákként már megjelennek. ~3,5 Å felbontás mellett a fehérjemolekula váza egyértelműen megadható, míg 2,5 Å esetében már az egyes atomok helyzete is meghatározható ? 0,4 Å pontossággal. A ma elérhető legjobb felbontás kb. 1.5 Å.

A röntgendiffrakciós mérésekkel bizonyították, hogy a peptidekben és fehérjékben az aminosavakat összekötő peptidkötés sík szerkezettel bír, melyben az elektronok részleges delokalizációja játszódik le (M2.2. ábra). Látható, hogy ennek következtében pl. a C-N távolság csökkent a megszokott értékekhez képest. A peptidkötés e tulajdonsága nagymértékben meghatározza a fehérjékben kialakuló lehetséges térbeli szerkezeteket: a másodlagos szerkezeti szerveződés az amid-nitrogénen lévő protonok és egy másik peptidkötés amid oxigénje közötti hidrogénkötések révén jön létre.

M2.2. ábra: A peptidkötésben delokalizációját szemléltető lehetséges rezonanciaszerkezetek, ill. a röngtendiffrakciós analízis alapján meghatározott kötéstávolságok és kötésszögek a peptidkötésben.

Az ismert fehérje kristályszerkezetek nagy része elérhető a Nemzetközi Krisztallográfiai Unió által működtetett fehérje adatbank honlapján (www.rcsb.org/pdb/) keresztül. A metalloenzimek szerkezetének fémionok, vagy szubsztrátok jelen-, ill. távollétében történő meghatározása nagyban hozzájárult ezen molekulák működésének megértéséhez. Példaként a 12. fejezetben már tárgyalt alkalikus foszfatáz vizsgálatával kapcsolatos érdekességet mutatunk itt be. Az enzim optimális működéséhez, két Zn(II)-, és egy Mg(II)-ion jelenléte szükséges. Az első röntgendiffrakciós vizsgálatok alapján a Mg(II)-ion szerepét a katalitikus folyamatokban elvetették. A közelmúltban újabb szerkezeteket analizáltak. Az M2.3.ábra jobb oldali képén látható, hogy az egyik oxigénatom helyzete nem jól meghatározott, azaz ezen donoratomot tartalmazó (Ser) aminosav oldallánc rendezetlen a Mg(II) részleges helyettesítése esetén. Ugyanakkor a, harmadik fémionként csakis Mg(II)-iont tartalmazó kristályban ez a donorcsoport egyértelműen egy irányba, az egyik Zn(II)-ion felé mutat. Ennek az az oka, hogy a Mg(II)-ionhoz koordinálódó hidroxilcsoport első lépésben indukálja a szerin-OH deprotonálódását, mely ebben az állapotában a hozzá közel eső cinkionhoz koordinálódik. Mg(II)-ion távollétében ez a folyamat nem megy végbe.

M2.3. ábra: Az alkalikus foszfatáz enzim Mg(II)-ion (jobb oldali kép) jelen-, ill. (bal oldali kép) távollétében meghatározott kristályszerkezete alapján készült sematikus ábrák (PDB id: 1ED8, 1ED9).

A hidrogénatomok körüli kis elektronsűrűség miatt ezen atomok jelenléte nem egyértelmű a röntgendifrrakció alapján. Ugyanakkor tudjuk, hogy számos esetben pont a deprotonálódási folyamatok játsszák a fő szerepet a katalízisben. A fenti példában közvetett úton állapították meg a hidrogénatom jelen-, ill. távollétét. Ma már egyre inkább az ún. neutrondiffrakciós kísérleteket alkalmazzák ennek bizonyítására. A neutronok ugyanis az atommagokon szóródnak, így nagyobb biztonsággal mutathatók ki a hidrogénatomok is.

Az egykristályok diffrakciós vizsgálatai szilárd fázisban történnek. Bár a fehérjekristályok mindig nagy mennyiségű oldószert is tartalmaznak, érdemes megjegyeznünk, hogy csupán ezen eredmények alapján mégsem lehetünk biztosak abban, hogy a sejtekben a fehérjék ugyanilyen formában léteznek.

M2.2.2. Röntgensugár abszorpciós módszerek.

Az atomok jellemző energiájú röntgensugárzás elnyelésére is képesek a belső elektronjaik gerjesztése során. Az elnyelés közelében, ill. a nagyobb energiák irányában a spektrumon finomszerkezet jelenik meg. Ennek magyarázata az, hogy a röntgensugárzás hatására keletkező fotoelektronok a szomszédos atomokról visszaverődnek, ami interferenciát hoz létre. Az abszorpciós él közelében e jelenség vizsgálatát XANES (X-ray absorption Near Edge Structure), míg a nagyobb energiák irányában lévő spektrumrészletet az EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) spektroszkópia vizsgálja. A XANES spektrumokból kideríthető a fémion oxidációs állapota, szimmetriája, míg az EXAFS spektrumokból a központi fémion körül lévő donoratomok számára, minőségére és a fémiontól való távolságára következtethetünk.

A Ni-Fe hidrogenáz enzim EXAFS vizsgálata során a fémionok környezetét modellvegyületeken keresztül tanulmányozták. Az M2.4. ábra alapján a spektrumok összehasonlításával vonható le következtetés. Az M2.2. táblázat szerint a natív, ill. redukált enzimben EXAFS és röntgen diffrakciós módszerekkel meghatározott kötéstávolságok jó egyezésben vannak.

M2.4. ábra: A Ni-Fe hidrogenáz enzim modellvegyületeinek kísérleti és számított EXAFS spektrumai.

M2.2. táblázat: A D. gigas, D. vulgaris, ill. D. baculatum Ni-Fe hidrogenáz enzimeinek EXAFS, ill. röntgen diffrakciós (XRD) módszerekkel meghatározott nikkel-egyéb atom távolságai. (W. Gu, L. Jacquamet, D. S. Patil, H-X. Wang, D. J. Evans, M. C. Smith, M. Millar, S. Koch, D. M. Eichhorni, M. Latimer, S. P. Cramer, Journal of Inorganic Biochemistry, 2003, Vol. 93, 41 51. nyomán.)

M2.3. Mágneses rezonancia módszerek.

A címben szereplő módszerekkel mágneses momentummal rendelkező részecskék (párosítatlan elektron(oka)t tartalmazó fémionok vagy nem-nulla magspinű atomok) tanulmányozhatók. Mágneses térben az eredő spin értéke által meghatározott (2S+1 vagy 2I+1) számú, különböző energiájú állapot jön létre. Ezek között megfelelő energiájú elektromágneses sugárzás elnyelése során átmenet (mágneses rezonancia) jöhet létre. A párosítatlan elektron(ok) vizsgálatára alkalmas módszer az Elektron Spin Rezonancia (ESR) spektroszkópia. A magspinek különböző energiaszintjei közötti átmenetek létrehozására a mag mágneses rezonancia (angol rövidítése NMR) spektroszkópia alkalmas. Az előbbi mikrohullámú, az utóbbi rádiókrekvenciás tartományba eső gerjesztő sugárzást alkalmaz. Míg az előbbi módszerrel paramágneses, addig az utóbbival főként diamágneses anyagok vizsgálhatók. A két módszer egymást ikiegészítő információt szolgáltat a bioszervetlen kémiai rendszerekről (M2.3. táblázat)

M2.3. táblázat: Az ESR, ill. NMR módszerekkel nyerhető információk.

M2.3.1. Az ESR spektroszkópia

Az ESR spektroszkópia párosítatlan elektronnal rendelkező rendszerek (fémionok, gyökök) vizsgálatára alkalmas. Egyetlen párosítatlan elektront tartalmazó fémion (pl. Cu(II)) esetén a spinmomentum-vektor két lehetséges értéke (MS = + ½, ill. – ½) külső mágneses tér jelenlétében különböző energiaszintet képvisel - Zeeman felhasadás (M2.5. ábra). A két állapot energiakülönbsége függ az alkalmazott mágneses tér nagyságától. Közöttük átmenet létrejöttének feltételét az M2.1. egyenlet szemlélteti, ahol g az ún. g-faktor, b a Bohr-magneton, Bk a külső mágneses tér nagysága. A g-faktor a párosítatlan elektron kémiai környezetére jellemző érték. Egy környezetétől izolált elektron esetén g = 2,0023. Valós rendszerekben az elektronok spin-pálya kölcsönhatása, valamint a fémiont körülvevő ligandumok alkotta környezet (kristálytér) miatt, g ettől jelentősen eltér.

M2.5. ábra: Egyetlen párosítatlan elektron energiájának felhasadása külső mágneses tér, a fémion, valamint a ligandum magspinjeinek hatására.

A különböző hatások nem mindig azonosak a tér minden irányában, ezért g valójában egy tenzor, azaz a főtengelyeknek megfelelően három értéket (gx, gy, gz) vehet fel (szilárd mintáknál, fagyasztott oldatoknál, ill. nagyméretű metalloproteinek oldatmintáinál). Ezek eredményezik az ún. rombos spektrumot (M2.6. ábra (d)) Ugyanakkor kis molekulatömegű fémkomplexek oldatai esetén a gyors molekuláris mozgások miatt a g értékek közötti eltérések kiátlagolódnak, így a rendszer egyetlen gizo faktorral leírható (izotróp spektrum, M2.6. ábra (a)). Ha a fémion környezete valamilyen pszeudo-szimmetriával rendelkezik (pl. a hem esetén az x és y tengelyek (majdnem) a gyűrű síkjában vannak, ill. a z tengely erre merőleges) ún. axiális spektrumról beszélünk (gx = gy = g?, ill. gz = gll). Attól függően, hogy g? vagy gll a nagyobb, a spektrum megjelenése kétféle lehet (M2.6. ábra (b és c)).

M2.6 ábra: A különböző szimmetriájú ESR abszorpciós spektrumok s azok első deriváltjai.

M2.7 ábra: A hiperfinom, ill. a szuper-hiperfinom felhasadás megjelenése a Cu(II) axiális szimmetriájú ESR spektrumán.

Külső mágneses térben a magspin mágneses momentumának vektora is különböző pozíciókat vehet fel a külső mágneses tér irányához viszonyítva. Ez az MI értékétől függően kis mértékben növeli, vagy csökkenti a mag helyén mérhető mágneses teret. Ez azt jelenti, hogy az energiaszintek mindegyike további 2I+1 szintre hasad fel - hiperfinom felhasadás (M2.5, M2.7. ábra). Ezen új energiaszintek közötti átmenetek energiája az M2.2. egyenlet szerint adható meg, ahol Az elektronspin és a magspin kölcsönhatására jellemző csatolási állandó, MI a magspin értéke. A kiválasztási szabályok szerint DMS = 1 és DMI = 0. Ezért az izotróp spektrumokon 2I+1 vonal, a rombos spektrumokon maximum 3?(2I+1) vonal jelenhet meg. A valós spektrumokon kis csatolási állandó (A) és viszonylag nagy vonalszélesség esetén a vonalak összemosódhatnak. Pl. a M2.7.b. ábrán csak a gll-tartományban tapasztalható a hiperfinom felhasadás.

A spektrum további és az előzővel teljesen analóg módon értelmezhető felhasadását eredményezi a ligandum fémionhoz koordinálódó donoratomjának IL > 0 eredő magspinje - szuperhiperfinom felhasadás. A donoratom magspinjének jelenléte izotróp spektrum esetén, maximum (2I+1)?(2IL+1) vonalat eredményez. Cu(II) esetén ez jellemzően csak a g?-tartományban jelentkezik (M2.7.c. ábra).

A különböző fémionok ESR spektruma jelentősen eltérhet egymástól (M2.8. ábra).

M2.8. ábra: Néhány metalloprotein ESR spektruma.

M2.3.2. Az NMR spektroszkópia

Az NMR spektroszkópia alkalmas a különböző vegyületek 3 dimenziós szerkezetének meghatározására oldatfázisban is. Elméleti alapjait tekintve sok hasonlóságot mutat az ESR spektroszkópiával. (A modern FT-NMR (Fourier-transzformációs NMR) pulzustechnikák alkalmazásának, ill. azok elméleti hátterének bemutatása messze túlmutat jelen könyv keretein.)

Külső mágneses tér hatására az I > 0 magspinű magok (ld. M2.4. táblázat) mágneses momentumának vektora a külső mágneses tér irányához viszonyítva 2I+1 különböző helyzetet vehet fel. Ezek különböző energiaszinteket képviselnek, és energia különbségük függ a külső mágneses tér nagyságától.

M2.4. táblázat: Az NMR spektroszkópiában gyakran vizsgált magok néhány sajátsága (az NMR módszer egy adott X magra érvényes, hidrogénre vonatkoztatott, relatív érzékenysége a TI(ãX/ãH)3 szorzattal arányos).

I = ½ spinű mag esetén (pl. 1H) e szintek közötti átmenetet gerjesztő sugárzás energiája az M2.3. egyenlettel adható meg (γ a vizsgált atommag ún. giromágneses tényezője: a mag pálya- és mágneses momentumának hányadosa). A giromágneses tényező magról-magra (izotópról-izotópra) eltérő, így a különböző elemek magjai egymástól elkülönülten vizsgálhatóak.

Az atommagokat körülvevő elektronok a vizsgálatok során alkalmazott külső mágneses tér értékét a mag helyén az elektronsűrűségtől függő mértékben megváltoztatják. Ezért egy adott atommag különböző vegyületekben más-más rezonanciafrekvenciát eredményez az NMR spektrumban. A rezonanciafrekvenciának ezen változását nevezzük kémiai eltolódásnak. Az I > 0 magspinnel rendelkező szomszédos magok mágneses momentumai szintén egyenként 2I+1 különböző orientációt vehetnek fel a külső mágneses tér irányához képest. Ez kis mértékben, de jól mérhető módon megváltoztatja a vizsgált mag környezetében a mágneses tér nagyságát: ún. spin-spin kölcsönhatás jön létre a jelek felhasadását eredményezve. A kölcsönhatás mértékét az ún. spin-spin csatolási állandóval jellemezzük.

A mérés során a gerjesztett állapot relaxációját (az alapállapotba való visszatérését, a makroszkopikus mágnesezettség elvesztését) követjük nyomon. Ez a folyamat viszonylag lassú (pl. 1H esetén 0,1-10 s). A makroszkopikus mágnesezettség külső mágneses térrel azonos irányú komponensének elvesztését longitudinális (spin-rács), az arra merőleges irányú mágnesezettség elvesztését transzverzális (spin-spin) relaxációnak nevezzük. Az e folyamatokra jellemző időállandókat rendre T1-el, ill. T2-vel jelöljük. Előbbi az NMR jel intenzitásával, utóbbi a jelszélességgel van szoros kapcsolatban.

Az NMR spektroszkópia tehát minden detektált jel esetén négy alapvető információval szolgál:

(i) a jelintenzitás ami a koncentrációról,

(ii) a kémiai eltolódás a jelet létrehozó atom kémiai minőségéről,

(iii) a spin-spin csatolási állandó a vizsgált maghoz kémiai kötéseken keresztül kapcsolódó szomszédos csoportokról,

(iv) a T1 és T2 relaxációs idők a molekula 3 dimenziós szerkezetéről.

Egy adott csoport deprotonálódása szükségszerűen a mag körüli elektronsűrűség megváltozásával jár. A kémiai eltolódás pH függésének követése alapján tehát meghatározható a pKs. A M2.9. ábra egy foszfolipáz C enzim szerkezetét mutatja, melynek katalitikus reakciójában két hisztidin imidazolgyűrűje (Enz-B) vesz részt. Az imidazol gyűrűk C2-H protonjainak pH függése alapján a következő pKs értékek adódtak: pKs = 7,6 (His32); 6,9 (His82); 5,4 (His92); 6,9 (His227). Az enzim pH-optimuma 7,3. A His92 pKs értéke ehhez képest túlságosan alacsony. A kristályszerkezet ismeretében a His-227 is könnyen kizárható. A sav-, ill. báziskatalízist tehát a His32 és His82 imidazol gyűrűi biztosítják.

M2.9. ábra: A foszfatidilinozitol specifikus foszfolipáz C enzim 3D szerkezete a hisztidin oldalláncok megjelölésével (a), az imidazol gyűrűk C2-H protonjainak (szaggatott kör) kémiai eltolódása a pH függvényében (b), valamint a katalizált reakció mechanizmusa (c).

(T. LIU, M. RYAN, F. W. DAHLQUIST and O. H. GRIFFITH, Determination of pK(a) values of the histidine side chains of phosphatidyl-inositol-specific phospholipase C from Bacillus cereus by NMR spectroscopy and site-directed mutagenesis, Protein Sci. 1997 6: 1937-1944)

A következő példa az ún. kétdimenziós NMR felhasználását mutatja be a metallotioneinek szerkezetének közvetett meghatározására. Amennyiben a vizsgálni kívánt vegyületünk sok magból áll, nehéz eldönteni, hogy a felhasadást vajon melyik másik maggal való spin-spin kölcsönhatás következménye (M2.10.a ábra). Az NMR egy speciális pulzusszekvenciát igénylő változata az ún. COSY (Correlation SpectroscopY) spektroszkópia adhat erre vaálaszt. A 113Cd7-metallotionein 113Cd-113Cd COSY spektrumán (M2.10.b ábra) nyilakkal jelölt keresztcsúcsok mutatják, hogy az egyes jeleket eredményező kadmium magok mely másikkal vannak spin-spin csatolásban (korrelálnak). Ez alapján megállapítható, hogy a 7 Cd(II)-ion két elkülönülő, 3, ill. 4 fémiont tartalmazó csoportot alkot. A hidrogének és a kadmium ionok közötti spin-spin csatolásokat felderítő 1H-113Cd COSY spektrum alapján az is meghatározható, hogy egy-egy kadmium ion pontosan mely (cisztein) tiolátcsoportokhoz kötődik.

M2.10. ábra: A tengerisün 113Cd7-metallotioneinjének (113Cd-lecsatolt) egydimenziós spektruma (a), ill. 113Cd-113Cd COSY spektruma (b). A római számok az egyes Cd(II)-ionokat jelölik. A COSY spektrum átlója mentén maga az 1D spektrum jelenik meg, így információ tartalma csak a keresztcsúcsoknak van, melyeket nyilakkal jelöltünk.

(Milan Vašak, Application of 113Cd NMR to metallothioneins Biodegradation 9: 501–512, 1998, © 1998 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands)

A molekulák térszerkezetének meghatározására az ún. NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) spektroszkópia alkalmas. Egy molekula két atommagjának mágneses momentuma között, amennyiben a két mag a térben kellően közel kerül egymáshoz, ún. dipol-dipol kölcsönhatás is kialakulhat. Ennek mértéke a két mag közötti távolság hatodik hatványával fordítottan arányos. A gyakorlatban szinte kizárólag hidrogén atomok között kialakuló dipol-dipol kölcsönhatást vizsgálnak. Az M2.11.a. ábra egy fehérje NOESY spektrumát mutatja be. Minden egyes keresztcsúcs alapján egy-egy 5 Å-nél kisebb H-H távolság határozható meg. Ezek számítógépes feldolgozása révén a fehérje háromdimenziós szerkezetét nyerhetjük (M2.11.b. ábra).

M2.11. ábra: Egy fehérje NOESY spektruma (a), ill. az ebból meghatározott térszerkezet (a vékony vonalak egy-egy meghatározott H-H távolságot jelölnek).

Párosítatlan elektronok hatása az NMR spektrumra a magok közötti (spin-spin, ill. dipol-dipol) kölcsönhatásokkal analóg módon értelmezhető. Az elektron mágneses momentuma azonban mintegy 1000-szer nagyobb a hidrogén magjának mágneses momentumánál. Ennek hatására az NMR jelek kémiai eltolódásának értéke (még 1H-NMR esetén is) akár több száz ppm-mel is megváltozhat. Hasonlóan felgyorsulnak a mag relaxációs folyamatai is az elektron jóval nagyobb mágneses momentumával való dipol-dipol kölcsönhatás révén.

M2.4. A Mössbauer spektroszkópia

A Mössbauer spektroszkópia a magnívók közötti energia átmenetekkel kapcsolatos, melyek nagy energiát (γ-sugárzást) igényelnek. Miközben egy atommag gerjesztett állapotából az alapállapotba kerül vissza, γ -foton bocsát ki, aminek energiája (M2.4. egyenlet), azaz nem egyezik meg pontosan a két energiaszint különbségével, minthogy annak egy része az ún. visszalökődésre fordítódik (Er = visszalökődési energia). Gerjesztéskor viszont ΔE-nél valamivel nagyobb energiára van szükség (M2.5. egyenlet). A legtöbb spektroszkópia esetén az emittált sugárzás vonalszélessége jóval nagyobb, mint Er, így az gerjeszteni képes egy az emissziót kibocsátóval megegyező atomot, ill. molekulát. A magnívók relaxációjakor képződő γ-sugárzás vonalszélessége azonban sok nagyságrenddel kisebb, mint Er, ezért sokáig elvetették annak lehetőségét, hogy egy gerjesztett atom által emittált γ-sugárzás gerjeszteni képes egy másik hasonló atomot. Rudolf Mössbauer 1958-ban jött rá, hogy bizonyos körülmények között lehetőség nyílik az ún. visszalökődésmentes magrezonancia-abszorpcióra. 1961-ben ezért fizikai Nobel-díjat kapott.

Bár több mint 40 elem esetén lehetséges Mössbauer spektrum felvétele, a bioszervetlen kémia vonatkozásában messze a vas (57Fe) a legjelentősebb. Az 57-es tömegszámú vas alapállapotában I = 1/2-es, gerjesztett állapotában I = 3/2-es magspinnel rendelkezik. Amennyiben a vas körül gömbszimmetrikus elektromos erőtér (elektronfelhő) alakul ki, egyetlen átmenetet (abszorpciós jelet) mérhetünk (M2.12. ábra). Az atommag kölcsönhatása a környezetében lévő elektronokkal, eltérő kémiai környezetben lévő magok esetén, különböző gerjesztő energiát eredményez. Az elemi vas Mössbauer jeléhez viszonyított eltérést (mm/s egységben kifejezve) izomer eltolódásnak (IE) nevezzük.

M2.12. ábra: A magnívók közötti lehetséges átmenetek, valamint a hozzájuk tartozó Mössbauer spektrumok.

Ha a vasat körülvevő elektromos tér szimmetriája lecsökken, azaz a különböző irányokban eltérő nagyságú erőtérrel lép kölcsönhatásba a mag, az I > ½ magspinhez rendelhető energiaszintek részlegesen felhasadnak. Vas esetén az I = 3/2 magspinű gerjesztett állapot m = ± 3/2 és m = ± ½ szintekre hasad fel. Ekkor a spektrumon két jel észlelhető (M2.12.b. ábra). Az izomer eltolódást a két jel átlaga definiálja, a jelek energia szeparációját (szintén mm/s egységben kifejezve) kvadrupólus felhasadásnak (KF) nevezzük. A 57Fe magot mágneses térbe helyezve a különbözo magmágneses kvantumszámokhoz rendelheto energiaszintek teljesen szeparálódnak. A Dm = 0, ?1 kiválasztási szabálynak megfeleloen maximum 6 átmenetet detektálhatunk, melyek jel alatti területe a 3:2:1:1:2:3 intenzitásarányt eredményezi (M2.12.c. ábra).

A kémikus számára a Mössbauer spektrum a következő információkat szolgáltatja: (i) a fémion körüli elektronsűrűség, a ligandum elektronegativitása (IE), (ii) a fémion (körüli elektronfelhő) szimmetriája (KF), a fémion oxidációs, ill. spin állapota (IE, KF), valamint a fémion-ligandum kötés jellege (IE,KF).

Példaként tekintsük a M2.13. ábrán a Rieske-centrum redukált, ill. oxidált formájának Mössbauer spektrumát. A redukált forma egy-egy Fe(II) és Fe(III)-iont tartalmaz, melyeknek kvadrupólus felhasadása jelentősen különbözik egymástól. A d6-os elektronkonfigurációjú Fe(II) ún. kis spinszámú formája gömbszimmetrikus elektroneloszlással rendelkezik a nagy spinszámú állapottal ellentétben. Hasonlóképpen a Fe(III)-nak is két spinállapota lehet: kis spinszámú, nem gömbszimmetrikus, ill. nagy spinszámú, gömbszimmetrikus. Figyelembe véve, hogy a Fe(II) jelentős, míg a Fe(III) csekély kvadrupólus felhasadást mutat, a fémionok mind a redukált, mind az oxidált formában nagy spinszámú spinállapottal rendelkeznek. Azonban a Fe(III) e formája ideális esetben egyetlen jelet eredményezne, azaz az ábráról az is leolvasható, hogy a Fe(III) körüli elektronfelhő kis mértékben torzult, valószínűleg a tiolát ligandumok nem szabályos tetraéderes elrendeződése miatt.

M2.13. ábra: A Rieske-centrum redukált (a) és oxidált (b) formájának Mössbauer spektruma.

M2.5. Optikai módszerek

Az olvasóban óhatatlanul is felmerülhet a kérdés, hogy ha már egyszer a fényt használjuk az anyagszerkezet vizsgálatára, és pl. mikroszkópok segítségével olyan részecskéket is láthatóvá tehetünk, melyek szabad szemmel nem láthatók, akkor miért nem építünk olyan mikroszkópot, mellyel az atomok is láthatóvá válnak? A kérdés nem jogtalan, de legjobb fókuszáló módszerek használata esetén is az elméletileg elérhető felbontás a fény hullámhosszának a felére tehető. A látható sugárzás esetében ez néhány ezer Å (10-10 m), míg az atomi távolságok ennek ezred részei. Az elektronmikroszkópok sokkal nagyobb felbontást tesznek lehetővé, ezek segítségével már a nagyobb molekulák kontúrjai is láthatóvá válnak. A mikroszkópia fejlődése számos új képalkotó módszer kialakulását eredményezte, mint a pásztázó elektronmikroszkópia (SEM), alagút-elektronmikroszkópia (TEM), atomi erő mikroszkópia (AFM), stb. A legújabb, és legnagyobb reményekkel a szinkrotron sugárzást felhasználó XRM azaz röntgensugár-mikroszkópia, melynek segítségével elvileg atomi szintre is "láthatunk". Azonban, bár ezen módszerek részletesebb tárgyalására e helyen nem kerülhet sor, érdemes a fejlődésüket figyelemmel kísérni.

A továbbiakban a különböző hullámhosszúságú, de a látható fény energiatartományához közeli sugárzások és az anyag kölcsönhatásával foglalkozunk. A módszerek többsége a fény elnyelődésének vizsgálatán alapszik, ami a Beer-Lambert törvény szerint alkalmas a vizsgált elnyelő egységek (kromofórok) koncentrációjának meghatározására. A szrkezetvizsgálat szempontjából fontosabb, hogy a megfelelő elnyelési sávok energiája és intenzitása a kromofór tulajdonságaitól, ill. annak kémiai környezetétől és a környezet geometriájától is nagymértékben függ. Az M2.1. táblázatban már láthattuk, hogy az infravörös sugárzás tartománya a molekuláris rezgésekről, az UV és látható hullámhossz-tartomány a vegyértékelektronok környezetéről nyújt információt. Ráadásul, a fény különböző polarizációs állapotú sugarai a molekulageometriától függően különböző mértékben nyelődhetnek el, ezen alapszik pl. a cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia.

M2.5.1. Az UV/látható spektroszkópia

Az UV, ill. látható hullámhossztartományba eső sugárzás elnyelődését a biomolekulák oldataiban a következő kromofórok okozzák a sugárzási energia növekedésének irányában: az átmenetifém-ionok d-d átmenetei, a ligandumról a fémionra vagy a fordított irányban lejátszódó töltésátviteli folyamatok gerjesztése, ill. a ligandumok saját kromofórjainak (aromás rendszerek, delokalizált elektronok, ill. kettős kötésben lévő elektronok, vagy nemkötő pályán lévő elektronok) gerjesztése. Természetesen az itt felállított energia szerinti sorrend nem kizáró jellegű. Számos olyan szerves molekulát ismerünk, melyek fémion távollétében is a látható hullámhossz tartományban nyelnek el, és pl. a 7. fejezetben tárgyalt kék réz fehérjék esetében az intenzív kék színt a kis energiájú töltésátviteli sáv okozza. Az átmenetifém komplexek d-d átmeneteinek energiája nagyban függ a fémiont körülvevő donoratomok minőségétől, ill. azok geometriai elhelyezkedésétől. A Cu(II)-komplexek esetében pl. vízmolekulákkal körülvett ion halványkék oldatának elnyelési maximuma 800 nm körül van, ugyanakkor egy olyan peptidkomplexben, ahol a Cu(II)-iont négy nitrogénatom veszi körül közel síknégyzetes elrendeződésben (ld. 3. fejezet) az elnyelési maximum helye 500 nm körüli érték, ami ibolya akár piros színű oldatot is eredményezhet. A Ni(II)-komplexek esetében pl. ránézésre is egyértelműen megkülönböztethetőek a kis ligandumterű ligandumok oktaéderes geometriájú, nagyspinszámú komplexei (többnyire halványzöld oldatok) a deprotonálódott peptid-nitrogéneket tartalmazó síknégyzetes, diamágneses komplexektől (intenzív sárga színű oldatok). Az UV/látható színképek sávjai sajnos az esetek többségében a molekuláris rezgésekkel való csatolódás révén igen szélesek, emiatt a szerkezetre nézve részletes információ belőlük nem nyerhető.

M2.5.2. Az infravörös sugárzást felhasználó spektroszkópiai módszerek

A címben említett módszerek közé soroljuk az infravörös spektroszkópiát, mely e sugárzás elnyelésének vizsgálatán alapszik, de a Raman spektroszkópiát is. Ez utóbbi módszer a látható fénysugárzást használja a molekuláris rezgések gerjesztésére, de az infravörös tartományba eső fluoreszcens sugárzást analizálja. A színképek az esetek többségében meglehetősen bonyolultak a számos rezgési átmenet lehetősége miatt. Az infravörös színkép 400-1000 cm-1 hullámszám tartományába eső részt szokás a molekulák "ujjlenyomat"-tartományának is nevezni. A molekulák rezgései igen érzékenyek a környezetre, így pl. a különböző gyenge kölcsönhatások, mint hidrogénkötések, hidrofób kölcsönhatások, vagy komplexképződés is, a rezgések erőállandóit változtatva befolyásolják azokat.

M2.5.3. A CD spektroszkópia

Az élő szervezetekben számos optikailag aktív molekula található, melyek közül gyakran csak az egyik izomer (enantiomer) forma mutat biológiai aktivitást. Tudjuk, hogy pl. az aminosavak közül csak a L, míg a szénhidrátoknak főként a D-relatív konfigurációjú formái vannak jelen. Az enantiomerek egymástól csakis egy másik királis környezettel való kölcsönhatás révén különböztethetőek meg. Az elektromágneses sugárzásnak pedig ismerünk királis polarizációs állapotát, az ún. cirkulárisan polarizált fényt. A jobbra, ill. balra cirkulárisan poláros sugárzás elnyelődése optikailag aktív közegben eltérő lesz, aminek eredményeként elliptikusan poláros fényt kapunk. Ezen elnyelés különbségének mérésén alapul a cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiának.

A mérés alapfeltétele, hogy az adott elektromágneses sugárzás (infravörös, vagy UV/látható) elnyelődjön, vagyis legyen kromofór a molekulában, és, hogy e kromofór környezete biztosítsa annak optikai aktivitását. Ez annyit jelent, hogy pl. egy átmenetifém-komplex d-d tartományban észlelt optikai aktivitása egyértelmű bizonyíték a fémion és a ligandum – ami adott esetben lehet pl. egy fehérje – kölcsönhatására. A CD spektrum azonban ettől többet is mond. A spektrumok alakjából és intenzitásából szisztematikus vizsgálatokat végezve a fémiont körülvevő donoratomok – vagyis egy bonyolultabb ligandum esetében a fémion-kötőhelyek - azonosítása is lehetséges. Szép példáját mutatja az ilyen vizsgálatoknak egy a prion fehérjék Cu(II)-ion kötésével (ld. 3. fejezet) foglalkozó tanulmány. Kiindulási pontként feltételezték, hogy a fehérjének az N-terminális doménje a fémion-kötőhely. Ezután előállítottak egyre csökkenő méretű N-acetilezett-peptidmolekulákat (a C-terminális karboxilcsoport helyett karboxamid csoport szerepelt), melyek jó modelljei lehetnek a fehérjének, és vizsgálták a CD spektrumok alakját a Cu(II)-ionok környezetére való tekintettel. Az M2.14a. ábra alapján még a három aminosavból álló egység is hűen modellezi a fehérjében kialakított Cu(II)-koordinációt. Az ezen eredmények alapján közölt szokatlan koordinációs módot mely az imidazol nitrogéntől C-terminális irányban deprotonálódó amid-nitrogéneket tartalmaz később röntgen-diffrakciós mérésekkel is alátámasztották (M2.14. ábra).

M2.14. ábra: A prion fehérje különböző méretű fragmensei Cu(II)-komplexeinek CD spektrumai (a), a prion fehérje modelljének tekinthető peptid Cu(II)-komplexének szerkezete röntgenkrisztallográfia alapján (b).

E. Aronoff-Spencer, C.S. Burns, N.I. Avdievich, G.J. Gerfen, J. Peisach, W.E. Antholine, H.L. Ball, F.E. Cohen, S.B. Prusiner, G.L. Millhauser, Biochemistry 2000, 39, 13760-13771; C.S. Burns, E. Aronoff-Spencer, C.M. Dunham, P. Lario, N.I. Avdievich, W.E. Antholine, M.M. Olmstead, A. Vrielink, G.J. Gerfen, J. Peisach, W.G. Scott, G.L. Millhauser, Biochemistry, 2002, Vol. 41, 3991–4001.

A CD spektroszkópia alkalmas a fehérjék másodlagos szerkezetének vizsgálatára is, azok királis voltából kifolyólag. A különböző másodlagos szerkezeti elemek igen jellemző alakú és intenzitású, és reprodukálható spektrumokat eredményeznek (M2.15. ábra). Ezzel mód nyílik arra, hogy a CD spektrumokból a fehérje másodlagos elemeinek százalékos összetételét, ill. ezek változásait megadjuk. Az NMR spektroszkópia mellett ez az egyetlen olyan módszer, amely vizes oldatokban ilyen szerkezeti információt szolgáltat.

M2.15. ábra: A fehérjék különböző másodlagos szerkezeti elemeinek jellemző CD spektrumai az UV tartományban.

M2.6. A fehérjemolekulák azonosítása

Fehérjemolekulákat elsősorban valamilyen természetes forrásból (pl. baktérium) izolálhatunk. Mivel egy fehérjemolekula vizsgálata önmagában is meglehetősen bonyolult, mindenekelőtt a minta tisztaságát érdemes ellenőrizni. Ezt manapság legegyszerűbben a gélelektroforézis vizsgálatok segítségével tehetjük meg.

M2.6.1. A fehérjék gélelektroforézise

A gélelektroforézis egyszerű elválasztásra szolgáló módszer, melyben a vizsgálandó anyagok elektromos tér hatására különböző sebességgel vándorolnak valamilyen gélszerű (pl. agaróz vagy poliakrilamid gél) közegben. Az elektromos térerősség, a gél üregeinek mérete, valamint a molekulák alakja, mérete, ill. töltése határozza meg a vándorlás sebességét, és irányát. A fehérjék esetében leggyakrabban az ún. nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélelektroforézist (Sodium Dodecyl-Sulfate Polyakryalamide Gel Electrophoresis v. röviden SDS-PAGE) alkalmazzák. A nátrium dodecil-szulfát, mint felületaktív anyag a fehérjemolekulákat denaturálja, és a szálak felületén nagyszámban adszorbeálódva a mérettel arányos negatív töltést biztosít. Így minden fehérje a pozitív elektród irányába vándorol, méghozzá a molekulatömegével fordítottan arányos sebességgel. Megfelelő referenciaanyag párhuzamos alkalmazásával így nemcsak a fehérjék tisztaságára, hanem a molekulatömegére nézve is közelítő jellegű információ nyerhető. A gélen megfelelő festékanyag segítségével a fehérjék sávjai láthatóvá tehetőek, egy ilyen képet mutat az M2.16.a. ábra.

Mivel előfordulhat, hogy két vagy több fehérje hasonló méretéből adódóan a fenti módszerrel nem választható el egymástól, ezért újabban egyre gyakrabban alkalmazzák az ún. kétdimenziós PAGE-t. Ennek során előbb a natív fehérjék elektroforézisét végzik egy olyan gélen melyen pH gradienst alakítottak ki. Itt a fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelelő pH-t mutató helyre vándorolnak. (Ezt a módszert nevezik izoelektomos fókuszálásnak.) Ezután a gélt 90 fokkal elforgatva, SDS-t hozzáadva a már fentiekben leírt módon ismét elektroforézisnek vetik alá. Ily módon az M2.16.b. ábrán látható képet kapjuk egy bonyolult fehérjeelegy esetében.

M2.16. ábra: Egy SDS PAGE módszerrel vizsgált fehérjeelegy, az ebből tisztított vizsgálni kívánt fehérje, és az ismert molekulatömegű fehérjékből összeállított marker elegy gélelektroforézis képe (a). Egy összetett fehérjeelegy 2D gélelektroforézis képe (b).

Érdemes megemlíteni, hogy gélelektroforézis eljárást alkalmaznak a DNS molekulák méretének meghatározására is, azonban ebben az esetben a molekulamérettel arányos negatív töltés a foszfátcsoportok jelenléte miatt eleve adott, vagyis nincs szükség felületaktív anyag hozzáadására.

M2.6.2. A fehérjék aminosav-sorrendjének meghatározása

M2.6.2.1. Tömegspektrometria.

E módszer lényege az, hogy a vizsgálandó anyag részecskéit ionizálják, majd a kapott ionokat elektromos térben felgyorsítják. Az ionizáció leggyakoribb módja az, hogy 50-75 eV energiájú termikus elektronokkal hozunk létre ütközési ionizációt gáz fázisban (EI), azonban ekkor a molekulák gyakran fragmentálódnak. Kíméletesebb ionizációs lehetőséget biztosít a kémiai ionizáció (CI) vagy a gyors atomokkal való bombázás (FAB) módszerei, azonban fehérjék esetében ezek sem célravezetők. Az ún. elektrospray vagy nanospray módszerek (ESI) esetén erős elektromos térbe porlasztjuk a már eleve ionos minta oldatát. Az atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) segítségével a nemionos molekulák az oldószerből képződő ionok révén ionizálódnak. A vizsgálathoz szükséges kíméletes ionizáció elérhető lézerimpulzusokkal is. A MALDI (matrix assisted laser desorption ionization), a mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció során a jól szabályozható lézerforrásból származó gerjesztő energiát egy mátrix veszi fel és közvetíti a vizsgálandó molekulák felé. A keletkezett ionokat azután egy nagy térerejű gyorsító rendszer (60-100 kV) deszorbeálja a kondenzált fázisból.

Az ionforrásban keletkező pozitív töltésű ionokat egy (V) gyorsítófeszültség bekapcsolásával indítjuk az analizátorba. Ha minden töltéshordozó azonos kinetikus energiára tesz szert (M2.6. egyenlet), akkor egyszeres iontöltés esetén a különböző tömegű ionok különböző sebességgel (v1, v2,..., vn) repülnek és időben külön-külön érik el a detektort (M2.7. egyenlet). Azaz a (t) repülési idő adott ionforrás - detektor távolság (L) és gyorsítófeszültség mellett csak a fajlagos tömeg (m/z) függvénye. A repülési időt mérő MALDI TOF (time of flight) spektrométerek segítségével egészen nagy tömegű fehérjeionok is detektálhatók. Ha a felgyorsított ionokat (H) mágneses térben vezetik tovább, azok a Lorenz-féle erő hatására r sugarú körpályára kényszerülnek, azaz tömegüktől és töltésüktől függően más és más pályán haladnak (M2.8. egyenlet), vagyis állandó V mellett H-t változtatjuk, vagy fordítva, mindig más fajlagos tömegű ion jut el az ionforrásból a detektorba. A mágneses eltérítést az elektrosztatikus eltérítéssel együtt az ún. kettős fókuszálású tömegspektrométerekben használják, ami pontos tömegmérést tesz lehetővé, elsősorban molekulaszerkezet-vizsgálat céljából.

A tömegspektrometriás módszert kémiai vagy biokémiai lebontással, valamint kromatográfiás elválasztással együttesen alkalmazva a teljes aminosav sorrend meghatározható. A fehérjék teljes kémiai hidrolízisének termékelegyét nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) - módszerrel kvantitatíven analizálva megállapítható az aminosav összetétel. Alkalmazhatunk olyan hidrolitikus eljárásokat, melyekben pl. csak bizonyos aminosavak melletti peptidkötések hasadnak, (ilyenek pl. az enzimatikus hasítások, vagy pl. a BrCN-nal szelektíven metionin aminosav mellett hasíthatunk) vagy olyanokat, melyekben a terminális aminosavak hasadnak. A képződő termékeket tömegspektrometriás módszerrel vizsgálva a termékek közötti átfedéseket is figyelembe véve a fehérje aminosav térkepe összeállítható. Bár az ilyen meghatározások meglehetősen fáradalmasnak, sőt a tömegspektrometria alkalmazása nélkül talán kilátástalannak is tűnnek, sokáig ilyen módszerrel határozták meg a fehérjék elsődleges szerkezetét. (Érdemes már itt megjegyezni, hogy mind az elektroforézis, mind pedig a tömegspektrometria alkalmas a fehérjemolekulák egymás közötti, ill. egyéb molekulákkal vagy fémionokkal való kölcsönhatás tanulmányozására is.)

Egy biológiai rendszerből izolált fehérje esetében azonban a molekuláris biológia módszereit alkalmazva ma már sokkal egyszerűbben nyerhetünk információt az aminosav sorrendről. Az élő szervezetek génállományában ugyanis viszonylag könnyen megtalálható az a gén, mely az adott fehérjét kódolja, majd e gén bázissorrendjének meghatározása és az aminosavak DNS kódjainak ismerete révén az aminosav sorrend egyszerűen származtatható. Mindaddig, azonban amíg a PCR (polimeráz láncreakció - polymerase chain reaction) módszert fel nem fedezték, a nukleinsavak szekvenciáját a fehérjeszekvenciákból következtették ki.

M2.6.2.2. A polimeráz láncreakció és a DNS szekvenciájának meghatározása.

E módszerek kidolgozása forradalmasította a molekuláris biológia és a kapcsolódó tudományágak fejlődését. Nem véletlen, hogy kétszer is Nobel-díjjal jutalmazták a kutatók munkásságát ezen a területen: Kary B. Mullis, Michael Smith (1993, PCR) és Paul Berg, Walter Gilbert, Frederick Sanger (1980, DNS szekvenálás). A PCR elsődlegesen a DNS molekulák sejten kívüli (in vitro) sokszorosítására használatos módszer. Az alábbiakban az elvi alapokat próbáljuk meg leegyszerűsítve összefoglalni. A leírás megértéséhez szükség van a nukleinsavakról a 3.2. fejezetben leírtak ismeretére.

Ahhoz hogy a kettősszálú DNS molekula sokszorozódjék, arra van elsőként szükség, hogy a két szál szétválva, mintegy mintaként (templátként) szolgálhasson az új szálak kiépüléséhez. A szálak szétválasztása a sejten belül egy enzim segítségével történik, míg a PCR készülékben ugyanez a hőmérsékletnek a DNS ún. olvadáspontja fölé történő emelésével érhető el. Ez egy nagyobb DNS molekula esetében általában 95-98 ?C. A templátok 3' végeire, ill. oda, ahonnan az új DNS lánc építését indítani kívánjuk, ezután egy-egy megfelelő rövid oligonukleotid láncot kell hibridizáltatni (a hibridizáció során a megfelelő bázisok párosodása révén a két szál összetapad). Ezt a rövid oligonukleotidot primernek nevezik, a hibridizáció pedig értelemszerűen a primerek olvadáspontjának megfelelő hőmérséklet körül zajlik (ez általában 40-60 ?C közötti érték). Érdemes felhívni a figyelmet arra, hogy a két - egymással ellentétes lefutású eredeti szálra két különböző oligonukleotidot kell tervezni, melyek olvadáspontja egymáshoz közeli érték kell, hogy legyen. A következő lépésben a hőmérsékletet kissé megemelve egy hőtűrő DNS polimeráz enzimet alkalmazunk az új láncok 3' irányban történő építéséhez. Ehhez az enzim mellett dezoxiribonukleozid-trifoszfát építőegységekre, valamint Mg2+-ionokra és pufferre van szükség. Az enzim által katalizált reakciót az M2.17. ábra szemlélteti.

M2.17. ábra: A hőtűrő DNS polimeráz enzim által katalizált reakció vázlata a PCR során.

A fentiekben leírt folyamat a PCR első ciklusát alkotják. Ebben az első ciklusban az új DNS szál növekedése a DNS polimeráz enzim működésének sebességétől, ill. a templát DNS szál hosszától függhet. Az első ciklus végét, ill. a második kezdetét a hőmérséklet újbóli növelése jelenti, melynek során az első ciklusban képződött új kettősszálú DNS molekulák olvadása történik meg, majd az első ciklusban már leírt lépések ismétlésével új DNS szálak építhetők. Könnyen belátható, hogy a DNS molekulák száma minden ciklusban kétszereződik, így kb. 30 ciklus után (egy ciklus ideje kb. 2 perc, vagyis összesen egy óra alatt) minden eredeti DNS molekulából 230 számú, vagyis több mint egymilliárd molekula képződik.

Érdemes itt még arra kitérni, hogy egyszerűen a primerek alkalmas tervezésével egy adott nagyméretű DNS molekulából egy adott szegmens (gén) "kivágható", és sokszorosítható. Ugyanakkor egy gén adott részleteinek sokszorosításával a kódolt fehérjék módosítása, vagy a primerben egy adott aminosav-kód cseréjével a fehérjék mutálása válik lehetővé, ami újabban igencsak elterjedt módszer a metalloenzimek fémion-kötőhelyeinek, vagy egyéb, a katalitikus folyamatban valamilyen módon résztvevő aminosavak azonosítására (ld. még 14. fejezet). Az ilyen, PCR reakcióban előállított új gének által kódolt ún. rekombináns fehérjék a géneket (megfelelő formában) élő-, többnyire baktériumsejtekbe juttatva, a sejtek fehérjegyártó mechanizmusát kihasználva állíthatók elő.

A PCR képezi a modern DNS szekvencia-meghatározás alapját is. Ugyanis a PCR elegybe a négyféle dezoxiribonukleotid-trifoszfát mellett az egyikből (pl. a dezoxiadenozin trifoszfátból) valamennyi didezoxiribonukleotid-trifoszfátot is adunk. Ekkor e "hibás" építőkövek véletlenszerű beépülése következtében a DNS szál nem építhető tovább, ugyanis az ehhez szükséges 3'-OH csoport hiányzik. A PCR-ben képződő nagyszámú molekula elegyében statisztikai okokból is minden olyan különböző hosszúságú DNS molekula megtalálható, melyben az adott nukleotid helyére a "hibás" nukleotid épült be. Ezen különböző méretű molekulák gélelektroforézis módszerrel elválaszthatók egymástól, vagyis meghatározható azon DNS szakaszok mérete, melyek a példában szereplő adenozinnal végződnek. A fentiek ismeretében két lehetőségünk van a teljes szekvencia meghatározására. Az egyik, hogy négy PCR elegyet állítunk össze a négy különböző nukleotid helyének meghatározására. A reakció után a négy elegyet egyetlen gélen szétválogatva az M2.18. ábrán látható képhez jutunk, melyről egyszerűen leolvasható a DNS szekvenciája.

M2.18. ábra: A DNS szekvenciájának meghatározása négy PCR elegyből.

A másik, modernebb változat, hogy a négy különböző "hibás" didezoxinukleotid- trifoszfátot egyenként különböző színnel fluoreszkáló festékkel jelöljük, és mind a négyet egyetlen PCR elegyben alkalmazzuk. A reakcióban a képződött DNS szálak elegyét kapilláris gél-elektroforézissel szétválogatva, egy fluoreszcens detektor segítségével egy színes diagramot nyerünk, melyből a színekhez a megfelelő nukleotidot hozzárendelve a szekvencia közvetlenül leolvasható. Az aminosavak kódjainak (M2.5. táblázat) ismeretében a DNS bázissorrendjéből a fehérje aminosav-sorrendje egyértelműen felírható.

M2.5. táblázat: Az aminosavak DNS nukleotidtriplett kódjai.

Chapter 20. M3. A LÉTFONTOSSÁGÚ NYOMELEMEK FONTOSABB BIOLÓGIAI FUNKCIÓI ELEMCSOPORTOK SZERINT

Az előző fejezetekben a biológiai funkciók szerinti csoportosításban tárgyaltuk az élő szervezetek nyomelemeit, ill. részvételükkel lejátszódó folyamatokat. Hasonló típusú funkciók megvalósításában azonban több különböző nyomelem is részt vehet. Ennek megfelelően a bioszervetlen kémiai ismeretek tárgyalásának egy másik lehetséges módját az elemenkénti csoportosítás jelenti. Sok összefoglaló munka és tankönyv követi ezt a tárgyalási módot és valószínűleg ez a követendő út a bioszervetlen kémiai alapismeretek minél szélesebb körben való megismertetése céljából is. Természetesen ebben a fejezetben nem megismételni kívánjuk a nyomelemek legfontosabb biológiai funkcióihoz kapcsolódó tényanyagot, hanem egyrészt minden elemmel kapcsolatban összegezni fogjuk az alapismereteket és alkalmazási lehetőségeket, másrészt megadjuk azokat az utalásokat, amelyekkel a funkciók részletes leírása is megismerhető. Ezáltal a nyomelemeknek az élet fenntartásában betöltött gazdag szerepvállalásában is egy könnyebb áttekintést biztosíthatunk.

Alkáli fémek, Na+, K+, (Li+)

A nátrium- és kálium-kationok alapvető fontosságú váz- és testnedvalkotó elemek, az alkáliföldfémekkel együtt a test tömegének kb. 1 %-át alkotják. Egy 70 kg tömegű felnőtt emberi szervezetben kb. 80-100 g nátrium és 150-170 g kálium van. Az alkálifémionok nagy része ionos formában van jelen a szervezetben, miután sóik oldhatók fiziológiás pH-n, és nem kötődnek irreverzibilisen vagy erősen a sejtfal és a membránok donorcsoportjaihoz. Szabad ionok formájában kerülnek a véráramba és a szállítás során nem igényelnek speciális vivőligandumokat vagy vivőproteineket.

Az élő sejtek jellemzője, hogy belső terükben az egyes alkálifémionok koncentrációja lényegesen eltér a sejten kivüli közegben található ionkoncentrációktól, ami azt eredményezi, hogy a sejtmembrán két oldalán koncentrációgradiens alakul. Ez különösen fontos szerepet játszik a különböző szállító (transzport) folyamatokban (6.2. fejezet). Ezeket a sejtek arra használják fel, hogy felhalmozzák, ill. eltávolítsák a semleges molekulákat és ionokat.

A sejt egészsége az ionok kiegyensúlyozott eloszlását követeli meg. Ennek az egyensúlynak a fenntartása végett az ionok mozgása a sejtmembránon keresztül szigorúan szabályozott és alapvető az élettani folyamatokhoz. Így a nátrium- és káliumionok fő élettani szerepei a következők:

  • A sejtek ozmózis nyomásának, a szervezet ozmótikus egyensúlyának biztosítása, sav-bázis folyamatok szabályozása (Na+, K+)

  • A membránpotenciál fenntartása, amely az idegingerület vezetésében játszik nagyon fontos szerepet (Na+, K+) (6.3.1. fejezet)

  • Részvétel a különböző másodlagos aktív transzport folyamatokban (Na+)

  • Vannak olyan, a koncentráció gradienssel ellentétes irányú transzport folyamatok, ahol a folyamat energiaigényét az fedezi, hogy egyidejűleg egy másik anyag az elektrokémiai gradiensnek megfelelő irányba szállítódik. Így a Na+-K+ ATPáz által fenntartott Na+ koncentrációgradiens egy olyan potenciális energiaforrás, amelynek terhére lehetővé válik más anyagok szállítódása (glükóz, aminosavak) a membránon keresztül. Hasonlóan ilyen módon történik a Na+-H+ cseretranszport, amely fontos szerepet játszik a sejten belüli közeg pH-jának a szabályozásában, ill. a Na+-Ca2+ cseretranszport, amelynek szerepe van pl. a Ca2+ vesében való felszívódásában is.

  • Enzimaktiválás, szerkezetalakítás (Na+, K+)

A Na+-K+ ATPáz enzim szerkezetalakításán túl elsősorban a K+ számos más enzim működésében szerepet játszik (pl. adenilát cikláz, szerin deamináz, DNS polimeráz, piruvát kináz stb.)

A nátrium napi ajánlott felvétele 1-2 g. A nátrium-só felvétele hazánkban, a hazai étkezési szokások mellett ennél jóval magasabb, eléri az 5-15 g-ot is. Az étrendben a legtöbb nátrium konyhasó formájában van jelen, de a különféle húsélelmiszerek, pl. sonka, angolszalonna, a kolbász- és szalámifélék tartósítására nátrium-nitritet, számos élelmiszerben pedig izfokozó anyagaként nátrium-glutamátot is használnak. A felesleges nátrium általában a vizelettel távozik a szervezetből. Az arra érzékenyeknél azonban a jelentős nátriumtöbblet folyadékfelhalmozódáshoz és magas vérnyomáshoz vezethet. Ez utóbbi szövődménye szívelégtelenség, szélütés, vese- és szemkárosodás lehet.

A minimális napi káliumszükségletet 1,6 g-ra becsülik. Az egészséges ember esetén az átlagos napi bevitel vegyes táplálkozással 2,0-6,0 g között van, ami bőven fedezi a szükségletet. A kálium külön pótlására legfeljebb vizelethajtó kezelés kapcsán lehet szükség.

Nagymennyiségű kálium bevitele (17-18 g) elsősorban szívproblémákhoz vezet, emellett a mérgezés általános tünetei (hányás, hasi fájdalom, rossz közérzet) jelentkeznek. Ez a hazai étkezési szokások mellett nem léphet fel, csak ha valaki egyéb módon (pl. káliumtartalmú tabletták szedésével) nem juttat több sót a szervezetébe.

A nátrium- és káliumhiány ritka, mert a táplálékkal megfelelő mennyiségű só kerül a szervezetbe. Ugyanakkor a verejtékezés során jelentős mennyiségű só távozik a szervezetből, a forró égövben élőknél, ill. a rendszeresen nehéz testi munkát végzőknél felléphet nátriumhiány. Ennek egyik legelső tünete többnyire a lábikrát érintő izomgörcs, súlyosabb esetben a nátriumhiány kiszáradáshoz vezethet, és vérnyomásesést, szájszárazságot, hányást idézhet elő.

A lítium nem létfontosságú nyomelem, viszont a gyógyászatban a 20. század közepe óta sikeresen használják a Li2CO3-ot idegrendszeri zavarok, elsősorban a mániás depresszió kezelésére (16.7. fejezet).

Alkáli földfémek, Mg2+, Ca2+ Ba2+

A kalcium váz- és testnedvalkotó elem, az ötödik leggyakorib elem az élő szervezetben a szén, hidrogén, oxigén és nitrogén után,. Az emberi szervezetben átlagosan 1000-1200 g kalcium van, 98 %-a a csontokban és a fogakban található, de ennek 1 %-a dinamikus egyensúlyban áll a maradék 2 % kalciummal, amely teljesen eloszlik a testben, a testnedvekben és a lágyszövetekben. A csontokban és fogakban kötötten, hidroxiapatit vegyület formájában található. A sejten belüli, ill. kivüli közeg kalciumkoncentrációja nem egyenletes eloszlású. Az extracelluláris folyadékban a mennyisége 2,1-2,6 mmol/dm3, fele ionos formában, fele fehérjékhez kötötten található. Az intrecelluláris folyadékban a kalcium-koncentráció nagyságrendekkel kisebb, 10–4-10–5 mmol/dm3.

A kalcium legfontosabb élettani szerepei az alábbiak:

  • Az élő szervezetek vázának alkotója

Az emberi szervezetben a hidroxiapatit-mikrokristályok biztosítják a csontok keménységének, nyomási szilárdságának fenntartását (5.5. fejezet).

  • Ingerületátvitel

Az alkálifémionokhoz hasonlóan a sejtmembrán két oldalán kialakuló koncentrációgradiens és iontranszport folyamatok játszanak szerepet az ingerület továbbitásában az idegsejtekről másik idegsejtre vagy izomsejtre

  • Izomműködés (6.3.2. fejezet)

  • Enzimműködés szabályozása, jelátvitel

  • A kalcium mérete és töltése révén reverzibilis és szelektív kötést képes kialakítani számos fehérjével. Ez és a koncentrációkülönbség a sejtmembrán két oldalán teszi alkalmassá arra, hogy a szervezetben „másodlagos hírvivő” szerepet töltsön be. A kalcium szelektív és szoros kötődése megváltoztatja a fehérjemolekula konformációját, enzimek esetén az aktivitását. A megfelelő erősségű kalciumjel kialakulása, a kalciumkoncentráció több nagyságrenddel való növekedése biztosítja az enzimfehérjék aktiválódását, bekapcsolását és ezzel a kívánt folyamatok lejátszódását. Így megvalósul a sejt felszínéhez érkező különböző ingerek továbbítása és sejten belüli változásokká való alakítása (14.2.2, 12.2. és 13.1. fejezetek).

A táplálékkal naponta kb. 1200 mg kalcium kerül az emberi szervezetbe, elsősorban tejjel, tejtermékekkel, valamint zöldségfélékkel (M3.1. táblázat).

M3.1. táblázat: Élelmiszerek kalciumtartalma (mg Ca/100 g).

A külvilágból felvett jelentős mennyiségű kalcium egy része kicserélődik a szervezet kalciumraktáraival, majd a felesleg igen nagy pontossággal kiválasztódik úgy, hogy közben a szérum kalcium-koncentrációja 0,1-0,2 mmol/dm3, az ionos kalcium szint pedig kevesebb, mint 0,1 mmol/dm3 ingadozást mutat.

A túlzott kalciumbevitel (2-3 g/nap) székrekedést okozhat, elősegíti a vesekőképződést, ronthatja a cink és a vas felszívódását.

A kalcium hiánya, ill. a nem megfelelő beépülése a csontokba, fogokba komoly betegségekhez vezet.

  • A csonttömeg 25-35 éves korig növekszik, majd egy rövid egyensúly után megindul életünk végéig tartó csökkenése. Ha az életkor előrehaladtával a csontszövetmennyiség csökkenése olyan súlyos fokú, hogy a csontok szilárdságát lényegesen csökkenti, csontritkulás (osteoporozis) lép fel.

  • D-vitamin hiányában a csontszövet szerves alapállománya nem vagy nem elegendő mértékben vesz fel ásványi anyagokat, ezért összetétele megváltozik, a szerves alapállományból a szokásosnál több, az ásványi anyagokból kevesebb lesz. Ha a hiány gyermekkorban keletkezik (vagy veleszületett rendellenesség), akkor a csontfejlődés, a csont növekedésének üteme eltér a normálistól, ami alakváltozásban, alkatváltozásban (alacsonyabb termet) egyaránt megnyilvánul (angolkór). Felnőttkorban jelentkező formáját csontlágyulásnak (osteomalicia) nevezzük.

A magnézium egyik legfontosabb biológiai szerepe a növények fotoszintézisében való részvétel (8. fejezet). Ugyanakkor az emberi szervezet számára is létfontosságú, a kalciumhoz hasonlóan a váz- és testnedvalkotó elemek közé tartozik. Egy átlagos tömegű felnőtt teste kb. 26 g (1100 mmol) magnéziumot tartalmaz. Ennek 54 %-a a csontokban, 45 %-a a lágyszövetekben és 1 %-a az extracelluláris folyadékban található. Szérumszintje 0, 7-1,1 mmol/dm3 között van, harmada albuminhoz kötött formában, 55 %-a ionos formában, 15 %-a pedig szerves molekulákkal létrehozott komplexekben van jelen. A magnézium élettani szerepét távolról sem ismerjük olyan jól, mint pl. a kalciumét. A legfontosabb szerepei az alábbiak:

  • részt vesz a biomolekulák aktív konformációjának stabilizálásában, enzimek aktiválásában, és ezen keresztül a fehérje-, szénhidrát- és zsíranyagcserében

  • részt vesz az ATP hidrolízisének irányításában, így nélkülözhetetlen az energiacsere folyamatokban

  • szerepet játszik a csontok felépítésében, de szerepe a csontanyagcserében nem pontosan ismert

A napi ajánlott bevitel mennyisége: 280-350 mg, a felszívódás hatásfoka pedig 35-55 %. Magnéziumban gazdagok a zöldségfélék, a hüvelyesek, a gabonafélék, a gyümölcsök, a tejtermékek és a hal.

A bárium vegyületei a legmérgezőbb vegyületek közé tartoznak, azonban a BaSO4-ot még ma is használják röntgenvizsgálatokban kontrasztanyagként (gyomorvizsgálatok). A BaSO4 rendkívül rossz oldhatósága biztosítja, hogy a szervezetből felszívódás nélkül távozik (16.3. fejezet).

Átmeneti fémek

Vanádium

A vanádium egyike a létfontosságú nyomelemeknek, bár az emberi szervezetben játszott szerepe kétséges. Nagy koncentrációban található viszont vanádium egyes gombákban (pl. légyölő galóca/Amanita muscaria) és leginkább a tengervízben honos zsákállatok (pl. Ascidia nigra) szervezetében. A vanádium élő szervezetekben való előfordulásának rövid összegzését az M3.2. táblázat mutatja. A tengeri élőlényekben való szokatlanul nagy koncentrációjú felhalmozódás fontos következménye, hogy egyes kőolajok vanádiumtartalma is eléggé magas.

A vanádiumtartalmú biomolekulák között talán a haloperoxidázok a legjelentősebbek, amelyek részletes tárgyalását a 10. fejezetben már elvégeztük. A vanádium további ismert formáihoz tartozik a Fe-V-S klaszter (hasonló a FeMoco, FeMo-koenzim klaszterhez, lásd 10.2. fejezet), ami a nitrogenáz enzimek egyik alcsoportjának koenzime és egy az evolúció korai szakaszában képződött primitív szerveződés. Figyelemreméltó, hogy csak a FeVco koenzim fordul elő a sejten belül, az összes többi vanádiumtartalmú fehérje vagy membránnal körülvett képződményekben (hólyagocskákban) úgynevezett vezikulákban elkülönítve, vagy a sejten kívül található. Ez biztosan igaz a vörös vagy barna algákban található bromoperoxidázokra, melyek O és N donorokhoz kötött V(V)-öt tartalmaznak. A vanádiumnak a tuniciták és az Amanita mérgesgomba által történő felhalmozódása az atmoszféra meglehetősen kis oxigén koncentrációjának időszakában kezdődött. A tuniciták a vanádiumot V(III) (némely esetben V(IV)O) formában elkülönülten tárolják a vanadofórokban kötve, sztöchimetrikus mennyiségű szulfáttal együtt meglehetősen kis (2-3) pH-n. A legnagyobb V szint az Ascidia gemmata vérsejtjeiben fordul elő 247,2 mM, ami 107 felhalmozási aránynak felel meg (lásd a 2. fejezetben írottakat) a tengervíz környezethez képest.

M3.2. táblázat: A vanádium élő szervezetben ismert formái.

Az Amanita gombában egy egyszerű ligandumhoz az (S,S)-2,2?-N(hidroxi-imino)-di- α-propionáthoz kötötten, annak rendkívül stabilis 1:2 komplexében az Amavadinban fordul elő, amely csupasz, nem-oxo V(IV)-et tartalmaz és nyolcas koordinációjú (M3.1. ábra). A komplex stabilitási állandója lg β2 = 23, ami olyan nagy, hogy az oxocsoport kiszorul a koordinációs szférából és a komplex csupasz V(IV)-et tartalmaz nyolcas koordinációban. A V(IV) komplex egyelektronos reverzibilis oxidációra képes E = 0,8 V, és a megfelelő V(V) komplex képződik, de a V(IV)-komplex is elég stabilis, és vizes oldatban pH 7-en a levegő oxigénjének jelenlétében is stabilan eltartható. Az amavadin bizonyos tiolok (cisztein, glutation) H2O2 általi oxidációjában mediátorként működik, azaz peroxidáz funkciót tölt be. Szubsztrát hiányában a H2O2 oxigénné és vízzé diszproporcionálódik, azaz, mint kataláz funkcionál.

M3.1. ábra: Az amavadin szerkezete.

A vanádiumvegyületek inzulin-utánzó hatásából adódóan az elmúlt 2 évtizedben igen kiterjedt vizsgálatok folytak egyes V(IV)- és V(V)-komplexek potenciális gyógyászati alkalmazásáról. Ennek a kérdéskörnek a részleteit, beleértve a jövőbeli lehetőségeket/korlátokat is, a 16.8. fejezetben már tárgyaltuk.

Króm

A króm biológiai szerepe és létfontosságú besorolása máig is vitatott. Általában egyetértés van abban a tekintetben, hogy a Cr(III)-ionoknak/komplexeknek szerepe van az emlősök szénhidrát és zsír anyagcsere folyamatainak szabályozásában. Ehhez kapcsolódóan több olyan krómtartalmú étrendkiegészítő készítményt is kifejlesztettek, amelyek az izomfejlődést és súlycsökkenést is elősegíthetik. Az ezen folyamatokban résztvevő krómtartalmú fehérjét (ha létezik egyáltalán?) még nem sikerült azonosítani, de a chromodulint, mint a Cr(III) ürítésében résztvevő biomolekulát már azonositották. A chromodulin egy oligopeptid (Mr = 1438), szekvenciájában a Gly, Cys, Glu és Asp aminosavak a meghatározóak és 4 Cr(III)-ion megkötésére képes.

A Cr(III) esetleges előnyös hatásaival szemben a króm(VI)-vegyületek (különösen a K2Cr2O7 porának belélegzése) rendkívül toxikusak és rákkeltő hatásúak. A kromátionok, a szulfát- és foszfátionokhoz való szerkezeti rokonságból adódóan ugyanis lényegesen könnyebben felszívódnak, mint az inert Cr(III)-komplexek. A Cr(VI) – Cr(III) redukciót a glutation tripeptid végzi és a toxicitás a köztitermékként képződő átmeneti CrV-komplexek sejten belüli felhalmozódásával lehet kapcsolatos.

Mangán

A mangán minden élő szervezet számára létfontosságú nyomelem. Az egészséges, felnőtt emberi szervezet, átlagosan 12 – 20 mg mangánt tartalmaz. Az emberi szervezetben szinte kizárólag fehérjékhez kötve található és alapállapotban +2 oxidációs állapotban fordul elő. A mangántartalmú enzimek többnyire redoxi folyamatok katalízisében vesznek részt, ahol a mangán oxidációs állapota +2 - +4 között változhat. Az egyik legismertebb mangántartalmú enzim az Mn-SOD, amelyet a 10. fejezetben már tárgyaltunk. A +2 oxidációs állapotnak a vashoz képesti nagyobb stabilitásából következően a Mn(II)-komplexek sav-bázis folyamatok katalízisében is közre-működhetnek (pl. Mn-tartalmú argináz enzim), ill. helyettesíthetik a Mg(II)-iont is vegyületeiben. A mangán legfontosabb biológiai szerepe azonban a fotoszintézishez kapcsolható, ahol a víz oxidációjában van meghatározó szerepe (lásd 8. fejezet).

A Mn(II)-vegyületek általában nem nagyon mérgezőek, de a szálló porok vagy gőzök belélegzése (főleg a nagyobb oxidációs állapotú vegyületeké, mint a MnO2 és KMnO4) a „manganizmus” nevű idegrendszeri elváltozás kialakulásához vezethet (tünetei a Parkinson-kórhoz hasonlíthatók). A fentiekből következően a levegő mangántartalma nem haladhatja meg az 5 mg/m3 értéket.

A fotoszintézisben játszott szerepéből következően a mangánhiány elsősorban a növények fejlődése szempontjából jelent nagyobb problémát. A mangánhiány (klorózis) legszembetűnőbb jele a levelek sárgulása. Újabban számos emberi megbetegedés kialakulását is kapcsolatba hozzák a mangán hiányával (pl. szénhidrát anyagcsere zavara, sebgyógyulás zavara (kollagenáz szerepe), szabad gyökökkel szembeni ellenálló képesség csökkenése, termékenységi zavar, stb.), de ebben a tekintetben a konkrét ismeretek még eléggé hiányosak. Ezek a megfigyelések azonban alátámasztják, hogy a mangánnak az emberi táplálékban is kellő mennyiségben meg kell jelenni. Az RDA értékét (RDA: recommended diatery allowance, napi javasolt mennyiség) még nem határozták meg, de a javasolt és biztonságos mennyiségre (safe and adequate range of intake) 2,5 – 5 mg Mn/nap (felnőtt) értéket javasolnak. Ez a szükséglet az alapvető élelmiszerekkel könnyen biztosítható, amint az alábbi táblázatból is látható:

Élelmiszerek mangántartalma (mg/kg):

növényi magvak: 17,0gyümölcs: 1,0

teljes kiőrl. gabona: 7,0húsfélék:0,2

zöldségek: 2,5hal:0,05

Ezen adatok érdekessége, hogy szemben a vas és cink biológiai előfordulásával a mangán nem az állati, hanem a növényi eredetű élemiszerekben fordul elő nagyobb mennyiségben, ami nyilvánvalóan következik a fotoszintézisben játszott fontos szerepéből is.

Vas

A vas valamennyi élő szervezet sazámára az egyik legfontosabb és legnagyobb mennyiségben előforduló nyomelem. A felnőtt emberi szervezet átlagosan mintegy 4 g vasat (3 – 5 g) tartalmaz, amely döntő mennyiségében fehérjékhez kötve található. Szerkezeti szempontból a vastartalmú fehérjéket 2 nagy csoportba szokták sorolni: (a) hemfehérjék, amelyek a tetrapirrolvázból felépített makrociklus (lásd 9.2.1. fejezet) közepén tartalmazzák a Fe(II)/Fe(III)-ionokat, (b) nem hemfehérjék, amelyeknek nincs hem prosztetikus csoportja. A nem hemfehérjéken belül további alcsoportként ismeretesek a vas-kén fehérjék (lásd 7.1. fejezet) és az egyéb kötésmódú vasfehérjék, amelyek többnyire Fe-O kötéseket tartalmaznak, hidroxohidas dimerekben vagy a fehérje oldalláncok részvételével.

A különböző vastartalmú fehérjék funkcióit az M3.3. táblázatban foglaltuk össze. Ezeknek a fehérjéknek a szerkezetével és a működésével kapcsolatos információkat ezen összeállítás különböző fejezeteiben már tárgyaltuk, ezért a táblázatban csak utalunk a megfelelő alfejezetekre.

M3.3. táblázat: A vastartalmú fehérjék különböző funkciói.

Igen érdekes következtetések vonhatók le a vasnak a különböző fehérjék között százalékos megoszlására vonatkozó adatokból is. Ezeket az adatokat az M3.4. táblázatban foglaltuk össze feltüntetve egyben a különböző vastartalmú fehérjék legfontosabb jellemző adatait is.

M3.4. táblázat: Az emberi szervezet vastartalmának megoszlása a fontosabb vasfehérjék között (70 kg testsúlyra vetitve, H: hemfehérje, NH: nem hemfehérje).

Az adatok alapján nyilvánvaló, hogy az emberi szervezet összes vastartalmának több mint 70 %-a egyetlen funkcióhoz, az oxigénmolekula megkötéséhez (szállításához/tárolásához) szükséges. E funkció zavartalan ellátását biztosítja továbbá az a 25 % vastartalom, ami a vastárolókban található ferritin formájában. A maradó kevesebb, mint 4-5 % vas jelenti az enzimek vastartalmát (kb. 150 mg vas), ami összemérhető az emberi szervezet réztartalmával, és ami szinte kizárólag enzimekben fordul elő. Ezen adatok alapján nem meglepő, hogy a biológiai oxidációs folyamatokban a réztartalmú enzimek a vashoz hasonló jeletőséggel és gyakorisággal fordulnak elő. Ezt az M3.5. táblázatban is bemutajuk néhány kulcsfontosságú vas-, és réztartalmú enzim egybevetésével.

M3.5. táblázat: Vas- és réztartalmú fehérjék összehasonlító táblázata.

A vasnak a biológiai oxigénszállításban játszott kiugróan fontos szerepéből következően igen lényegesek a vas anyagcserezavarával összefüggő betegségek, ill. ezek kezelésének lehetséges módozatai is. Ezeket a kérdéseket a 15.1. fejezetben már áttekintettük, így e helyen csak néhány további alkalmazásra vagy gyakorlati szempontból érdekes szempontra hívjuk fel a figyelmet.

A vas anyagcsere folyamataival kapcsolatban az egyik kulcskérdés a vas felvételének mechanizmusa, ill. az ezt befolyásoló tényezők megfelelő figyelembe vétele. A szervezet napi átlagos vasforgalma ugyanis kb. 20-30 mg körül van, de ennek csak igen kis hányada, ? 1 mg vas, amely naponta hasznosul, ill. cserélődik. A szervezet a hemoglobin és más vastartalmú fehérjék lebomlása során felszabaduló vasat tehát döntő hányadában nem üríti, hanem a vastároló fehérjékben tárolja és újrahasznosítja. A felszívódást a külső tényezők így kevéssé befolyásolják és a döntő meghatározó tényező a vastárolók telítettsége (ferritin szintje). Vashiány esetén nő, vasfölösleg esetén jelentősen csökken a vas hasznosulása.

A vas kémiai formája azonban ugyancsak befolyásolja a felszívódási folyamatokat. Ebben a tekintetben fontos, hogy a gyomorban minden vasvegyület Fe(III)-ionná oxidálódik, ami különösen lúgos közegben nagyon rosszul oldódik. Lényeges továbbá, hogy a hem vastartalmának felszívódási mechanizmusa más, mint az egyéb formájú vasvegyületeké, így a felvett vas mennyiségét a gyomorsav pH-ja (mennyisége), a táplálék eredete/formája, valamint a Fe(II)- és Fe(III)-komplexek kémiai jellemzői egyaránt befolyásolják.

A táplálék oldaláról nézve a felszívódás hatékonysága az alábbi sorrendben csökken: hem ? Fe(II) ? Fe(III). Ugyancsak csökkentő tényező a gyomorsav termelődés zavara a Fe(III)-ionok könnyű hidrolitikus reakciói miatt semleges vagy lúgos közegben. Ebbe a körbe kell sorolni a gyomorsavcsökkentők (antacidok) szedése esetén kialakult állapotot is. További gátló tényezőként azok a vegyületek említhetők, amelyek a vassal rosszul oldódó csapadékokat vagy nagy stabilitású komplexeket képeznek. Ez főleg a polifenolokra (mint a tannin a teában és egyéb polifenolok pl. a vörösborokban) és polifoszfátokra (pl. növények fitinsav tartalma) érvényes. A felszívódást elsősorban azok az anyagok segítik elő, amelyek a Fe(III)-ionnal savas közegben is közepesen stabilis komplexet képeznek és így növelik az oldhatóságát, ill. amelyek a Fe(III) redukcióját segítik elő. A leghatékonyabb ilyen tekintetben az aszkorbinsav (C-vitamin), de a citromsav és egyes aminosavak (pl. cisztein) is idesorolhatók. Az aminosavak előnyös hatásaiból adódóan az állati fehérjék a nem állati eredetű vasvegyületek felszívódását is elősegítik a gyomor-bél rendszerben megvalósuló lebomlási folyamatok révén. Ezzel ellentétben egyes növényi eredetű fehérjék (pl. szójában) éppen ellentétes hatást mutatnak. Bizonyos fémionok kompetitív folyamatokban gátolják a vas megfelelő felszívódását. Ebben a tekintetben a legveszélyesebb az ólom hatása, amely a felszívódást és a hemszintézist egyaránt károsan befolyásolja, de a kompetíciót a cink, mangán és kobalt jelenlétével párhuzamosan is feltételezik.

A fentiek alapján az is egyértelmű, hogy az esetleges vashiány pótlása nem egyszerű feladat. A komolyabb mértékű vashiány kezelése egyértelműen orvosi beavatkozást igényel. Egészséges emberek esetén is – az életmódtól és körülményektől függően – szükség lehet a vas pótlására. Ilyenkor azonban tekintettel kell lenni, arra hogy a szükséges vasmennyiség nemtől és életkortól függően változhat és az egyes élelmiszerek vastartalma ugyancsak jelentősen különböző lehet. Az M3.6. táblázatban a napi vasszükséglet értékeket foglatuk össze, míg az M3.7. táblázat egyes élelmiszerek vastartalmát mutatja.

M3.6. táblázat: Az emberi vasszükséglet számszerű értékei.

M3.7. táblázat: Egyes élelmiszerek vastartalma.

Kobalt

A kobalt létfontosságú nyomelem, amelynek az emberi szervezetben betöltött szerepe szinte kizárólag a B12 vitaminhoz, ill. az abból származtatható koenzimekhez rendelhető. Ennek az igen fontos témakörnek a részletes tárgyalását a 13.2. fejezetben már elvégeztük. Figyelembe véve ezen koenzimek viszonylag alacsony kobalttartalmát, az ember és más magasabb rendű élő szervezetek kobalttartalma is meglehetősen alacsony ( ~ 3 mg Co/70 kg testsúly). A kobalt (és hasonlóképpen a nikkel) biológiai szerepét áttekintve azonban kitűnik, hogy ez a két nyomelem igen fontos szerepet tölt be az anaerób baktériumok működésében, azaz az evolució kezdeti szakaszában a kobalt és nikkeltartalmú enzimek jelentősége sokkal nagyobb volt. Ennek megfelelően a baktériumokban egyre nagyobb számban azonosítanak nem corrinvázat tartalmazó kobalt enzimeket (pl. metionil aminopeptidáz, prolidáz, nitril hidratáz, glükóz izomeráz, stb.), amelyek szerkezete sok tekintetben a Zn(II)-enzimekhez hasonlítható. Ezek az enzimek egyébként egyre nagyobb ipari/biotechnológiai jelentőséggel bírnak, pl. a kobaltfüggő glükóz izomeráz enzimet igen kiterjedten használják a magas fruktóztartalmú gabonaszirupok glükózból történő előállítására. A kobalt közvetett gyógyászati szerepével kapcsolatban pedig a 60Co izotópnak a nukleáris medicinában (pl. sugárterápiában) való alkalmazását emelhetjük ki.

Az emberi szervezet számára az egyszerű Co(II/III)-vegyületek egyébként viszonylag mérgezőek. A napi megengedett felső határ kisebb, mint 2 mg, de ez is szükségtelen, mivel a kobalt pótlása kizárólag a B12 vitamin révén lehetséges. Az ilyen módon bevitt kobaltszükséglet is rendkívül kicsi: 0,1μg/nap.

Nikkel

Napjainkban már igen nagyszámú nikkeltartalmú enzimet szerkezetileg és a katalitikus ciklus jellemzői alapján is részletesen ismerünk, és az emberi szervezet állandó alkotójaként mintegy 7-10 mg Ni/70 kg testsúly is kimutatható. Ennek ellenére a nikkeltartalmú biomolekuláknak a magasabbrendű élő szervezetekben (pl. ember és más emlősök) betöltött szerepére még nincs ismert példa. Igen gyakoriak ugyanakkor a nikkeltartalmú enzimek a különféle baktériumok körében és a növényvilágban is. Ez összhangban van azzal a kobalt tárgyalása során már említett ténnyel, hogy ez a két elem sokkal fontosabb szerepet játszott a földi élet kialakulásának kezdeti szakaszában. Az evolució során a hatékonyabb/megbízhatóbb rendszerek kiszorították ezeket a molekulákat és szerepük csak a máig is létező alacsonyabb rendű szervetekben maradt fenn. Ezen mikroorganizmusok léte/működése azonban nem teljesen független az emberi szervezettől sem. A legsúlyosabb krónikus gyomor-bél rendszeri fertőzések kiváltója pl. a Helicobacter pylori, amelynek létezése nem független a nikkeltartalmú ureáz enzimtől és ez a felismerés a betegség kezelésében is új utakat nyithat.

A nikkeltartalmú enzimekkel egyébként több területen is találkozhatunk. A legismertebb nikkeltartalmú enzim az ureáz a hidrolázok közé sorolható és ennek tárgyalását a 12.4.1. fejezetben már elvégeztük. Ugyancsak jelentős csoportot képviselnek a nikkeltartalmú hidrogenázok, amelyekről a 10.3. fejezetben volt szó. Szerkezeti szempontból is nagyon érdekes a korfinvázat és nikkelt is tartalmazó F430 koenzim, amely a metanogén baktériumokban fordul elő és amelyet a 10.4. fejezetben ismertettünk. Ugyancsak alkotója a nikkel a szuperoxid dizmutáz enzimek legújabban felismert csoportjának, amelyről a 10. fejezetben volt szó. A nikkeltartalmú enzimek egyik érdekessége, hogy bár az egyszerű komplexvegyületekben a nikkel szinte kizárólagosan kétértékű kationként szerepel, addig az enzimek működése a Ni(I), Ni(II)és Ni(III) oxidációs állapotok mindegyikét igényli.

Gyakorlati szempontból is egyre jelentősebb, de viszonylag új területe a nikkel biológiai szerepének a nikkel hiperakkumuláló növényekhez kapcsolható. A nehézfémek toxikus hatásával szembeni védekezésre a növények két mechanizmust is kifejlesztettek. Vannak olyan növények, amelyek bizonyos határok között képesek kizárni (excluders) a nehézfémek felszívódását, és vannak, amelyek képesek szokatlanul magas koncentrációban felhalmozni (hyperaccumulators) bizonyos elemeket. A felhalmozás legismertebb formáit a nikkel esetében írták le és ez ipari/környezetvédelmi alkalmazások alapjául szolgálhat (phytomining/phytoremediation).

A nikkel és különösen egyes vegyületeinek toxicitása hosszú idő óta ismeretes. A kiemelkedően veszélyes anyagok közé sorolható pl. a Ni(CO)4, amelynek belélegzése azonnali légzési zavart vagy halált okozhat. Egyes nikkel-szulfidok és oxidok (pl. Ni3S2 és NiO) a rákkeltő anyagok csoportjába tartoznak. A legáltalánosabb és legismertebb formája a nikkel toxicitásának azonban a Nickel Dermatitis, ami az allergiás megbetegedések közé sorolható. A nikkeltárgyakkal (pl. ékszer, egyéb használati tárgy) való tartós érintkezés eredményeként kialakuló, az ekcémás kiütésekhez hasonlítható bőrelváltozást jelent, amelynek kialakulása és kezelési mechanizmusa még kevéssé ismert.

Réz

A réz valamennyi ismert élő szervezet számára létfontosságú nyomelem. A felnőtt emberi szervezet mintegy 120 mg rezet tartalmaz, szinte kizárólag fehérjékhez kötött formában. A réztartalmú fehérjék túlnyomó többségükben enzimatikus funkciót töltenek be és a Cu(II) – Cu(I) redoxirendszer révén a biológiai oxidációs folyamatokban vesznek részt. A réz biokémiája tehát igen nagymértékben hasonlít a vas biológiai szerepéhez, amint az M3.5. táblázat révén erre már a vasnál is utaltunk. Ebből a táblázatból látható, hogy a réztartalmú fehérjék a molekuláris oxigén részvételével lejátszódó folyamatok szinte mindegyikében szerepelhetnek és a főbb képviselőik részletes tárgyalását a 10.1.2. 10.1.4. fejezetekben már elvégeztük. Az ugyancsak korábban tárgyalt 10.1. táblázat a legfontosabb réztartalmú fehérjéket elnevezés, funkció és jellemzők szerint és részletezi. Az alacsonyabbrendű élő szervezetekben a réz az oxigén szállításának funkcióját is betölti (lásd hemocianin, 9.2.3. fejezet). A réztartalmú fehérjék egy további csoportja az elektronszállító fehérjék közé tartozik (kékréz fehérjék), amelyekkel a 7.3. fejezetben foglalkoztunk. Az albumin, ceruloplazmin és a metallothioneinek tárgyalásához kapcsolódóan a réz szállításának és tárolásának főbb kérdéseit is érintettük (lásd 5.4. és 5.3. fejezetek). A réz esetén nagyon jól ismertek az elem felhalmozódásával (Wilson-kór) és hiányával (Menkes-kór) összefüggő megbetegedések is, amelyek jellemzőit a 15.1. fejezetben foglaltuk össze.

A réztartalmú fehérjék kémia jellemzőinek egy fontos érdekessége, hogy ezekben a vegyületekben réz kötésmódja és/vagy koordinációs geometriája nem értelmezhető egyszerűen azokkal a paraméterekkel, amelyek a réz különböző oxidációs állapotú modell komplexeihez általánosan rendelhetők. A réztartalmú fehérjéket ezért különböző szerkezeti típusokba sorolták, amelyekről az M3-8. táblázat ad egy összegző áttekintést.

A táblázat alapján látható, hogy a réztartalmú fehérjék fémcentrumai 3 fő szerkezeti típusba sorolhatók és ezek mindegyikének működési mechanizmusa a Cu(I)-Cu(II) redoxirendszerhez rendelhető. A szerkezetileg újabban azonosított réztartalmú fehérjék esetén azonban a három fő típustól eltérő kötésmódokat is találtak. Ezeket általánosan CuX jelöléssel azonosítják. Ilyen pl. a citokróm c-oxidázban található vegyesvegyértékű CuA (lásd 10.1.3. fejezet és 10.3 ábra) és a trigonális piramisos CuB (10.1.3. fejezet), vagy a nitrogén-monoxid reduktáz enzimben azonosított tetranukleáris CuZ, amelyben a kénhiddal összekapcsolt rézatomokat összesen hét hisztidin koordinálja.

M3-8. táblázat: A fehérjékben előforduló rézcentrumok jellemzése.

A réznek és vegyületeinek a mindennapi életben játszott szerepéhez kacsolódva érdemes kiemelni, hogy a fehérjék irányába mutatott nagy affinitásából következően a rézvegyületek eléggé toxikusak. A rézmérgezés első tüneteit a hányás, hasmenés, majd májműködési és idegrendszeri zavarok jelzik. A maximálisan megengedett napi dózis semmiképpen nem haladhatja a 10 mg-ot, de az RDA érték csak 0,8-1,0 mg/nap mennyiség felvételét javasolja. Megfelelő táplálkozás mellett ez a mennyiség viszonylag könnyen biztosítható, amint azt az M3.9. táblázatban összefoglalt néhány adat is mutatja.

M3.9. táblázat: Egyes élelmiszerek réztartalma (mg/100 g élelmiszerben).

Cink

A cink a második leggyakoribb és funkcióinak számát, változatosságát tekintve talán a legfontosabb nyomelem. Az élet valamennyi formája számára nélkülözhetetlen és szinte valamennyi élő sejtben megtalálható. Az egészséges, felnőtt emberi szervezet – földrajzi helytől és életkortól függetlenül – mintegy 2-3 g Zn/70 kg-testsúly mennyiségben tartalmaz cinket. A szervezet cinktartalmának legnagyobb része (? 57 %) az izomszövetben található 51 μg/g átlagos mennyiségben. Ugyancsak jelentős az emberi csontok cinktartalma (az összes cink ? 29 %-a), ahol a koncentrációja közel 100 μg/g. Jelentős mennyiségben fordul elő a belső szervekben (pl. máj – 58 μg/g, vese – 55 μg/g) és a hajban is (150 μg/g). A relatíve legnagyobb koncentrációban azonban az emberi szemben (274 μg/g) és a prosztata által termelt váladékban található (300 – 500 μg/g).

A cink az élő szervezetben gyakorlatilag csak fehérjékhez kötött állapotban fordul elő, amikoris a kémiai kötés a fehérjék aminosav oldalláncaiban található funkciós csoportokkal (általában His-N, Cys-S és Asp/Glu-O atomok) valósul meg. Ezeknek a cinktartalmú fehérjéknek a biokémiai folyamatokban betöltött szerepét 3 fő csoportba szokták sorolni:

- katalitikus szerep, cinkionnal az aktív centrumban: Ezek az enzimek többnyire sav-bázis folyamatokat katalizálnak (metallohidrolázok), mint pl. a szervezet szén-dioxid felvételének és leadásának szabályozása a szénsav anhidráz enzimen keresztül. Ebbe a csoportba tartoznak azonban azok az enzimek is, amelyek a legfontosabb biológiai makromolekulák (mint a fehérjék, nukleinsavak és szénhidrátok) szintézisét és lebontását segítik elő (pl. amino- és karboxipeptidázok, nukleázok, polimerázok, kollagenázok, foszfatázok, stb.). Az ebbe a csoportba tartozó enzimek számos képviselőjének részletes tárgyalását a 12.1. 12.4. fejezetekben már elvégeztük.

- szerkezetalakító szerep: azokat a cinktartalmú fehérjéket jelenti, amelyekben a cinkionok a makromolekula másodlagos szerkezetét (konformációját) stabilizálják és a molekula más része így katalitikus vagy egyéb funkciót láthat el. Ebbe a csoportba is nagyszámú enzim tartozik, amelyek egy redoxi kofaktor részvételével többnyire már redoxi folyamatokat katalizálnak, pl. az alkohol-dehidrogenáz (a NAD közreműködésével, lásd 11.4. fejezet) vagy a réz/cink-szuperoxid diszmutáz (a réz részvételével, lásd 10.1.4.2. fejezet). A szerkezetalakító funkciók körébe sorolhatjuk azt a szerepet is, amit a Zn(II)-ionok az inzulin tárolásában töltenek be (lásd 14.1. fejezet).

- szabályozó szerep: ez a funkció szorosan kapcsolódik az előzőhöz, amikor csak a cink által meghatározott fehérjeszerkezet alkalmas a „molekuláris felismerésre”, azaz pl. a genetikai információ átadására. Ilyenek pl. a „cink-ujjak” nevű fehérjék (lásd 14.2.1. fejezet).

Az előzőekben ismertetett funkciókból követkeően az emberi szervezet normális működése feltételezi a cink és a cinktartalmú fehérjék megfelelő mennyiségben való jelenlétét és folyamatos utánpótlását. A cink tárolásában döntő szerepe a metallothionein nevű fehérjéknek/polipeptideknek van, amelyek szerkezeti és funkcionális jelélemzőivel már foglalkoztunk (lásd 5.4. fejezet). A cink felszívódása döntő mértékben a vékonybélen keresztül valósul meg és – a vassal ellentétben – koncentrációfüggő folyamat. A keringési rendszerben a cink koncentrációja viszonylag alacsony, kb. 2-3 mg/l a vérben és kevesebb, mint 1 mg/l a szérumban. Ez az összes cinktartalomnak csak néhány tized %-át képviseli, azaz a cink a keringési rendszeren gyorsan áthalad és funkciója is zömmel azon kívül érvényesül. A cink a szervezetből minden formában (széklet, vizelet és verejték) ürül, összesen mintegy 1-5 mg/nap mennyiségben a testsúlytól függően. Ennek nagyobb hányadát a széklet képviseli, amelynek cinktartalma függ leginkább a táplálék összes cinktartalmától. Éhezés és fokozott fizikai erőfeszítés a vizeletben vagy verejtékkel ürülő cink mennyiségét növeli.

A felszívódás részfolyamatai ugyan kevéssé ismertek, ennek ellenére viszonylag sok információ áll rendelkezésre azokról a tényezőkről, amelyek a táplálékból felvett cink mennyiségét befolyásolják. Ezen adatok esetenként nagyon ellentmondásosak, de néhány fontosabb tényező mindenképpen kiemelhető:

- A szabad Zn(II)-iont tartalmazó vagy vízoldható cinkvegyületek felszívódásának hatékonysága nagyobb, mint a szilárd táplálékkal bevitt és oldhatatlan formáknak.

- Egyes kis moltömegű szerves komponensek (pl. az aminosavak, főleg a cisztein és metionin, vagy a hidroxikarbonsavak, mint a citromsav és a glükonsav) javítják a cink felszívódásának hatékonyságát. Az aszkorbinsav (C-vitamin) esetén ilyen hatást nem tudtak kimutatni, de gátlást sem.

- A cink felszívódása során kompetíció figyelhető meg a cink és más nyomelemek, ásványi anyagok felvétele között. Ennek megfelelően nagy mennyiségű kalcium, magnézium, vas vagy réz jelenléte számottevően csökkenti a cink abszorpcióját. Fontos azonban kiemelni, hogy ez a hatás a normális étrendi mennyiségek mellett elhanyagolható.

- Egyes kelátképzők, amelyeket például nehézfémmérgezések kezelésére is alkalmaznak (pl. EDTA, desferrioxamin, penicillamin, stb.) egyértelműen hátrányosan befolyásolják a cink felszívódását, sőt elősegítik a szervezet cinktárolóinak kiürülését.

- A cink felszívódását legegyértelműbben gátló anyagok között a fitinsavat és származékait kell megemlíteni. A fitinsav (vagy inozitol-hexafoszfát, C6H18O24P6) a növények legfontosabb foszfortároló vegyülete. A fitinsav különösen nagy mennyiségben található a növényi héjakban (pl. korpa) és a magvakban (gabonafélék és hüvelyesek, legnagyobb koncentrációban a szójában). A fitinsav teljes biológiai hatásának értékelése egy nagyon összetett kérdés, mivel sok ásványi anyag metabolizmusát és a foszfor anyagcseréjét is befolyásolja, és így számos előnyös hatása van. A cink szempontjából nézve azonban a fitinsavtartalom mindenképpen negatív tényező, mivel a nagy stabilitású cinkkomplexe a szervezetbe került cink hasznosulása ellen hat.

A cink sokrétű biológiai szerepéből következően napjainkban sokan úgy vélik, hogy a cink hiánya igen nagy számú fiziológiás elváltozás kiindulópontja lehet, amelyben közvetlen és közvetett hatások egyaránt vannak. Az irodalmi adatok egybevetése alapján azt mondhatjuk, hogy szinte nincs olyan emberi megbetegedés, amit ne hoztak volna valamilyen szinten kapcsolatba a cink hiányával. Ez természetesen túlzás, de néhány kísérletileg is igazoltnak látszó elváltozás mindenképpen megemlíthető.

a) A súlyos cinkhiánnyal összefüggő elváltozások között említhető a genetikai eredetű „acrodermatitis entheropathica”, ami egy bőrelváltozásokkal kísért súlyos fejlődési rendellenesség, többnyire gyermekkorban halálos kimenettel. Állandó cinkterápiával a betegség ma már jól kezelhető.

b) Az enyhefokú cinkhiánnyal összefüggő elváltozások száma igen nagy, a legismertebbek az alábbiak:

- Fejlődési, növekedési zavarok:Számos tanulmány igazolja, hogy a gyermekkori cinkhiányos állapotok súlyos növekedési zavarokat okozhatnak (magasság és testsúly egyaránt), amelyek egy bizonyos idő után már nem kezelhetők. Ez a jelenség különösen gyakori a fejlődő országokban, de a nyugati világban is számos példa ismert.

- Idegrendszeri, mentális és viselkedési zavarok.

- Szexuális érettség és nemi hormonok termelése, impotencia:A cinkhiány egyértelműen lelassítja vagy akár gátolja a szexuális érettség kialakulását, különösen lánygyermekek esetén. Felnőttkorú férfiak esetén viszont a hormontermelődés van összefüggésben a megfelelő cinkkoncentrációval. A cink egyfelől szükséges a normális tesztoszteronszint fenntartásához, másrészt gátolja annak fölös ösztrogénné történő konvertálását. Idősebb korban és cinkhiány esetén ezért a tesztoszteron/ösztrogén arány 50:1-ről akár 10:1-re csökkenhet, ami a szexuális zavarok mellett elhízást és szívműködési problémákat is okozhat. Ugyancsak egyértelműen dokumentálták, hogy a cink alapvetően fontos a spermiumtermelődés és azok mozgékonysága szempontjából.

- A cink védi a bőrt és gyorsítja a sebgyógyulást:A cink alapvetően fontos a bőr egészséges állapotának fenntartásához. Külső alkalmazása (főleg cink-oxid formájában) számos kozmetikumban ma már általánosan elfogadott.

- A cink és a megfázás kapcsolata:A megfelelő cinkkoncentráció fontos az immunrendszer egyensúlyának fenntartása szempontjából és így hozzájárul a legegyszerűbb betegségek, mint a nátha kifejlődésének megelőzéséhez is. Ennek pontos dokumentálása azonban nem egyértelmű, szemben a megfázásos állapot gyógyulásának jelentős gyorsulásával. Az adatok többnyire cink-glükonát alkalmazására vonatkoznak, de a megfázásos betegségek lefolyása más cinktartalmú készítményekkel is jelentősen rövidíthető.

A szervezet cink utánpótlásának biztosítása vegyes étrendű táplálkozással könnyen megoldható. Ennek megértését segítik az M3.10. táblázatban összefoglalt RDA értékek, valamint az egyes élelmiszerek cinktartalmát összegző adatok (M3.11. táblázat). A terhesség és szoptatás ideje alatt 3-4 mg Zn/nap többlet mennyiség felvétele indokolt.

M3.10. táblázat: Az emberi cinkszükséglet számszerű értékei.

M3.11. táblázat: Egyes élelmiszerek cinktartalma (mg/kg).

A cink és vegyületei a kevésbé toxikus nehézfémek közé tartoznak, de túlzott mértékű felvétele heveny és krónikus mérgezés formájában egyaránt jelentkezhet. A viszonylag ritka heveny mérgezések a vízoldható cinkvegyületek lenyelésével, vagy cink-oxid (vagy egyéb kevéssé oldódó vegyületek) porának belélegzésével fordulhatnak elő. A mérgezés első tünetei a hányás, hasmenés, nagyobb koncentrációk esetén szívműködési zavarok és máj/veseelégtelenség. A tünetek általában 150-450 mg/nap cinkmennyiség felvételét követően jelennek meg, de a halálos dózis felnőtt emberben valószínűleg 20 g körül van (10 – 30 g/nap a vegyület típusától, testsúlytól, életkortól és egyéb körülményektől függően).

A krónikus cinkmérgezés kialakulásának lehetősége sokkal gyakoribb és lényegesen kisebb mennyiségek rendszeres felvétele után előfordulhat. Ennek megfelelően a cinkvegyületek legmagasabb megengedett napi dózisát (UL) egészséges felnőtt emberi szervezet esetén UL = 40 mg Zn/napmennyiségben szokták megadni, amely alatt rendszeres fogyasztás esetén sem mutatkoznak mérgezésre utaló tünetek.

Molibdén

A molibdén az egyetlen nagyobb rendszámú (4d) átmenetifém, amely a létfontosságú nyomelemek közé sorolható. Az emberi szervezet mintegy 5 mg mennyiségben tartalmaz molibdént. A biológiai rendszerekben játszott szerepét két tényezővel szokták értelmezni: (i) a molibdén a földkéregben ugyan viszonylag ritka elem, de nagyon jól dúsul a tengervízben és ott a leggyakoribb átmenetifémnek tekinthető. (ii) A molibdén kémiája rendkívül összetett, ami a +2 és +6 között oxidációs állapotok révén, különböző kationos, oxokationos és anionos formák létezését egyaránt eredményezi és ezek részvételével specifikus kölcsönhatások valósulhatnak meg.

A molibdén biokémiájának további érdekessége, hogy szerepe kizárólagosan két koenzim reakciói révén valósul meg. Ez a két koenzim a molibdopterin kofaktor (Mo-co) és vas-molibdén kofaktor (FeMo-co), amelyek mindegyike nehezen izolálható és környezeti feltételek mellett könnyen bomló vegyület. A molibdopterin kofaktor az oxotranszferáz enzimek általános koenzime, amelyek részletes tárgyalását a 11.3. fejezetben végeztük el. A vas-molibdén-kofaktor a nitrogenáz enzim alkotója, amelynek működését a 10.2. fejezetben ismertettük.

A molibdén hiányával vagy fölöslegével összefüggő emberi megbetegedés mindezideig nem ismert, és a molibdénvegyületek nem tartoznak a különösebben toxikus átmenetifémek közé sem.

A molibdén és volfram kémiai hasonlósága alapján érdemes még megemlíteni, hogy egyes mikroorganizmusokban a molibdopterin kofaktor molibdénatomját wolfram helyettesítheti (W-co). Ezen kofaktor enzimatikus hatása ugyanaz, mint a molibdopterin kofaktoré, de a gazda szervezetek többnyire a hőtűrő mikroorganizmusok közé sorolhatók. Ez alapján valószínűsíthető, hogy az evolúció korábbi fázisaiban a volfram nagyobb szerepet játszhatott, majd a későbbiekben a gyakoribb molibdén helyettesítette.

A p-mező elemei

A p-mező létfontosságú elemei között természetesen a szerves vegyületek alkotóelemei a meghatározóak, amelyek tárgyalása azonban nem a bioszervetlen kémia feladata. A bioszervetlen kémiában ugyancsak nem szoktunk foglalkozni a jód és más halogének biológiai szerepével, mert ezek az elemek is többnyire szerves alkotókhoz kapcsolva, vagy szabad anionként (pl. Cl) fejtik ki hatásukat. Létfontosságú elemként szokás említeni a szilíciumot is és ennek biológiai szerepéről a biomineralizációról szóló 5.5. fejezetben már röviden volt is szó.

A p-mező elemei között napjainkban leginkább érdekesnek számító nyomelemként a szelént szokás említeni. A szelén ugyanis egyrészt valamennyi élő szervezet számára nélkülözhetetlen nyomelem, másrészt a szelénvegyületek a legtoxikusabb vegyszerek közé sorolhatók. A szelén biokémiája ugyancsak a szerves vegyületekbe beépülve szelenocisztein- vagy szelenometionin-tartalmú fehérjéken keresztül érvényesül. A legfontosabb szeléntartalmú enzim a gluation peroxidáz enzim jellemzőit a 10.1.7. fejezetben már ismertettük, míg a szelén biokémiájával és a szelén anyagcsere folyamataival összefüggő egyéb kérdéseket a 15. 1. fejezetben foglaltuk össze.