Gyógyszer- és élelmiszer-biotechnológia

Prof. Dr. Pócsi, István

Debreceni Egyetem

Dr. Pusztahelyi, Tünde

Debreceni Egyetem

Dr. Emri, Tamás

Debreceni Egyetem

Dr. Leiter, Éva

Debreceni Egyetem

Szerzői jog © 2013 Debreceni Egyetem

TÁMOP-4.1.2.A/1-11/1 MSc Tananyagfejlesztés

Interdiszciplináris és komplex megközelítésű digitális tananyagfejlesztés a természettudományi képzési terület mesterszakjaihoz

2013

Előszó

A jelen digitális tananyag a TÁMOP-4.1.2.A/1-11/1-2011-0025 számú, "Interdiszciplináris és komplex megközelítésű digitális tananyagfejlesztés a természettudományi képzési terület mesterszakjaihoz" című projekt részeként készült el.

A projekt általános célja a XXI. század igényeinek megfelelő természettudományos felsőoktatás alapjainak a megteremtése. A projekt konkrét célja a természettudományi mesterképzés kompetenciaalapú és módszertani megújítása, mely folyamatosan képes kezelni a társadalmi-gazdasági változásokat, a legújabb tudományos eredményeket, és az info-kommunikációs technológia (IKT) eszköztárát használja.

Jelmagyarázat

Bejelentkezés a tesztkérdésekhez a Debreceni Egyetem Moodle oldalán:

Felhasználó: hallgato

Jelszó: Hallgato_12

1. fejezet - Gyógyszerészeti (’pharmaceuticals’), biológiai (’biologics’) és gyógyszer-biotechnológiai (’biopharmaceuticals’) termékek

A gyógyszeripari termékeket alapvetően három csoportba sorolhatjuk, (1) hagyományos, alapvetően kémiai szintéziseken alapuló (’pharmaceuticals’), (2) biológiai eredetű (pl. vérből kinyert biomolekulák, vakcinák, toxinok, allergének; ’biologics’) és (3) gyógyszer-biotechnológiai (’biopharmaceuticals’) készítmények.

A hagyományos gyógyszerészeti ipar termékei döntően kis molekulatömegű, preferáltan kémiai szintézisekkel előállított molekulák (’pharmaceuticals’). Ezek előállításához kémiai szintetikus üzemekre és formulázó üzemekre van szükség. Az első szintetikus gyógyszerek előállítását a mikrobiológia (a fertőző betegségeket okozó mikroorganizmusok megismerése) és a szerves kémia (a kémiai reakciók törvényszerűségeinek a feltárása) rohamos fejlődése tette lehetővé a XIX. század végén (pl. Aspirin), továbbá a XX. század első harmadában (pl. szulfonamid típusú antibiotikumok; „sulfa” vegyületek). A fertőző betegségek leküzdésében áttörést jelentett a penicillin származékok (1940-es évek), majd később a tetraciklinek és aminoglikozidok fermentációs ipari előállítása. A mikrobiális biotechnológiai úton előállított gyógyszer-hatóanyagok térnyerése döntő mértékben járult hozzá a ma rutinszerűen használt fermentációs technológia eszközök és eljárások fejlődéséhez. Mind a mai napig azonban a forgalomba kerülő gyógyszerek meghatározó hányadát a kémiai szintetikus ipar állítja elő, bár számos esetben alkalmaznak mikroorganizmusokat bizonyos vegyületek, vegyületcsoportok kémiai szerkezetének az átalakítására, illetve módosítására (biokonverziós folyamatok; lásd pl. a kortikoszteroid készítmények előállítását).

Bár minden gyógyszer, amelyet biotechnológiai eljárással állítanak elő, „biológiai” terméknek tekinthető, mégis a gyógyszerek szűkebb körére alkalmazzák a biológiai termék (’biologics’) meghatározást. Például az USA Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) központja illetékességi körébe tartoznak a teljes vér, vérkomponens, vérszármazék, vérhelyettesítő, antitoxin, antivenin, toxoid, allergén készítmények, továbbá a vakcinák, a génterápiás termékek, valamint a sejtek és szövetek felhasználásán alapuló készítmények. A biotechnológiai termékek meghatározó hányadának (pl. mikrobiális metabolitok, hormonok, terápiás enzimek, citokinek, monoklonális antitestek) esetében viszont a Center for Drug Evaluation and Reasearch (CDER) az illetékes.

A gyógyszer-biotechnológiai termékek (’biopharmaceuticals’) ma alapvetően géntechnológiai úton előállított gyógyhatású fehérjék, illetve hibridóma technológiával nyert monoklonális antitestek, de ide tartoznak a nukleinsav alapú készítmények (DNS, RNS, antiszensz oligonukleotidok) is. A gyógyszer-biotechnológiai termékek száma 2006-ban 160 volt összességében 35 milliárd USA dollár értékben, ugyanakkor mind a termékek száma, mind az árbevétel dinamikusan növekszik (a 2010-es becsült bevétel 50 milliárd USA dollár körül volt).

Gyógyszer-biotechnológiai termékek

A gyógyszer-biotechnológiai eljárások, termékek fejlesztését egyértelműen a rekombináns DNS technológia (’genetic engineering’) és a monoklonális antitest technológia térnyeréséhez köthetjük. A DNS technológia fejlődése révén vált lehetővé a szervezetben igen kis mennyiségben jelenlévő, ugyanakkor nagy biológiai aktivitással bíró fehérjék nagy volumenű gyártása. A technológia fejlődésének további kedvező hatása az, hogy megjelenhettek a piacon garantáltan vírus- és prionmentes termékek, lehetővé vált kellemetlen (pl. emberi vizelet) és veszélyes (pl. kígyóméreg) alapanyagok mellőzése és a fehérjetermékek módosítása (’protein engineering’) is. Az utóbbira példák a gyorsan, vagy éppen lassan ható inzulin, a gyorsan ható plazminogén aktivátor, a kiméra/humanizált antitestek és fúziós fehérjék (pl. IL-2-kolera toxin – ’Ontak’).

Ha a gyógyszer-biotechnológiai termékek jelenlegi spektrumát nézzük, megállapítható, hogy a monoklonális antitestek mellett a rekombináns fehérjék dominálnak, pl. véralvadási faktorok (faktor VIII és IX), trombolítikus ágensek (pl. a szöveti plazminogén aktivátor, tPA), hormonok (inzulin, növekedési hormon), a vérképzést stimuláló faktorok (kolónia-stimuláló faktorok; CSF-ek, eritropoietin, EPO), interferonok (IFN-α, -β, -g), interleukinok (IL-2), rekombináns vakcinák (hepatitis B felületi antigén) és terápiás enzimek. A rekombináns fehérjék előállítására számos expressziós rendszer szolgál, ilyen fehérjéket termeltethetünk Escherichia coli baktériumban, Saccharomyces cerevisiae élesztőben, baculovírus alapú expressziós rendszerrel, valamint emlős sejtekben, pl. kínai hörcsög petefészek (’Chinese hamster ovary’, CHO) tenyészetekben.

Monoklonális antitestek előállítása

A monoklonális antitestek előállítása a klasszikus Milstein-Köhler-féle eljárással történhet, melynek keretében a kiválasztott antigénnel egeret immunizálnak, majd a poliklonális antitest termelés kiváltása után az állat lépjéből származó B-limfocitákat egér eredetű mielóma sejtekkel fúzionáltatnak (1. ábra). A kialakuló hibridómákat ’HAT’ (hipoxantin, aminoptrein, timidin) tápközegben szelektálják, aminek az elvi alapja az, hogy a mielóma sejtekben nem működik a hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz enzim, ami lehetővé teszi a purin bázisok be(vissza)áramlását a nukleinsavak bioszintetikus útvonalába (’salvage’ útvonal). Így a purin bázisok folyamatos ’de novo’ szintézise lenne szükséges, amit viszont aminopterinnel blokkolnak. Azaz a hiányzó enzimaktivitást a mielóma sejt csak egy B-limfocitával történő fúziót követően szerezheti meg (a B-limfociták élettartama a szelekciótól függetlenül véges). Ezt követően a kialakuló immortalizált hibridóma sejteket megfelelő hígítást követően mikrotiter lemezen felszaporítják, és a várt antitest termelésére nézve ’screen’-elik, pl. az immunizálásra felhasznált antigénnel immunokémiai reakciót hajtanak végre ELISA – ’enzyme-linked immunosorbent assay’ keretében. A továbbiakban a kiválasztott, megfelelő specifitású antitestet termelő klónt szaporítják tovább (1. ábra).

1. ábra Monoklonális antitestek előállítása hibridóma sejtvonallal.

Humán terápiára emberi-egér kiméra (a névben –xi-), humanizált kiméra (-xi- + -zu-), kiméra képzés nélkül humanizált (-zu-), illetve rekombináns emberi (-u-) antitestek használhatók. Ezek előállítását az teszi lehetővé, hogy ma a megfelelő génszekvenciák ismeretében molekuláris genetikai eszközökkel az antitestek változékony régióinak (VH, VL) az antigénnel közvetlenül kapcsolódó szakaszai (’complementary determining region’, CDR), továbbá a konstans (Fc) régiók lényegében szabadon kombinálhatók. Például a hatékony egér monoklonális antitest CDR régiói (a kódoló cDNS szakaszok PCR-amplifikálását követően) beépíthetők egy alkalmas emberi antitest vázba (-zu- antitestek). A létrehozott rekombináns antitestek, hasonlóan más rekombináns fehérjékhez, megfelelően megválasztott expressziós rendszerben (pl. emlős sejtkultúrában, élesztőben) lényegében korlátok nélkül kifejeztethetők. A rekombináns humán antitestek előállítása érdekében először az izolált B limfocitákból mRNS-t izolálnak, majd ezek cDNS-sé történő átírását követően a H (’heavy’) és L (’light’) láncokat kódoló DNS szakaszokat PCR-rel amplifikálják. Speciális restrikciós endonukleázokkal való emésztést követően a H és L láncok fragmentumait (a VH és VL régiókat tartalmazzák) külön l bakteriofág vektorokba inzertálják, azaz külön H-lánc és L-lánc variábilis régió fágkönyvtárakat hoznak létre. A fágkönyvtárakat ezek után restrikciós enzimekkel emésztik és a H- és L-lánc fragmentumokat random kombinálják egy újabb fágkönyvtárban, amit kombinatórikus könyvtárnak neveznek. A kombinatórikus bakterifág klónok antigénkötő aktivitása az E. coli sejtlízisét követően tesztelhető, és a jó kötő aktivitást mutató klónok VH és VL régiókat tartalmazó szegmensei szekvenálhatók, illetve kivághatók és megfelelő expressziós plazmidba való inzertálást követően E. coliban egyidejűleg kifejeztethetők. Kombinatórikus variábilis régió könyvtárak M13 fágban is létrehozhatók, úgy, hogy fúziós fehérjét hozunk létre a vírus felületi fehérjéje, továbbá a linkerrel összekapcsolt variábilis régiók között. Az M13 fág termelődése után az antitest-antigén interakciók ’phage display’ eljárással ’screen’-elhetők. A variábilis régió könyvtárak diverzitása különféle random mutagenezis technikákkal tovább fokozható. A legújabb antitest tervezési tendenciák az egyláncú származékok irányába mutatnak, mikor a két variábilis régió (VH és VL) szakaszt egy linkerpeptid, vagy egy diszulfid híd tartja össze. Az egyláncú antitest móltömege (~27 kDa) jóval kisebb, mint az IgG molekuláé (~150 kDa), így terápiás (pl. tumorellenes) antitestek esetében jóval könnyebben eléri a célszövetet, és egyenletesebben is oszlik el benne. Génmérnöki munkával az egyláncú antitestekhez, további fehérje, pl. toxin fuzionáltatható.

Heterológ fehérje expressziós rendszerek

Escherichia coli

A gyógyszer-biotechnológiában felhasznált expressziós rendszerek közül az egyik leggyakrabban alkalmazott, különösen, mikor a biológiai aktivitás nem függ a fehérje glikozilezettségétől, a Gram negatív enterobaktérium, az E. coli. Az idegen DNS bevitelére a baktériumba több lehetőség van, beleértve a transzformációt (általában plazmidokkal történik, melyek számára a membránt időlegesen átjárhatóvá tehetjük hőstresszel Ca²⁺-ionok jelenlétében illetve elektroporációval), konjugációt, továbbá transzdukciót (bakteriofágokkal). A plazmidok rendelkeznek replikációs origóval, szelekciós marker gént (pl. β-laktámok, tetraciklinek ellen), indukálható promotert, opcionálisan integrázt, LacZ α-alegységet (’blue-white selection’ rendszerek), MCS-t (’multiple cloning site’), továbbá fúziós fehérje géneket (pl. zöld fluoreszkáló fehérjét - ’green fluorescence protein’, GFP) tartalmaznak. Az intronmentes, expresszálandó gének beépítése általánosan használt molekuláris genetikai eszközökkel történik. Az expressziós plazmidok sokszor erős, szabályozható promotereket (pl. pLac, pTrp, lpL), Shine-Dalgarno szekvenciát (a riboszóma kötődésének a biztosítására), továbbá a termék izolálását megkönnyítő „címke” (’tag’) szekvenciát (pl. ’His-tag’, ’Flag-tag’) tartalmaznak. A címke szekvenciák tisztítás után általában proteázzal, pl. szarvasmarha vékonybél enterokinázzal lehasíthatók. A szabályozható promoterek közül kiemelendő a hőszenzitív cI l-fág represszorral szabályozott pL promótert, mely 42 °C-on, a represszorfehérje inaktiválódása után kapcsol be. Egy másik érdekes szabályozási rendszer középpontjában a T7 fág RNS polimeráza van, ami pT7promótereket ismer fel, és aminek az expressziója lac promóter, azaz Lac represszor által szabályozott. Ipari szempontból érdekes az a kétplazmidos rendszer, ahol az expresszálni kívánt gén cI l-represszoros (pL promóterhez kötődik) szabályozás alatt áll, ugyanakkor a cI gén expressziója triptofán promóter (ptrp) által szabályozott (2. ábra). Azaz, ha a tápközegbe triptofánt adunk, a cI termelése megszűnik, ami beindítja a heterológ fehérje termelését.

2. ábra Kettős plazmid rendszer, ami a heterológ fehérje expresszióját a l fág cI represszorával szabályozza, aminek a kifejeződése a sejt triptofán koncentrációjától függ.

Az E. coliban történő fehérjetermelés egyik veszélyét a zárványok (’inclusion body’) kialakulása jelenti. A baktérium sejt citoplazmájának pH-ja, redoxpotenciálja, a termelődő chaperonok mások, mint az eukarióta endoplazmatikus retikulumban megfigyeltek, így a gyorsan képződő nagymennyiségű fehérje hidrofób régiói kölcsönhatásba léphetnek a helyes hajtogatódás (’folding’) előtt. Ezen a helyzeten javíthat (1) a promóter „gyengítése”, (2) a fermentáció hőmérsékletének a csökkentése, (3) eukarióta chaperonok ko-expressziója, (4) tioredoxin fúziós fehérjék expresszáltatása és (5) szekréciós szignálok használata (pl. Staphylococcus aureus protein A ’leader’ szekvencia, preferáltan „szivárgó” (’leaky’) mutánsokban).

Az E. coliban a heterológ fehérjetermelést akadályozhatja a baktérium eltérő kodonhasználati gyakorisága. A helyzet orvosolható, ha a baktérium szempontjából „ritka” kodonokat felismerő tRNS-eket túltermelő törzseket hozunk létre, vagy az expresszálni kívánt gént de novo újraszintetizáltatjuk a baktérium kodonhasználatát figyelembe véve. Az expresszált fehérje stabilitását nagyban növelheti, ha az N-terminális aminosavat L-metioninra, L-alaninra, vagy L-szerinre cseréljük le. Nagy gondot jelenthet a fermentáció során, ha a nagy volumenű fehérjetermelés miatt drasztikusan lecsökken a tápközeg oldott oxigén tenziója (’dissolved oxygen tension’; DOT) értéke, és a sejtek belépnek a stacioner növekedési fázisba. Ekkor általában nagy proteáz aktivitások termelődnek, amelyek a terméket teljesen degradálhatják. A proteázok eliminálása nem jó megoldás, mert ezek hiánya fontos élettani funkciókat hátrányosan érint, és ezért a mutánsok biomassza produkciója gyenge. Megoldást jelenthet pl. a Vitreoscilla obligát aerob mikróba potens O₂-kötéssel bíró hemoglobinjának az expressziója, de ekkor a mikróbának a hem szintézisére is képesnek kell lennie. A megfigyelések szerint a baktériumok biofilm képző képességének a limitációja szintén előnyösen befolyásolja a transzformációs rátát és a fehérje-kihozatalt.

Ipari termelési körülmények között jelentős gyakorlati problémát jelenthet a nagy metabolikus terhet jelentő plazmid elvesztése. Ez ellen eredményesen csak a baktérium kromoszómájába integrálódó és így azzal együtt replikálódó expressziós rendszerrel védekezhetünk. Ezt a homológ rekombináció jelenségének a felhasználásával érhetjük el, mellyel a bakteriális genom előre megtervezett helyére, vagy egy előzetesen beépített marker gén helyére inzertálhatjuk az expresszálni kívánt gént. Az integrálódás sikerét a bevitt marker gén (pl. antibiotikum rezisztencia) aktivitása jelzi. A marker gén eltávolítása fontos lehet akkor, ha a rekombináns baktérium kijuthat a környezetbe, pl. környezet-biotechnológiai alkalmazásra szánják. A marker gén ma már szelektíven eltávolítható, ha azt loxP szekvenciák közé helyezzük el. Ekkor egy egyébként hőérzékeny plazmidon lac-represszor/ izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) kontroll alatt álló Cre rekombinázt fejeztetünk ki, amely a marker gént kihasítja (30 °C-on), majd ezt követően a plazmidot a hőmérséklet 37 °C-ra történő emelésével inaktiváljuk.

A jövőben várható a szelekciós-ellenszelekciós markeres („selectable and counter-selectable markers”) rendszerek térnyerése is. Ebben az esetben két transzformációt hajtunk végre. Az első lépésben beépítjük a szelekciós-ellenszelekciós markeres kazettát a genom kiválasztott helyére (ezt egy megszokott szelekciós, pl. antibiotikum rezisztencia, markerrel ellenőrizzük), majd a második transzformációt követően ellenszelekcióval kiválaszthatjuk azokat a sejteket, melyekben az expresszálni kívánt gén beépült a szelekciós-ellenszelekciós markeres kazetta helyére. Több Gram-negatív baktérium, pl. az E. coli esetében lehet az ellenszelekciós marker a Bacillus subtilis SacB levánszukráz enzim, ami szukrózból leván polimert (fruktóz egységekből épül fel) állít elő. Ezen polimer felhalmozódása a periplazmikus térben toxikus az érzékeny baktériumokszámára, azaz a transzformásokat szukrózt tartalmazó tápközegre szélesztve csak a sikeresen transzformált sejtek szaporodása várható.

A szintetizált fehérje szekrécióját nemcsak szekréciós szignál alkalmazásával, hanem egy jól szekretálódó fehérjével való fuzionáltatással is biztosíthatjuk (pl. E. coli esetében ilyen a maltóz-kötő fehérje, illetve a sejtből kijutó YebF fehérje). Tekintve, hogy a baktérium szekretáló kapacitása véges, és a heterológ fehérje megnövelt szekréciója alapvető élettani folyamatokkal interferálhat, szükséges lehet a szekréció visszafogása, illetve a szekretáló rendszerek szűk keresztmetszetet jelentő komponenseinek a túltermeltetése. Az E. coli sejtmembránja a ’bacteriocin release factor’ expressziójával is átjárhatóvá tehető, ekkor ezt a heterológ fehérjével egyidejűleg kell expresszáltatni.

Élesztők

A gyógyszer-biotechnológiai úton előállított fehérjék egy része a biológiai aktivitásukhoz glikozilezést (O- és N-glikozilezést) igényel, ilyenek pl. az antitestek, véralvadási faktorok, interferonok és néhány hormon. A prokarióta szervezetekben a fehérjék glikozilezésére nincsen mód, ezért ezeket a termékeket eukarióta expressziós rendszerekben célszerű előállítani. Ebből a szempontból nagy gyakorlati jelentőséggel bírnak a különféle élesztő alapú rendszerek, melyekben ugyan az N-glikozidos oligoszacharid antennák központi szerkezete hasonló más eukariótákéra, pl. az emlősökére, ugyanakkor ezek processzingje igen nagymértékben eltér. Az egyébként igen elterjedt, és könnyen használható Saccharomyces cerevisiae expressziós rendszerek egyik nagy hátránya éppen az, hogy az N-glikozidokat hiperglikozilezi, nemegyszer ezekhez akár 50-150 mannóz egységet illeszt, döntően α-1,6- és erősen allergén α-1,3-típusú kötésekkel. Ezzel szemben más élesztők, pl. a Pichia pastoris metilotróf élesztő glikozilezettségi mintázata jóval kedvezőbb, hiszen a mannóz egységek közötti kapcsolat döntően α-1,2-típusú, ami emberben nem allergén. Fontos fejlemény, hogy már „humanizált” oligoszacharidok felépítésére képes P. pastoris törzsek is hozzáférhetők, pl. eritropoietin és antitest termelésére.

A S. cerevisiae transzformálását olyan hatékony „ingázó” (’shuttle’) vektorokkal végezhetjük el, melyek mind E. coliban, mind S. cerevisiaeben felszaporodnak (3. ábra). Integrálódó, replikálódó, episzomális és centromeres plazmidok, továbbá mesterséges kromoszómák állnak a rendelkezésünkre. Szelekciós markerek leucin, triptofán, uracil és hisztidin bioszintézis defektusokat komplementáló gének lehetnek a plazmidokon. Népszerű az élesztő saját 2-mm plazmidján alapuló expressziós rendszer, ami kb. 30 kópiában szaporodik fel sejtenként. A baktériumokhoz hasonlóan az élesztő plazmid alapú expressziós rendszerei is instabilak lehetnek, különösen nagy térfogatú fermentációs rendszerekben. Ebben az esetben is az integrálódó vektorok jelenthetik a megoldást. A kópiaszám könnyen növelhető, ha a plazmid (pl. Y1p) eleve nagy kópiaszámú génszekvenciákba, pl. rRNS gén (200 kópia), d retrotranszpozon gén (400 kópia), integrálódik.

3. ábra Az eukarióta fehérje-expressziós vektorok általános sémája.

Az élesztősejtek transzformálására számos hatékony eljárás áll a rendelkezésünkre, pl. protoplasztálás, majd együtt inkubálás a plazmid DNS-sel, Ca²⁺-ionokkal és polietlénglikollal. Alternatív lehetőséget jelentenek a Li⁺-ionokkal való inkubáció, továbbá az elektroporáció.

A termelni kívánt fehérje kihozatala szempontjából alapvetően fontos a megfelelő promoter régió kialakítása, amely gyakran TATA és UAS (’upstream activator sequence’; enhancer; emiatt az élesztő vektorok promoter régiója igen hosszú) szekvenciákat, továbbá alkohol dehidrogenáz (ADH) vagy trióz-foszfát dehidrogenáz (TDH) promoter szekvencia elemeket tartalmaz. Gyakorlati szempontból is fontosak a szabályozható promoterek, pl. GAL (galaktóz metabolizmus), ADH (alkohol dehidrogenáz), CUP-1 (rézzel indukálható metallothionein). A szintetizálódó mRNS stabilizálása érdekében az expresszálandó génhez terminációs szekvenciát (egy jól expresszálódó élesztő génból származót) illesztenek, ami a poliadenilálás szempontjából fontos. A fehérjetermék életidejét növelendő az N-terminális szekvenciát kicserélhetik egy lassan lebomló élesztő fehérje szekvenciájára, ami az ubiquitinálás és proteoszómás fehérjedegradálás elkerülése szempontjából fontos. Az élesztő esetében is gyakori az expesszálandó gének áttervezése az élesztő kodonhasználatának megfelelően a tRNS felhasználás optimalizálása érdekében. A fehérjék megfelelő szekrécióját szekréciós szignálokkal érik el, amihez az élesztő által szekretált enzimek szignál-szekvenciáit használják fel, ilyen pl. SUC2 (invertáz) és a PHO5 (savas foszfatáz) szekréciós szignál szekvencia, továbbá az MFα1 α-feromon gén szekréciós szekvenciája. A szekréciós szignálok levágását az S. cerevisiaeben KEX2 proteáz, KEX1 karboxipeptidáz és STE13 dipeptidáz végzik. Az elmúlt években az élesztő expressziós rendszerek fehérjeszekréciója jelentősen megnőtt, mára eléri a 0,02-2,0 g l⁻¹ értéket, különösen nagy sejtsűrűségű fermentációs rendszerekben.

Mint minden gombaalapú heterológ fehérje expressziós rendszerben, az élesztők esetében is limitálhatja a kihozatalt az endoplazmatikus retikulumban (ER-ben) kialakuló ’nem-hajtogatódott’ fehérje stresszválasz (’unfolded protein stress response’, UPR). Ez főképp az ER-ben lévő chaperonok, pl. BiP, PDI (protein diszulfid izomeráz), prolin-cisz-transz izomeráz korlátozott mennyiségére vezethető vissza, és ami a termelt protein túltermelését mind a transzkripció, mind a transzláció szintjén gátolja. Megoldást jelenthet pl. a kérdéses chaperonok túltermelése, illetve az UPR szabályozásának a génszintű módosítása. Mindezen problémák ellenére az élesztő alapú rendszerek megfelelő optimalizálás után kiválóan teljesítenek, pl. a P-28-1 hepatitis B felületi antigén esetében a kihozatal 20-40 %-a a teljes élesztőfehérje mennyiségnek.

A közelmúltban az érdeklődés fokozatosan a metilotróf élesztők, pl. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha,felé fordult. A P. pastoris esetébena kidolgozott fehérje expressziós rendszer alkohol oxidáz promotert tartalmaz (4. ábra), ami metanol hozzáadására indukálódik, a szekréciós szignálok lehetnek PHO1 foszfatáz és MFα1 a-feromon gén szekvenciák, továbbá integrálódó plazmidok (beépülés rRNS, AOX1, HIS4 génekbe) is hozzáférhetők. Szintén jelentős az Arxula adeninivorans alapú expressziós rendszer. Ez a gomba termotoleráns, 42 °C alatt élesztőként, e fölött pedig fonalas gombaként nő, továbbá 48 °C-ig jó növekedést mutat, e fölött pedig túlél egészen 55 °C-ig. Az A. adeninivorans esetében is kifejlesztésre került egy integrálódó plazmid, ami Trp auxotrófiát komplementál (ATRP1 gént hordoz), illetve TEF1 (’transcription enhancer factor’) promoterrel rendelkezik. A plazmid beépülési helye a 25S rRNS gén.

Fonalas gomba expressziós rendszerek

A fonalas gomba alapú heterológ fehérje expressziós rendszerek elterjedése várható, mert olcsó szénforráson gazdaságos tenyészthetők, a glikozilezési mintázatuk már közelebb van az emlősökéhez, mint az élesztőké, továbbá igen erős, jó kihozatalt biztosító promóterek és szekréciós szignál szekvenciák állnak a rendelkezésünkre. Az is fontos szempont, hogy ezen gombákat rutinszerűen alkalmazzák a fermentációs technológiában, azaz mind a morfológiai, mind a metabolikus sajátosságaik igen jól leírtak. Nevezetes expresszáló fajok és promoterek: Trichoderma reesei: cellobiohidroláz 1 (cbh1), Aspergillus niger: glükoamiláz A (glaA), Aspergillus nidulans: gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (gpdA). Szekretált fúziós proteinek termeltetési gyakori. A fonalas gombák transzformációja számos módszerrel lehetséges, pl. DNS felvétel protoplasztokkal, elektroporációval, a DNS bejuttatása a konídiumokba génpuskával, továbbá DNS bevitel Agrobacterium segítségével. Az integrálódó vektorok hatékonysága fonalas gombák esetében kisebb, de a ’nonhomologous-end-joining’ rendszer, ami Ku fehérjén és DNS ligáz IV – Xrcc4 enzimen alapul, alkalmas lineáris DNS fragmentumok random beépítésére.

Baculovirus – rovar sejt fehérje expressziós rendszer

A baculovirusok a rovarok tápcsatornáját fertőzik, és az infekciós ciklusuk végén összetapadt, polihedrin fehérje mátrixba csomagolt, fertőző vírusaggregátumok (polihedronok) alakulnak ki. A laboratóriumi/ipari gyakorlatban legfőképpen az ’Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus’ (AcMNPV) kerül felhasználásra, ami több mint 30 rovarfaj patogénje. Bár számos rovarsejtvonalon jól szaporodik, általában a Spodoptera frugiperda molylepke Sf21 és Sf9 sejtvonalait fertőzik vele.

A baculovirus expressziós rendszerek alapja a polihedrin promoterrel és gén terminációs szekvenciával ellátott, expresszálandó gén (expressziós kazetta) beinzertálása a vírus DNS-be a polihedrin gén helyére (5. ábra). A rekombináns vírus többféleképpen létrehozható. Az egyik protokoll szerint a rovarsejteket kotranszfektálják az AcMNPV vírussal és az E. coliban felszaporított, a génexpressziós kazettát tartalmazó plazmiddal. Ekkor a rekombináns vírusok a lítikus plakkok különleges megjelenése (nincsenek benne polihedronok) alapján jó eséllyel elkülöníthetők. Egy módosított eljárás szerint a kazetta egy baculovirus génpromoterrel ellátott lacZ (β-galaktozidázt kódol) gént is tartalmaz, ami révén a rekombináns vírust tartalmazó plakkok színe kékre vált, ha a tápközegbe β-galaktozidáz szubsztrátumot adunk. Mivel a rekombináció frekvenciája kicsi (<1 %), ezért ezt az AcMNPV vírus genom transzfekció előtti linerizációjával növelik meg (5. ábra). A linerizált vírust a polihedrin gén restrikciós endonukleázokkal történő kivágásával állítják elő, és a technika kihasználja azt a tényt, hogy a lineáris vírusforma virulenciája jóval kisebb a cirkuláris formájénál. Az expresszálni kívánt gént az expressziós kazettában ekkor a polihedrin géntől ’up-stream’ és ’down-stream’ elhelyezkedő DNS szekvenciák közé helyezik el, azaz a sikeres rekombinációt követően a heterológ gén beépülésével párhuzamosan visszaáll a baculovirus genom cirkuláris szerkezete, és így az infektivitása is (5. ábra). Ilyen körülmények között a plakkok kb. 99 %-a tartalmaz rekombináns vírust.

5. ábra Rekombináns baculovírus előállítása heterológ fehérjetermeléshez.

Ma már E. coli – rovarsejt baculovirus ingázó vektorok (’bacmid’) is vannak, melyek révén nincs szükség többé rovarsejtekre a rekombináns vírus előállításához, csak a heterológ fehérjetermeléshez. A bacmid előállítása két lépésben történik. Először E. coliban az AcMNPV vírus polihedrin génjét egy plazmiddal való rekombinációban kicserélik egy olyan DNS szakasszal, amelyben megtalálható a lacZ gén, benne egy tapadási hellyel (’attachment site’), egy kanamicin reziszencia gén és egy E. coli replikációs origó (oriE). Ettől kezdődően a rekombináns vírus E. colibanplazmidként felszaporítható. A második lépésben a tapadási helyre, egy segédplazmid által kifejezett transzpozíciós fehérjék segítségével, gentamicin rezisztencia gént és az expresszálni kívánt génkonstrukciót (polihedrin promoter – expresszálandó gén – polihedrin terminációs szekvencia) viszik be. Ezáltal a baktérium gentamicin rezisztenciára tesz szert, illetve nem mutat a továbbiakban β-galaktozidáz aktivitást, ami a szelekciót nagyban megkönnyíti. A rekombináns vírussal történik aztán a kívánt heterológ fehérje expressziója.

Ma már olyan expressziós rendszerek is elérhetők, melyekben a rovar sejtvonal emlős α-2,6-szialiltranszferázt fejez ki, míg a baculovirus az ugyancsak emlős β-1,4-galaktotranszferáz gént hordozza. Így a vírus felszaporodásakor a rendszer képes az emlős fehérjékre jellemző oligoszacharid oldalláncokat kialakítani.

Emlős sejt fehérje expressziós rendszerek

Ezen rendszerekben szintén E. coli - emlős sejt ’shuttle’ vektorokat használnak. Ezekben a vektorokban egy többszörös klónozó helyet (’multiple cloning site’, MCS) és egy szelekciós marker gént találunk, és mindkettőt eukarióta promoter, továbbá poliadenilációs és transzkripció terminációs szekvenciák fogják közre, melyek vírus, vagy emlős gén eredetűek. Ugyancsak megtalálhatjuk a prokarióta (E. coli) és eukarióta (pl. SV 40 vírus) replikációs origó szekvenciákat. A plazmidok bevitele emlős sejtekbe mikroinjektálással, kalcium-foszfát precipitációs eljárással illetve elektroporációval történhet.

Amennyiben rövidtávú génexpresszióban gondolkodunk, akkor általában afrikai zöldmajom vese (’African green monkey kidney’, COS), hörcsög vese (’baby hamster kidney’, BHK) vagy humán embrió vese (’human embryonic kidney’, HEK) sejtvonalak közül választhatunk. Ha pedig a célunk a hosszútávú, pl. ipari, fehérjetermelés, akkor a kínai hörcsög ovárium (’Chinese hamster ovary’, CHO) sejtek lehetnek a legalkalmasabbak. Az emlős sejtek szelekciós marker génjei igen sokfélék lehetnek, pl. blasticidin S deamináz, bleomicint kötő fehérje, továbbá higromicin B illteve neomicin foszfotranszferázok. Gyakorlati szempontból különösen értékes a MTX (metotrexát, DNS szintézis inhibitor) – dihidrofolát reduktáz rendszer, amelyben az inhibítor koncentrációjának a fokozatos növelésével elősegítjük a plazmid kópiaszám jelentős növekedését. A gyakran használt MSX (metionin-szulfoximin, glutamin szintézis inhibitor) – glutamin szintáz (GS) rendszer esetében szintén felszaporodik a GS génjét hordozó plazmid, de általában ezek száma maximum 10 körüli, ami a sejtek metabolizmusát még nem terheli túl jelentősen. Ezért érthető, hogy a nagy volumenű ipari alkalmazásokban előnyt élvez az MSX-GS szelekciós rendszer. Az emlős sejtkultúrák alkalmasak két alegységes fehérjék kifejezésére is, ilyenkor kétvektoros (a két vektorban a szelekciós marker gének eltérnek), két gént egyidejűleg expresszáló vektoros (egy eukarióta szelekciós marker gén van, de az expresszált gének promoterei és terminációs szekvenciái eltérőek) vagy biszcisztronos (a két gén átírását ugyanazon promoter szabályozza, de a gének közötti belső riboszóma belépési hely - ’internal ribosomal entry site’, IRES – a gének egyidejű transzlációját teszi lehetővé) rendszert használhatunk.

A gyógyszer-biotechnológiai termékek fermentációs technológiája – specifikus jellemzők

A heterológ expresszióra előállított rekombináns sejtek tenyészetéből célszerű sejtbankokat kialakítani a termelés biztonsága érdekében. Általában mester sejtbankot (’master cell bank’) és munka sejtbankot (’working cell bank’) hoznak létre a sejtvonalak tartós tárolására. A sejtbankok kialakításakor a transzformált/transzfektált sejteket kis térfogatú tárolóedényekbe (pl. ampullákba) szétosztják, majd ezeket megfelelő körülmények között (pl. cseppfolyós N₂-ben) tárolják. A sejtbankok megfelelő kialakítása és ezek biztonságos fenntartása a termék változatlan minőségben történő előállításának a kulcsa. A sejtbankok kialakítása fontos GMP (’Good Manufacturing Practice’) előírás (FDA előírás). A fehérjegyógyszer előállítása a tenyészteni kívánt sejtek sejtbankból való kivételével és elsődleges felszaporításával kezdődik, majd maga a fermentáció következik (’up-stream processing’).

A fehérjét expresszáló mikroorganizmusok fermentációjáról elmondható, hogy a használt fermentációs rendszerekkel kapcsolatban már gazdag tapasztalat áll a rendelkezésünkre, hiszen ezeket a mikróbákat már régóta használják különféle primer és szekunder metabolitok, továbbá enzimek előállítására. A heterológ fehérjetermelés esetén a tápközeg-összetétel tervezését számos tényező befolyásolja, beleértve a sejtek tápanyag-szükségletét a megfelelő biomassza és termékképzés érdekében (ezek az igények általában nem esnek egybe), a tápközeg-összetevők árát és azt, hogy vajon a termelt fehérje intracelluláris, vagy extracelluláris lesz-e. Az utóbbi esetben célszerű kerülni a komplex tápközegek alkalmazását. Az ipari fermentorokat és tápközegeket in situ sterilezik, ugyanakkor a hőlabilis összetevőket sterilre szűrés után juttatják a fermentorba. A fermentor megkívánt hőmérsékletét fűtő- és hűtőrendszerek, míg a tápközeg homogenitását megfelelő formájú és nagyságú keverők, továbbá terelőlemezek biztosítják. A korszerű fermentorokban számos paraméter ’on-line’ követésére nyílik lehetőség, ami magas szintű folyamatszabályozást tesz lehetővé.

A heterológ fehérjetermelés rekombináns mikróbákkal mindegyik fő fermentor típusban: kevert tartályreaktor, buborékkolonna, illetve ’air lift’ rendszerű hurokreaktor (mind belső, mind külső cirkulációjú; 6. ábra), kivitelezhető, bár jelenleg még a kevert tartályreaktor a leginkább elterjedt. Ugyanakkor meg kell jegyeznünk, hogy a buborékkolonnák és ’air lift’ fermentorok több előnyös tulajdonsággal is rendelkeznek a klasszikus kevert reaktorokkal összevetve, pl. a mechanikus kevertetés nagy energiaigénye itt nem jelentkezik, illetve általánosságban kisebbek a mikróbákat érő nyíróerők. Ez különösen fontos a fehérjetúltermelő mikroorganizmusok esetében, hiszen ezek, éppen a túltermelés miatt, vékonyabb, gyengébb sejtfallal bírnak. A nyíróerők által kiváltott stresszhez való folyamatos alkalmazkodás egyébként szintén gyengíti a heterológ fehérje kihozatalát, hiszen a stresszválasz-rendszer elemeinek a folyamatos aktiválása, pl. a sejtfelszíni poliszacharidok túltermelése, szintén igen energiaigényes, és ráadásul a sejtek megváltozott összetétele a termékkinyerést (’down-stream processing’) is negatívan befolyásolhatja. Az eddigi megfigyelések szerint az ’air lift’ fermentorok különösen jól teljesítenek nagysűrűségű és viszkózus mikroba tenyészetek esetében.

6. ábra Heterológ fehérjetermelésre alkalmas fermentor típusok.

A felhasznált mikroorganizmustól, illetve a termelt fehérjétől függően kell eldönteni a fermentor üzemeltetésének a módját, ami lehet ’batch’, ’fed-batch’ (rátáplálásos) vagy folyamatos. A folyamatos üzemmódnak számos előnye van, amit a jövő biomérnökei minden bizonnyal fokozottan figyelembe vesznek majd. Például, a folyamatos fermentációkban kisebb bioreaktor térfogatok elegendőek, a folyamatos fermentlé elvétel szintén csökkenti az azt feldolgozó (sejtszeparáló, sejtfeltáró, ’down-stream processing’; lásd ’Down-stream’ folyamatok) eszközök méretét, csökken a fermentor előkészítésére szánt állási idő, továbbá a folyamatos működés esetén a sejtek élettani állapota hasonló, ami a termék kihozatalát stabilizálja. Ugyanakkor a megnövekedett fermentációs idő elősegítheti a plazmidjukat elveszített (és ezért gyorsabban szaporodó) sejtek felszaporodását, továbbá megnöveli a rendszer fertőződésének a veszélyét is.

A fermentációs folyamatok hatékonysága a tenyészetek sejtsűrűségének a növelésével is fokozható (50-150 g száraz sejttömeg literenként; ’high-density’ kultúrák). Ezt az E. coli esetében az acetát termelés visszaszorításával (glükóz szénforrás helyett glicerint használnak), az O₂-ellátás intenzifikálásával (a levegő beinjektálás és a kevertetés fokozása, tiszta oxigén bevezetése, a gáznyomás fokozása, Vitreoscilla hemoglobin kifejeztetése), illetve exponenciálisan növekvő szénforrás-koncentráció mellett kivitelezett ’fed-batch’ tenyésztéssel lehetséges.

Mivel a legtöbb heterológ fehérjetermelés indukálható, ezért igen általánosak a kétfokozatú (első fokozat – biomassza termelés, második fokozat – heterológ fehérjetermelés) fermentációs rendszerek. Ezek lehetnek kétfermentorosak, pl. ha a génkifejeződés hőstresszhez köthető, akkor az első fermentorban zajlik 30 °C-on a tenyészet szaporítása, míg a másodikban 42 °C-on a fehérje termeltetése. Ha a fehérje kifejeződése valamilyen indukáló ágens hozzáadásakor, vagy egy esszenciális összetevő, pl. aminosav, elfogyásakor indul meg, akkor a folyamat egy fermentorban is jó hatékonysággal kivitelezhető. A fehérje termelési fázis ’fed-batch’ üzemmóddal jelentősen meghosszabbítható, ami a kihozatal szignifikáns, akár nagyságrendi növekedését is eredményezheti.

A rovar-, illetve emlős sejtek fermentációi általában drágábbak, továbbá technológiai szempontból bonyolultabbak, mint a mikróbáké. A tápközegek ezekben a rendszerekben igen komplexek, a fermentáció időigényesebb (a sejtek generációs ideje lassú), ráadásul a sejtek, sejtfal hiányában, sérülékenyek (pl. a buborékhatásokkal szemben). Az állati sejtes fermentációkban használt tápközegek általában a megfelelő ozmotikus és pH viszonyokat biztosító sókat, glükózt, aminosavakat, vitaminokat, növekedési faktorokat, illetve, igény szerint, állati vérszérumot (növekedési faktorok, nyomelemek, lipidek) tartalmaznak. Általános a glutamin a többi aminosavnál lényegesen nagyobb koncentrációban történő adagolása, hiszen a glutamin nemcsak fontos aminosav, hanem nitrogén- és energiaforrás is. Említést érdemel, hogy a rovar sejtvonalak glutamin igénye nagyságrendileg kisebb, mint az emlős sejteké.

A fermentorok megfelelő kiválasztása szintén fontos tényező, beleértve a keverők alakját (sokszor megfelelő a lekerekített szélű, hajócsavar alakú, úgynevezett ’marine’ típusú keverő) és a reaktor felépítését. Például használják a kevert edényes (’spinning flask’), forgó palackos (’rolling bottle’), üregesszálas (’hollow fibre’) továbbá a „klasszikus” kevert tartályreaktorokat és levegőztetett (’air lift’) fermentorokat is (6. ábra). Amennyiben a sejtek a növekedésükhöz nem igényelnek felületet, pl. az immortális folyamatos sejtvonalak esetében, mindezeket a fermentorokat jó hatásfokkal lehet alkalmazni. Nem-folyamatos sejtvonalak esetén a sejteknek szilárd felület igényük van, gyakran egysejtrétegben (’monolayer’) nőnek, a sejtek között kontakt növekedésgátlás lép fel. A sejtek ráadásul nem korlátlanul és az immortális sejtvonalakhoz képest lassabban osztódnak, végül kisebb sejtsűrűséget produkálnak, és az általuk igényelt tápközeg nagyobb komplexitású, következésképpen drágább. A nem-folyamatos sejtvonalak fermentációját nagyban elősegíti a mikrokarrierek (átmérő 100 mm - 2 mm) alkalmazása, melyek a vízhez közeli sűrűségük miatt lebegtethetők és leggyakrabban kollagén, dextrán vagy műanyag alapúak. Mivel a karrierek külső felületéről a letapadt sejtek könnyen leválhatnak, így fontos a megfelelő makropórusos belső szerkezet kialakítása.

Az állati sejtes fermentációk indításához sejtszuszpenziók szükségesek. Ha a sejtvonal sejtszuszpenzióban szaporítható, akkor az esetleges, felülethez való letapadásuk gyenge agitációval megszüntethető. Ha a sejtvonal a növekedéséhez szilárd felületet igényel (pl. a sejttenyésztő edények fala), akkor belőle sejtszuszpenzió, pl. a fermentáció indításához, tripszines emésztéssel állítható elő. Amennyiben a sejtvonalat napokig fenn kell tartani, akkor ez általában friss tápközegbe történő passzálással biztosítható, de a nem immortális, úgynevezett primer sejtkultúrák esetében erre csak korlátozott számban van lehetőség a sejtvonal öregedése miatt.

A fermentációk indítása 20 % (v/v) inokulummal történik (a kiindulási sejtkoncentráció függ a sejtvonaltól, de 4x10⁵ sejt ml⁻¹ tipikusnak mondható), a fermentáció hőmérséklete emlős sejtekre 36-38, rovarsejtekre 25-30 °C közötti, a pH pedig emlős sejtekre 6,7-7,9, rovarsejtekre pedig 6,0-6,4 közötti érték. Egy átlagos emlős sejtes ’batch’ fermentáció legalább öt napig tart, és a legmagasabb sejtszám körülbelül 5x10⁶ sejt ml⁻¹. Szakaszos vagy folyamatos rátáplálásos (’pulsed-batch’, ’fed-batch’) technológiák esetén az elérhető sejtsűrűség értéke magasabb, kb. 10⁷ sejt ml⁻¹, ami folyamatos perfúziós technológiák (a fermentációs tápközeg elvétele friss tápközeg adagolása mellett, a sejtek visszatartásával) esetében elérheti akár a 3x10⁷ sejt ml⁻¹ értéket is. A rovarsejtes fermentációk kétfázisosak, az első fázisban a sejteket felszaporítják (2-4x10⁵ ® 2-3x10⁶ sejt ml⁻¹), majd a középső illetve kései exponenciális növekedési fázisban lévő sejteket rekombináns vírussal (0,05-10 pfu sejt⁻¹, pfu=’plaque-forming unit’, ipari fermentációknál tipikusan 5-10 pfu sejt⁻¹ a fermentáció idejét csökkentendő) fertőzik. A fehérjetermelés a kései kifejeződésű polihedrin promoterhez kapcsolt, és ezért a maximális fehérjekihozatal 2-3 nap múlva várható a fertőzést követően.

Az állati sejtek O₂-igénye a mikróbákhoz viszonyítva kisebb, 1x10⁻¹⁷ – 1x10⁻¹⁶ mol s⁻¹ sejt⁻¹ (a szükséges levegőtelítettség emlőssejtekre 5-100 %, rovarsejtek esetében 40-60 %), a baculovirussal fertőzött rovarsejtek O₂-igénye viszont jelentősen megnő (körülbelül megkétszereződik) a meginduló bioszintetikus folyamatok miatt. Említést érdemel, hogy az emlős sejtek jelentős mennyiségben halmoznak fel tejsavat, míg a rovarsejtekre ez nem jellemző.

Bár az állati sejtek mechanikai stresszre érzékenyek, de ez megfelelő szerkezetű fermentor kiválasztásával (pl. hajócsavar típusú keverőt használnak kis fordulatszámmal, illetve nincsenek terelő lemezek) minimalizálható. A sejtek mechanikai sérüléséért inkább a légbuborékok szétpukkanása felelős, ami felületaktív anyagokkal (pl. Pluronic F68, a sejt-buborék tapadást akadályozza) minimalizálható. Az állati sejtek érzékenyek a CO₂ halmozódására (ipari fermentorokban már 14 %-os CO₂ telítettségnél), ezért a levegőztetés intenzitását ebből a szempontból is szabályozni szükséges.

A gyógyszer-biotechnológiai termékek módosítása

Ma a gyógyszerfejlesztőket egyre gyakrabban keresik meg egy adott fehérje gyógyszer farmakokinetikai profiljának a megváltoztatására vonatkozó igényekkel. Például, ha egy termék féléletidejét sikerül megnövelnünk a keringésben, akkor ezáltal csökkenthető az alkalmazás gyakorisága, ami javíthatja a beteg együttműködését, életminőségét és csökkentheti a lehetséges komplikációkat is. Ezeket a célokat leggyakrabban a fehérje szerkezetének a módosításával érhetjük el, ami kiterjedhet az aminosav-sorrend megváltoztatására („protein engineering”), a poszttranszlációs módosítások megváltoztatására (pl. glikozilezés), továbbá a fehérje kémiai módosítása (pl. PEGiláció) is. Ezek a szerkezeti változások nemcsak a szérum felezési időt befolyásolhatják, hanem a termék adszorpciójára (gyorsabban, vagy lassabban ható termékek, pl. inzulin származékok) és a gyógyszer szöveti eloszlására is hatással lehetnek.

A gyógyszer-biotechnológiában jelenleg használt fehérje expressziós rendszerek – előnyök és hátrányok

Az USA-ban és Európában jóváhagyott gyógyszer-biotechnológiai termékek teljes listáját az alábbi web oldalon találhatjuk meg: http://www.nature.com/nbt/journal/v28/n9/fig_tab/nbt0910-917_T1.html.

Ma a következő humán fehérjéket állítják elő E. coli baktériumban: humán növekedési hormon (szomatotropin, hGH), inzulin, tPA, IFN-a, IFN-γ. Az E. coli széles körben használt, genetikailag könnyen manipulálható prokarióta szervezet, amelynek a fermentációs technológiája is jól kidolgozott. Ugyanakkor az expresszált fehérje gyakran a sejten belül halmozódik fel, sőt aggregálódhat, az eukariótákra jellemző poszttranszlációs módosítások nem mennek végbe, továbbá a baktérium lipopoliszacharid (LPS) tartalma szennyezőként jelentkezhet. Ezekben a technológiai folyamatokban igen fontos a pirogén (lázkeltő) hatású bakteriális eredetű LPS koncentrációjának a mérése, illetve eltávolítása.

Élesztő (S. cerevisiae) alapú rendszerekben termelnek például inzulint, szomatotropint, vérlemezke eredetű növekedési faktort („platelet derived growth factor”, PDGF), hepatitis B felületi antigént (rHBsAg), urát oxidázt és hirudint. Az E. coli baktériumhoz hasonlóan a S. cerevisiae sarjadzó élesztő is könnyen felhasználható heterológ fehérje termelésre, a fermentációs technológiája szintén jól kidolgozott, GRAS („Generally Recognized As Safe”, FDA besorolás) szervezet, továbbá alkalmas a poszttranszlációs módosítások egy részének a kivitelezésére is. Ugyanakkor ezek a módosítások, pl. a glikozilezési mintázatok, gyakran jelentősen eltérnek az ember esetében megfigyeltektől, és a fehérje kihozatalok általában alatta maradnak az E. coliban megfigyelteknek.

Az emlős sejtes expressziós rendszerekben (CHO, BHK) előállított termékek között szerepelnek például a FSH (tüszőérést serkentő hormon), a sárgatest képződést kiváltó hormon (LH), IFN-b, EPO, glükocerebrozidáz és a véralvadási faktor VIIa. Ezek a rendszerek az emberhez igen hasonló poszttranszlációs módosításokat hajtanak végre, ugyanakkor a sejtek komplex, drága tápközeget igényelnek, továbbá stresszérzékenyek.

A jövő lehetőségei között szerepel a tejelválasztáshoz kapcsolt fehérjetermelés genetikailag módosított emlősállatokban tejsavó fehérje, b-kazein, továbbá a- és b-laktalbumin fehérje promóterek felhasználásával. Ezen technológia előnye az állattartás és a fehérje tejből való kinyerésének az olcsósága, hátrányai között szerepel sok esetben az emlősök genetikai módosításának a rossz hatásfoka, továbbá a kis fehérje kihozatal. A jövőben az ipar szempontjából is releváns lehet a fehérje expresszió tojásfehérjében ovalbumin promóterrel.

Ígéretes lehet heterológ fehérje expresszió transzgénikus növényekben is. Mind sejtmagi (Agrobacterium tumefaciens és Agrobacterium rhizogenes Ti-plazmidok révén), mind kloroplasztisz transzformáció lehetséges, továbbá a fehérjetermelés bizonyos növényi szervekre, vagy a magokra korlátozható. Az előnyök között szerepel a növények alacsony termesztési költsége, a könnyű léptéknövelés, tovább az, hogy a növényi sejtek állati vírusoktól mentesek. Hátrányt jelenthet a változó kihozatal, aminek oka lehet poszttranszkripciós géncsendesítés (az mRNS degradálása), növényi anyagcseretermékek, pl. szekunder metabolitok, megjelenése a termékben, a termelés szezonális jellege, valamint az expresszálni kívánt gén esetleges szóródása a természetben. Bíztató kísérletek vannak a fogszuvasodás korlátozására növényben előállított Streptococcus mutans elleni antitesttel.

A jövőben várható a rovarsejtes baculovirus alapú expressziós rendszerek fokozottabb elterjedése az iparban. Jelenleg ezzel a rendszerrel például papillomavirus antigéneket állítanak elő. Ez a rendszer előnyös, mert a fehérje kihozatal kiváló, a sejttenyészet növekedése gyorsabb, mint az emlős sejteké és az emberi vírusok rovar sejtvonalakat általában nem fertőznek. Ugyanakkor az extracelluláris fehérjetermelés általában nem megoldott, és a poszttranszlációs módosítások is jelentősen eltérhetnek az emberétől. Lehetséges jövőbeli alternatív technológia az élő rovarok (pl. selyemhernyók) fertőzése rekombináns vírusokkal, majd a kívánt termék kinyerése az elpusztult állatokból.

Forrásmunkák

Glick, B.R. and Pasternak, J.J. (2003) Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, oldalak: 121-189.

Hewitt, C.J., Isailovic, B., Mukwena, N.T., Nienow, A.W. (2006) Insect and mammalian cell culture. Basic Biotechnology (Szerkesztők: Ratledge, C. és Kristiansen, B.), Cambridge University Press, Cambridge, oldalak: 523-547.

Walsh, G. (2007) Pharmaceutical Biotechnology. Concepts and Applications, John Wiley & Sons Ltd., Chichester

Önellenőrzés 1

2. fejezet - ’Up-stream’ és ’down-stream’ folyamatok (Prof. Dr. Pócsi István)

A fermentációs technológiák lényegében két részre bonthatók: ’up-stream’ és ’down-stream’ folyamatokra. Az első rész (’up-stream’) a fermentációhoz felhasznált sejtek szaporítását és a termékképzést foglalja magába, míg a második rész (’down-stream’) a képződött termék kinyerésére, tisztítására és formulázására terjed ki.

’Up-stream’ folyamatok

Ez a fázis a termelő sejtek sejtbankokból való kivételét, a fermentációs inokulum(ok) elkészítését, valamint magát a fermentorban (bioreaktorban) való termékképzést foglalja magába. A termék kihozatalát (és így a technológiai folyamat nyereségességét) alapvetően befolyásolja az ’up-stream’ folyamatok kellő optimalizáltsága, továbbá megfelelő kontrollja. A sejtbankok kialakításakor a sikeresen létrehozott (fuzionált, nemesített, klasszikus és molekuláris genetikai eszközökkel kialakított) sejteket kis térfogatba, tárolóedényekbe, pl. ampullákba tesszük, majd azt sejttípustól függően liofilizáljuk, cseppfolyós N₂-ben lefagyasztjuk, vagy glicerines oldatban mélyhűtve tároljuk. Ez a mester sejtbank (’master cell bank’), melyből igény szerint munka-sejtbankot (’working cell bank’) hozunk létre, aminek felhasználásával indíthatjuk az ipari termelési folyamat számára pl. az inokulumok előállítását. A sejtbankok megfelelő kialakítása és fenntartása a termék változatlan minőségben történő előállításának a kulcsa.

A termék megfelelő kihozatalát a megfelelően optimalizált biotechnológiai eljárás (tápanyagok, fermentációs paraméterek) pontos alkalmazása biztosítja. A korszerű fermentorok igen magas szintű, automatizált folyamatszabályzást tesznek lehetővé. Ennek alapját az egyes alapvető paraméterek (pH, O₂, hőmérséklet, egyes tápanyagok és termékek koncentrációja, stb.) folyamatos ’on-line’ követése képezi. A korszerű fermentációs rendszerek működtetésére vonatkozóan igen nagy mennyiségű tapasztalat és tudás halmozódott fel az egyszerűbb mikrobiális metabolitok és enzimek előállításakor. Ezek a tapasztalatok gyakran hasznosíthatók pl. a mikrobiális heterológ fehérje termelő rendszerek alkalmazásakor.

A fermentáció eredményessége szempontjából fontos a megfelelő tápközeg kiválasztása. Ennek során a következőkre kell figyelemmel lennünk: (1) a sejtvonal optimális tápanyag-szükséglete a megfelelő biomassza és termékképzés érdekében (ezek a szükségletek mások és mások lehetnek az egyes részfolyamatokra nézve), (2) a termék extracelluláris vagy intracelluláris lokalizációja (az előbbi esetben a komplex tápközeg lehetőség szerint kerülendő) és (3) a tápközeg költsége. Szintén kiemelkedő jelentőségű a fermentor üzemeltetésének a módja, azaz annak az eldöntése, hogy ’batch’, ’fed-batch’ (szakaszos rátáplálásos) vagy folyamatos fermentációs technológiát alkalmazzunk-e. Az ipari fermentorokat és a tápközegeket in situ sterilezik, ugyanakkor a hőlabilis összetevőket sterilre szűrés után juttatják a fermentorba. A fermentor állandó hőmérsékletét komplex fűtő- és hűtőrendszerek, míg a tápközeg állandó homogenitását megfelelő keverők és terelő lemezek biztosítják.

Tekintettel a tárgyalt technológiai folyamatok sokszínűségére az aktuális ’up-stream’ folyamatokat az egyes terméktípusok előállításakor részletesebben tárgyaljuk.

’Down-stream’ folyamatok

Egy sikeres fermentációs technológia önmagában nem jelenti azt, hogy a biotechnológiai termék végül rentábilis lesz, mert annak költségét igen nagymértékben befolyásolja a termék kinyerésének, illetve tisztításának a költsége. Ez pedig nagyban függ attól, hogy a termékkel szemben milyen elvárások vannak, illetve milyen felhasználásra szánják őket, pl. más a költsége egy mosószerkomponens, vagy egy biomedicinális felhasználásra kerülő enzimnek. A fermentációt követően a tiszta termékig a következő főbb lépéseken keresztül juthatunk el:

(1)   a sejtek elválasztása,

(2)   a sejtek feltárása, amennyiben a termék intracelluláris,

(3)   a sejttörmelékek eltávolítása,

(4)   a sejtmentes fermentlé, sejtextraktum koncentrálása,

(5)   a termék tisztítása,

(6)   ultratisztítása,

(7)   a végtermék kialakítása és formulázása.

A sejtek elválasztása

Ebben a lépésben a sejteket szűréssel vagy centrifugálással eltávolítják a fermentléből. A szűrésnek két típusa van. Az egyik a hagyományos, ’dead-end’ szűrés, mikor a fermentlevet a szűrő felületére merőlegesen áramoltatjuk, és a szűrés vagy a kiszűrt anyagból kialakuló szűrőlepényen, vagy a szűrő felületére felvitt, segédanyagból előzetesen létrehozott szűrőrétegen valósul meg. A másik megközelítés az, mikor a fermentlevet a szűrő felületére nézve érintőlegesen („tangencionálisan”, ’cross flow’) áramoltatjuk nyomás alatt, ekkor a szűrő felületén lepény nem alakul ki. A második esetben a szűrő pórusméretén múlik, hogy egy anyag a szűrletbe kerül-e, vagy visszamarad fermentlében. Az első megközelítés szerint működik a keretes szűrőprés (7. ábra), mikor megfelelő nyomással a fermentlevet keretekre kifeszített szűrőfelületen, pl. vásznon, áramoltatjuk át. Ebben az esetben a kialakuló szűrőlepény eltávolítása megfelelő időközönként szükséges. Alapvetően hasonló elven működik a vákuum dobszűrő (7. ábra), ám ekkor a tároló edényből a fermentlét a dob belsejében lévő vákuum szívja át a szűrőfelületen. Megfelelő mosás és szárítás után a kialakult szűrőlepény különböző eljárásokkal, pl. késes kaparóval leválasztható. Tangencionális folyadékáramoltatást alkalmaznak a mikroszűréskor (7. ábra), mikor a fermentlevet 0,1-1,0 μm pórusméretű membránon áramoltatják át, ami a sejteket visszatartja. Ez a szűrési technika is megfelelő nyomást igényel, hiszen magának a szűrőfelületnek nagy az ellenállása. Az ultraszűrés elvéből is adódóan maga az eljárás sterilre szűrésre is alkalmas.

7. ábra A sejtek leválasztására az iparban alkalmazott szűrő eszközök.

A centrifugálás esetén a víznél nagyobb sűrűségű partikulumok a centrifugális erő hatására ülepednek. Az ipari relevanciával bíró eszközök közül említést érdemel a csőcentrifuga és a lemezes centrifuga (8. ábra). A csőcentrifuga esetében a fermentlé egy forgó hengeren halad át egyenletes sebességgel, miközben az ülepedő részecskékre egyre növekvő centrifugális erő hat. Egy másik elrendezésben az ülepedés sebességét a centrifugatérbe elhelyezett kúp alakú lemezekkel gyorsítják, melyek a lemez vastagságával körülbelül egyező távolságban követik egymást. Ilyen elrendezés mellett a sejtek gyorsan kiülepednek a lemezekre, majd onnan a centrifuga gyűjtőrészébe csúsznak.

8. ábra Iparban használt lemezes centrifuga működése.

A sejtek feltárása

Bár technológiai szempontból egyértelműen az a kedvező, mikor a fermentációs termék a tápközegbe kerül, erre nincs mindig lehetőség, illetve lehetséges az is, hogy maga a termék a csak a sejten belül stabil, így éppen a kijutása csökkentené a kihozatalt. A sejtfeltáró módszereknek alapvetően két típusa van, az egyik a mechanikai, a másik a nem mechanikai jellegű. A nem mechanikai eljárások alapvető típusai a szárítás (liofilezés, szerves oldószeres szárítás), az ozmotikus sokk (a közeg ozmolalitásának a hirtelen változása a sejtek líziséhez vezet), hősokk továbbá kemolízis (a sejtek diszrupcióját oldószerekkel, felületaktív anyagokkal, antibiotikumokkal vagy sejtfaloldó enzimekkel érjük el). Ezek gyakran megfelelő eljárások kisebb sejttömegek hatékony feltárására, de ipari méretekben inkább a mechanikai feltáró eszközök, pl. gyöngymalom és nagynyomású homogenizátorok (9. ábra), használatosak. Az ultrahangos kezelések szintén a mechanikai eljárások egyik fontos csoportját alkotják, de általában ez túl drága ipari körülmények között. A gyöngymalom (9. ábra) esetében a sejtek hatékony feltárását a gyöngyök között fellépő igen nagy nyíróerők biztosítják. A gyöngyöket (átmérő < 1 mm) egy horizontális elhelyezésű kamrába teszik, és egy közös tengelyre erősített tárcsasorral folyamatosan keverik. A feltárás hatékonysága függ a keverés intenzitásától, ami viszont jelentős hőt termel. Mivel számos termék, pl. a fehérjék, hőlabilisak, ezért az eszközt folyamatosan hűteni kell. Az iparban sejtfeltárásra leggyakrabban használt eszközök a nagynyomású homogenizátorok (9. ábra), melyek a sejteket tartalmazó szuszpenziót általában 40-100 MPa nyomáson egy homogenizáló szelepen áramoltatják át. A sejtek annak következtében dezintegrálódnak, hogy a szelepen való áthaladáskor a nagy nyomásesés következtében nagy sebességre gyorsulnak fel és ütköznek is a szelep falával. A nyomásesés és az ütközések jelentős nyíróerőt, örvényeket generálnak mind a sejten kívül, mind azon belül, melyeknek a sejtfal nem tud ellenállni.

9. ábra Ipari sejtfeltáró eszközök.

A sejttörmelék eltávolítása

A sejttörmelék eltávolítása a sejtek szeparálásához hasonló módszerekkel (szűrés, centrifugálás) történik. A további feldolgozás előtt szükség lehet a közeg viszkozitását nagymértékben növelő nukleinsavak eltávolítására, amely polietilénimines kicsapással, vagy nukleázos emésztéssel érhető el. Heterológ fehérjetermeléskor a termelő szervezetben fehérjezárványok kialakulása lehetséges. A sejtfeltárást követően lehetőség van a zárványok elkülönítésére pl. centrifugálással, majd ezt követi a fehérjék szolubilizálása kaotróp ágensekkel (tipikusan 8 mol l⁻¹ karbamid vagy 6 mol l⁻¹ guanin-hidroklorid plusz ditiotreitol). A fehérjeoldatot ezt követően hígítják, majd a megfelelő hajtogatódást (’folding’) oxidált és redukált kénvegyület-párokat (pl. glutation-diszulfid – glutation, cisztin – cisztein, β-merkapto-etanol oxidált és redukált formája) tartalmazó redox-pufferrel biztosítják. Ha a sejtek, sejttörmelékek centrifugálása a nagy oldatviszkozitás miatt nem gazdaságos, akkor lehetséges a termék szeparálása a fehérje-szolubilizáció után is, pl. vizes kétfázisú extrakcióval (lásd A sejtmentes fermentlé).

A sejtmentes fermentlé, sejtextraktum koncentrálása

A leggyakrabban alkalmazott módszerek a bepárlás, kicsapás és ultraszűrés.

A bepárlás a biotechnológiában relatíve ritkábban használt művelet, de a filmbepárlók (10. ábra) számításba jöhetnek, ha a termék megfelelő hőstabilitással bír. Az eljárás lényege, hogy a töményíteni kívánt folyadék kívülről gőzzel fűtött csövekben, nagy felületen, vékony rétegben folyik le, miközben az oldott anyagok koncentrációja folyamatosan növekszik. A képződő párát vizes hűtés mellett egy szeparált kondenzáló egységben lecsapják. A filmbepárlók jól használhatók nagy viszkozitású és habzó termékek koncentrálására.

10. ábra A filmbepárló berendezés működési elve.

A kicsapást a ’down-stream processing’ számos pontján alkalmazhatjuk, és a vízelvonás mellett a termék tisztulását is eredményezheti. Gyakran alkalmazzák például a kromatográfiás tisztítás (lásd A termék ultratisztítása) előtt a tisztítandó anyagok, pl. fehérjék, töményítésére. A kicsapást az oldószer polaritásának (sók, szerves oldószerek hozzáadása) vagy hőmérsékletének a megváltoztatásával érhetjük el. A fehérjék esetében a kisózás (pl. ammónium-szulfáttal) a legkíméletesebb és leghatékonyabb, mert kevésbé denaturál, szobahőmérsékleten is végrehajtható és a termék frakcionálására is alkalmas. A szerves oldószeres kicsapáskor a közeg hűtése szükséges elkerülendő a fehérjék gyors denaturálódását. Minden kicsapási műveletet célszerű a tisztítandó biopolimerek izoelektromos pontján végrehajtani.

Az ultraszűrés elviekben hasonló a mikroszűréshez (7. ábra), de ebben az esetben az ultraszűrő membrán pórusmérete általában lényegesen kisebb, ~1-20 nm, ami a fehérjék visszatartását jelenti, miközben a kis molekulájú anyagok, pl. pigmentek, metabolitok, sók átjutnak a szűrletbe. Az ultraszűrő membrán alapanyaga lehet cellulóz-acetát, cellulóz-nitrát, PVC vagy polikarbonát. A szűrőfelületet általában kis átmérőjű (1-5 mm), ugyanakkor nagy fajlagos felületű csövek belső felszínén képezik ki (üregesszál), és a csőkötegeket ultraszűrő modulokban helyezik el. Az ultraszűrők mind a fehérjeoldatok töményítésére, mind az oldott kis molekulájú anyagok kimosására kiválóan alkalmasak.

A termék tisztítása

A nagy tömegben gyártott termékek tisztításának alapvető módszerei, a folyadék-folyadék extrakció, az adszorpció és a kristályosítás. Mindegyik eljárásban a terméket szelektíven új fázisba (értelemszerűen egy új folyadék, vagy szilárd fázisba) visszük, ami a termék tisztaságát nagymértékben megnöveli.

A folyadék-folyadék extrakciót gyakran használják kis molekulatömegű biotechnológiai termékek, pl. karbonsavak, aminosavak, antibiotikumok (pl. β-laktámok, tetraciklinek), vitaminok, élelmiszer adalékok, alkaloidok (pl. kodein, taxol) továbbá szteroidok (pl. prednizolon) tisztítására, de a gyógyszer-biotechnológiai alkalmazásra is találunk példákat (inzulin, interferonok). Míg az egyszerűbb molekulákat általában szerves oldószeres fázisba viszik, addig a fehérjék tisztításánál vizes, kétfázisú extrakciókat lehet alkalmazni. A szerves oldószeres extrakció lényege, hogy az apoláros termék oldékonysága lényegesen nagyobb a vízzel nem elegyedő szerves fázisban, azaz intenzív agitációt, diszpergálást (rázatást, kevertetést) követően a fázisok szétválásakor a termék a szerves fázisban dúsul fel. A fázisok szétválását centrifugálással gyorsíthatjuk (szeparátorok). A szerves fázisok térfogata általában lényegesen kisebb, mint a fermentléé, ezért ez a lépés a termék jelentős töményedését is eredményezi, azaz fontos koncentráló művelet is. Az extrakció alkalmazására klasszikus példa a penicillin kinyerése, mikor a hűtött fermentlé kis térfogatait kevert tartályban savanyítják és egyidejűleg amilacetáttal extrahálják, majd az extraktumot azonnal szeparátor centrifugában elválasztják. A műveletben a savanyítás révén egyrészt megnő a penicillin oldékonysága a szerves fázisban, ugyanakkor kémiailag instabillá válik a vizes fázisban. A vizes kétfázisú extrakciókban a vizes oldat polaritását két anyag egyidejű hozzáadásával növelik (pl. sók) illetve csökkentik (pl. polietilén-glikol). Ekkor a vizes oldat agitálását követően két vizes fázis válik el, melyek között a biomolekulák, pl. fehérjék, a megoszlási hányadosuknak megfelelően válnak szét. Lehetséges két fázis kialakítása két polimer (pl. polietilén-glikol és dextrán) hozzáadásával is.

Az extrakcióval ellentétben az adszorpció a terméket szilárd fázisba viszi át, ami szintén a termék tisztulását és koncentrálódását eredményezi. Az adszorpció felületen történő szelektív ugyanakkor reverzibilis megkötést jelent, amit függ a rendelkezésre álló felület nagyságától. A terméket megköthetjük pl. természetes (pl. zeolitok), vagy szintetikus (pl. polisztirol alapú) ioncserélőkön, szintetikus gyantákon (döntően apoláros kötődés), továbbá elterjedt a szennyezők megkötése aktív szénnel. Az extrakcióhoz hasonlóan az adszorpció is végrehajtható kevert tartályban, illetve oszlopon is.

A kristályosítás lényege, hogy a termék oldékonysága egy adott oldószerben véges, és ha az oldat koncentrálásával (pl. bepárlás) vagy hűtésével a termékre nézve az oldat túltelítetté válik, akkor megindul annak a leválása kristályok formájában. A kicsapással ellentétben a kristályosítás segédanyagot nem igényel. Már a kristályképzés mechanizmusa garantálja, hogy ebben a műveletben igen tiszta termékre számíthatunk (szennyezők esetleg zárványokban, vagy a kristály felületén fordulhatnak elő), ráadásul a termék kristályos formában könnyen szeparálható, formulázható, és egyértelműen javítja annak megjelenését. Sok esetben a kristályosítás jelenti a terméktisztítás utolsó lépését (végtisztítás). A kristályosítást általában kevert tartályban hajtják végre, és a termék mennyiségétől függően mind szakaszos, mind folyamatos üzemmódra lehetőség van. A szakaszos kristályosítás szabályozottsága (ezáltal reprodukálhatósága) nagyban növelhető oltókristályok alkalmazásával.

A termék ultratisztítása

Ha a biotechnológiai terméket, pl. fehérjekészítményt humán alkalmazásra szánják, akkor nem ritka a 99,999 %-os tisztasági igény, azaz a terméket ennek megfelelően kell megtisztítani. Az ultratisztítási műveletek között megkülönböztetett helyet foglalnak el azok az eljárások, mikor a terméket egy szilárd porózus segédfázisra (mátrixra) visszük, majd egy mozgó folyadék fázissal eluáljuk. Ezekben az úgynevezett kromatográfiás eljárásokban a terméket és a szennyezőket a szilárd és folyadék fázisok közötti eltérő megoszlásukat kihasználva választjuk el. A fehérjék tisztításakor az alkalmazott mátrixok általában 10-100 mm-es gyöngyökből állnak (11. ábra), melyeket leggyakrabban oszlopokban helyeznek el, bár számos esetben ’batch’ rendszerű alkalmazás is lehetséges. A gyöngyök általában kémiailag keresztkötött biopolimerek, pl. dextrán, melyek pórusain (~10 nm) lehetővé teszi a fehérje molekulák szabad átjárását. A fehérjék tartózkodási idejét a pórusméreten, továbbá a molekulák nagyságán, alakján túlmenően, a fehérjék és a mátrix felszínének a töltése, polaritása és hidrofobicitása határozzák meg. Általában mindezek a paraméterek befolyásolják a kromatográfiás elválasztásokat, de legtöbbször egy-egy kölcsönhatásforma dominál. Eszerint a kromatográfiás elválasztásokat a következőképpen csoportosíthatjuk:

(1)   gélszűrés (a gél pórusmérete és a molekulák nagysága határozza meg az elválást; 11. ábra),

(2)   adszorpció (hidrofób kölcsönhatások és polaritásbeli eltérések dominálnak),

(3)   ioncserés kromatográfiák (az ionos kölcsönhatások a meghatározók),

(4)   affinitáskromatográfiák (affinkölcsönhatás határozza meg, ami alapvetően a molekuláknak az adott felülethez való illeszkedési képességétől függ).

11. ábra A fehérjemolekulák méret szerinti elválasztása gélszűréssel.

Egy-egy fehérjetermék tisztításához általában 2-4 kromatográfiás lépés elegendő, de az affinitáskromatográfiás eljárások elterjedésével a tisztítási lépések száma minimalizálható. Közepes volumenű tisztítások esetében a kromatográfiás oszlopok (5-15 l) főképpen üvegből vagy műanyagból készülnek, e fölött a rozsdaálló acél szerkezeti anyag az elterjedt. Általában kisnyomású kromatográfiás rendszereket alkalmaznak, de lehetséges nagy nyomású rendszer (’high pressure liquid chromatography’, HPLC) felhasználása is. A hagyományos oszlopkromatográfiás módszerek időigényesek, a nagy szemcseméret és a lassú átfolyási sebesség pedig eleve csökkenti a felbontás élességét, ami alapvetően függ a fehérjemolekulák diffúziójától. Ezen javíthatunk a szemcseméret csökkentésével és a nyomás fokozásával, de ekkor merőben új, nyomásálló mátrixok kialakítására van szükség, tekintve, hogy a hagyományos mátrixanyagok összenyomhatóak. A HPLC oszlopok igen kicsi szemcseméretűek, és igen jó felbontásúak. Ráadásul a tisztítás időigénye nem órákban, hanem percekben mérhető. Ugyanakkor HPLC eljárásokkal csak a nagy nyomásnak és az ebből eredő nyíróerőknek ellenálló, általában kis molekulatömegű fehérjék tisztíthatók jó kihozatallal (inzulin, növekedési hormon, interleukin-2). A HPLC berendezések léptéknövelése igen drága, ami ezen berendezések ipari felhasználását a humán terápiás fehérjék tisztítására korlátozza. Vannak átmenetek a hagyományos oszlopkromatográfiás és HPLC eljárások között, ilyen az FPLC (’fast protein liquid chromatography’), mely a hagyományos mátrixanyagokat használja fel. Az iparban használt kromatográfiás rendszerek automatizáltak, komputer által vezéreltek, ami kiváló reprodukálhatóságot tesz lehetővé.

A kromatográfiás eljárások rövid ismertetése

A gélszűrés tehát a fehérjéket méret szerint különíti el, és a molekulák elúciós sorrendje csökkenő molekulatömeg szerinti (11. ábra). A mátrixanyagok, dextrán, agaróz, akrilamid, kémiai keresztkötésének a mértéke meghatározza a kizárt fehérék molekulatömegét. A művelet kistérfogatú, koncentrált mintát igényel, ugyanakkor nagy hígulást eredményez. Gyakran alkalmazzák a tisztítási sor végén, akár az utolsó lépésként is.

Az ioncserés kromatográfia azt a tényt használja ki, hogy a fehérjéknek mind izoelektromos pontjuk alatti (a fehérje pozitív töltésű), mind afölötti (a fehérje negatív töltésű) pH értékeknél töltésük van. Így a pH alkalmas megválasztásával a fehérjéket mind anioncserélőn (a mátrixra aminoetil-, vagy dietil-aminoetil-csoportokat rögzítettek) mind kationcserélőn (a mátrixon szulfo-, vagy karboxietil-csoportokat figyelhetünk meg) elválaszthatjuk. A fehérjéken először felvisszük az oszlopra (az érzékeny fehérjék denaturálódhatnak a lokális pH-változás következtében), majd pH-változtatással, vagy ionerősség-változtatással szakaszosan, vagy folyamatosan (pl. sógrádienssel) eluálhatjuk.

A kromatofókuszálást olyan speciális ioncserélő mátrixon hajtják végre, amely széles pH-tartományban nagy pufferkapacitással rendelkezik. Az oszlopon egy speciális pufferrel, ami szintén széles tartományban pufferel, fokozatosan pH-grádiens alakítunk ki. Ennek az a következménye, hogy a fehérjék csak az izoelektromos pontjuknak megfelelő lokális pH-n nem tudnak a mátrixhoz kötődni, minden más pH-értéken viszont igen. Mivel a bázikus pH értéken ekvilibrált mátrix pH-ját a savas pH-jú elúciós puffer lassan, fokozatosan savanyítja, így az oszlop mentén pH-grádiens alakul ki. Ennek következtében a fehérjék az izoelektromos pontjukkal egyező pH értéken, igen jó felbontással, mintegy fókuszálva jönnek le az oszlopról. Az eljárás igen potens, ugyanakkor igen drága, ami a lehetséges ipari alkalmazásokat limitálja.

A hidrofób kölcsönhatás kromatográfia lehetővé teszi, hogy a fehérjék a felületükön megfigyelhető hidrofób régióik (alanin, valin, leucin, izoleucin, triptofán, metionin, fenil-alanin és prolin oldalláncok halmozódnak lokálisan) révén apoláros (pl. fenil- és oktil-szefaróz alapú) mátrixokon adszorbeálódjanak. A fehérjék kötődését a közeg ionerősségének a növelésével segíthetjük elő. A fehérjék elúciója az ionerősség csökkentésével, detergens alkalmazásával, illetve az oldószer polaritásának a mérséklésével (etanol vagy glicin hozzáadása) lehetséges.

Az affinitáskromatográfiák gyors terjedését figyelhetjük meg mind a laboratóriumi, mind az ipari tisztítási folyamatokban. Mivel egy lépésben drasztikus, akár 1000-szeres tisztulást is elérhetünk, miközben a termék igen jelentősen koncentrálódik is, így ezt a kromatográfiás módszert célszerű a tisztítási sor elején alkalmazni. Az affinitásoszlophoz a tisztítani kívánt fehérjétől függően enzim szubsztrátot, szubsztrát analógot, inhibitort vagy kofaktort, vagy éppen antigént vagy antitestet kötünk. A specifikus kötődést és mosást követően a terméket pH-, ionerősség- vagy oldószerpolaritás-változtatással eluálhatjuk, továbbá enzimek esetében lehetséges a szubsztráttal, szubsztrát-analóggal vagy inhibítorral történő elúció is. A módszernek igen sok előnye van, de sokszor nehéz magának a megfelelő affinoszlopnak az előállítása a ligandum kémiai inertsége vagy éppen labilitása miatt. Továbbá nem zárható ki teljesen a ligandum szivárgása sem, ami a terméket toxikus molekulákkal szennyezheti. Az affinitáskromatográfia ma alkalmazott legfontosabb típusai:

(1)   immunaffinitás kromatográfia,

(2)   protein A kromatográfia,

(3)   lektin affinitáskromatográfia,

(4)   festék affinitáskromatográfia,

(5)   fémkelát affinitáskromatográfia.

Az immunaffinitás kromatográfiát számos fehérje (mind antigén, mind antitest) kinyerésére alkalmazzák kihasználván az antigén-antitest kölcsönhatások kivételes specificitását és erősségét. Ez utóbbi miatt viszont a termék elúciója általában csak drasztikus pH-változtatással (savanyítás akár pH=2,2-ig), vagy kaotróp ágensek alkalmazásával lehetséges, ami a termék biológiai aktivitását komolyan veszélyeztetheti.

A Staphylococcus aureus Protein A fehérje specifikus és erősen köti az IgG antitestek Fc-régióját, ami a Protein A affinitáskromatográfia alapját képezi. A mátrixhoz kapcsolt Protein A-hoz kötődő antitestek pH-változtatással eluálhatók, de a különböző IgG osztályok, illetve a különböző fajok IgG molekuláinak a kötődése nagyon jelentősen eltér.

A lektin affinitáskromatográfia lényege az, hogy a növényi lektinek, ’fitohemagglutininek’, nagy specifitással ismernek fel, illetve kötnek bizonyos térállású monoszacharidokat, pl. α-D-mannózt, N-acetil-β-D-glükózamint, α-D-glükózt, amelyek a glikoprotein oldalláncok alapvető komponensei is. Miután a mátrixhoz lektineket kötnek kovalensen, lehetővé válik a közegben lévő glikoproteinek elválasztása. Az ipari alkalmazásnak a lektinek ára gátját szabja, illetve az, hogy a módszer nem specifikus adott fehérjékre.

A festék affinitáskromatográfia kifejlesztésének az alapját az a megfigyelés képezte, hogy a gélszűrő oszlopok kizárási térfogatának a mérésére használt kék dextránnal (’Blue Dextran’) számos fehérje kölcsönhatásba lépett, lehetetlenné téve a fehérjék pontos móltömegének a megállapítását. Tekintve, hogy ezek a festékek olcsók és könnyen kapcsolhatók kémiailag oszloptöltetekhez, mára a festék kromatográfiák elterjedését figyelhetjük meg. Mivel a fehérje-festék kölcsönhatások sokrétűek (ionos, hidrofób és hidrogén híd kölcsönhatások egyszerre vannak jelen), így ezen tisztítási eljárások fejlesztése az egyes fehérjék kinyerésére mindig empirikusan történik.

A rekombináns fehérjék címkékkel való ellátása (’tag’-ek alkalmazása) affinitástisztítást is lehetővé tesz. A ’poli-His-tag’ címkével ellátott fehérjéket egy lépésben kinyerhetjük fémkelát affinitáskromatográfiával. Ekkor a mátrixhoz kovalensen iminoacetát-csoportokat kötnek, melyekel Ni²⁺-ionokat komplexáltatnak. A fémionok neutrális pH-értéken képesek a koordinációs szférájuk szabad helyein a poli-His-tag címkék hisztidin oldalláncaival erős komplexet képezni. Elúciókor ezen komplexeket a pH savanyításával, vagy kompetitív kelátképzőkkel (pl. imidazol, EDTA) történő elúcióval bontják meg.

Mivel a címkék alkalmazása és fúziós fehérjék kifejeztetése egyre nagyobb teret nyer a rekombináns fehérjék előállításakor, ezért szót kell ejtenünk ezek eltávolításának a szükségességéről és lehetőségeiről is. Mind a címkét, mind a fúziós fehérje partnert célszerű eltávolítani a tisztítást (preferáltan az affintisztítási lépés(eke)t) követően, mert ezek immunválaszt válthatnak ki. A címkéket enzimmel (pl. karboxipeptidáz C exopeptidázzal), vagy kémiai reakcióval (pl. a linkerek hasítása metionin aminosavaknál brómciánnal vagy hidroxilaminnal, amely reakció azonban a körülményei miatt denaturálhatja a terméket) távolíthatjuk el. A fúziós partner levágása pedig általában specifikus hasítást biztosító proteázokkal, pl. tripszin, faktor Xa, enterokináz, történik.

A végtermék kialakítása és formulázása

A megtisztított biomolekulákhoz sokszor adalékokat adnak, hogy azokat kellően stabilizálják, illetve azok hatásának a kifejeződését elősegítsék. A fehérjék esetén a termék tárolása történhet ampullákban, oldatban, vagy ha ez nem ad kellő stabilitást, akkor kiszárítva por formában is. A kiszárítás ebben az esetben leggyakrabban fagyasztva szárítással (liofilezés; 12. ábra) történik, amelynek az a lényege, hogy a fehérjepreparátumot lefagyasztjuk, majd nagyvákuum alatt annak jégtartalmát elszublimáltatjuk. A művelet kivitelezésekor igen fontos az oldat gyors lehűtése a fehérjék ’üvegesedési’ hőmérséklete alá, megakadályozandó az oldott pufferkomponensek és egyéb additívumok kiválását, ami az oldatban visszamaradó fehérjék irreverzibilis károsodását okozhatja. Alkalmazhatunk a termék védelme érdekében krioprotektánsokat (glükóz, szacharóz, poliolok, humán szérum albumin, lizin, arginin, glutaminsav). Ha a biológiai aktivitás nem sérül jelentősen, lehetséges a magas hőmérsékleten való szárítás is, pl. porlasztva szárítással (13. ábra). Ekkor az oldott terméket porlasztófejen át szárító térbe diszpergálják, és a kialakuló apró vízcseppek a szárító levegővel érintkezve elveszítik a víztartalmukat. A szálló por leválasztása légciklonnal, illetve zsákos légszűrővel történik.

12. ábra Laboratóriumi liofilizáló berendezés.

13. ábra Ipari porlasztva szárító berendezés részei.

A fehérjékre számos veszély leselkedik mind a tisztítás, mind a tárolás alatt. Ilyenek lehetnek pl. a környezeti körülmények (extrém pH, magas hőmérséklet) által kiváltott vagy elősegített kovalens módosulások (hidrolízis, dezamidálás, iminek kialakulása, racemizáció, oxidáció, diszulfid-hidak újrarendeződése, izomerizáció, fotodekompozíció és H₂S-felszabadulás), illetve a fehérjék biológiai hatások következtében végbemenő proteolítikus degradációja, valamint az oligoszacharid-oldalláncok glikozidázok általi módosítása. A termék tisztítása alatt a proteázok hatását azzal tudjuk leginkább csökkenteni, ha a termelésre használt rekombináns organizmus gyenge proteáz termelő, illetve sikerül a fermentáció alatt a termékképzés fázisát a proteázok termelésétől jól elválasztani. További lehetőség a fermentlé hűtése, a tisztítási idő csökkentése, illetve proteázgátlók (fenil-metil-szulfonil-fluorid, benzamid, papsztatin A, EDTA) adagolása. A végtermékben a proteázok esetleges hatását nagy mennyiségű inert védőfehérje, pl. humán szérum albumin hozzáadásával védhetjük ki. Az aminosav-oldalláncok oxidációja (pl. jól ismert a metionin oxidációja szulfoxidon át szulfonná, illetve a ciszteiné diszulfiddá illetve szulfonsavvá) is nagyon komoly veszélyforrás, amit inert atmoszférás (pl. az ampullákban a levegőt N₂-re cserélik) tárolással és antioxidánsok adagolásával lehet kiküszöbölni.

A fehérje termékek stabilizálására számos ágens szolgál, ilyenek a pufferkomponensek (megfelelő pH biztosítása), adalék fehérjék, pl. humán szérum albumin, (aktív szerkezetet stabilizálnak, minimalizálják a termék kitapadását, lekötik a nyomnyi mennyiségben jelenlévő proteázok és egyéb hidrolázok aktivitását, krioprotektív hatást biztosítanak), aminosavak, pl. glicin, (aktív szerkezetet stabilizálnak, kitapadást, aggregálódást gátolnak), poliolok, pl. glicerin, mannitol, szorbitol, polietilén-glikol (szerkezetet stabilizálnak) és a felületaktív anyagok (’surfactants’; gátolják a fehérjék akkumulálódását, aggregálódását és denaturálódását a levegő-folyadék határrétegnél).

Végezetül, a tanultak szemléltetésére és a technológiai ismeretek további elmélyítése céljából szeretnénk az olvasók szíves figyelmébe ajánlani a következő irodalmat: (Pécs, 2011), mely részletesen bemutatja a monoklonális antitestek ipari előállításának az ’up-stream’ és ’down-stream’ folyamatait.

Forrásmunkák

Kadir, F., Hamers, M. and Ives, P. (2008) Production and downstream processing of biotech compounds. Pharmaceutical Biotechnology (Szerkesztők: Crommelin, D.J.A., Sindelar, R.D. and Meibohm, B.), Informa Healthcare USA, Inc., New York, oldalak: 49-65.

Ottens, M., Wesselingh, J.A. and van der Wielen, L.A.M. (2006) Downstream processing. Basic Biotechnology (Szerkesztők: Ratledge, C. és Kristiansen, B.), Cambridge University Press, Cambridge, oldalak: 219-249.

Pécs, M. (2011) Fermentációs Feldolgozási Műveletek. Egyetemi tananyag. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

Walsh, G. (2007) Pharmaceutical Biotechnology. Concepts and Applications, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, oldalak: 131-172.

Önellenőrzés 2

3. fejezet - Gyógyszeripari jelentőségű szekunder metabolitok előállítása mikróbák segítségével (Dr. Emri Tamás)

Szekunder metabolitok

A szekunder metabolitok (a szekunder anyagcserében képződő molekulák) termelése valamennyi nagyobb élőlénycsoportban (valódi és ősbaktériumok, gombák, növények, protozoák, algák, állatok) megfigyelhető. A mikrobiológiában szekunder metabolitoknak a mikrobák által termelt, a vegetatív növekedésükhöz nem esszenciális molekulákat tekintik. A definíció sok esetben nem egyértelmű, egyes molekulák (pl. sziderofórok, pigmentek) primer és szekunder metabolitként is viselkedhetnek.

Kémiai szerkezetük és biológiai funkciójuk igen változatos. Leggyakrabban olyan molekulák, melyek a fajok, egyedek közötti interakciókat befolyásolják (pl. antimikotikumok, antibiotikumok, toxinok), de lehetnek pigmentek (védekezés az ionizáló sugárzással, oxidatív károsodással, hidrolítikus enzimekkel szemben), vagy a sejtek differenciálódását, kommunikációját befolyásoló vegyületek is. Sok esetben több, eltérő biológiai funkcióval is rendelkeznek. Egyes elméletek szerint közreműködhetnek a sejtek anyagcseréjének stabilizálásában (metabolikus zavar miatt akkumulálódó intermedier eltávolítása), és/vagy lehetnek detoxifikációs folyamatok termékei is.

Génjeik még eukarióták esetében is gyakran egymás közelében (klaszterbe) rendeződötten vannak jelen a genomban. E klaszterek horizontális géntranszfer segítségével távoli fajokba (prokariótákból akár eukariótákba) is átkerülhetnek. A gombákban található, a β-laktám szintézisben (cefalosporin, penicillin szintézis) résztvevő gének számos prokarióta jellegzetességet mutatnak: Streptomycesekre és Flavobacteriumokra jellemző G+C arány, intronok hiánya, nagyfokú szekvencia homológia prokarióta β-laktám szintézis génekkel. A szintézis út nem teljes: a cefalosporin C szintézis esetében a prokarióta cefamycin C képződésében résztvevő 7 génből 4, a penicillin szintézis estében 2 található meg a gomba genomban. Mind a cefalosporin, mind a penicillin szintézis utat egy – legalább részben – gomba eredetű gén által kódolt enzim zárja. A fentiek alapján valószínűsíthető, hogy a gombák a prokariótáktól vették át a β-laktám szintézishez szükséges géneket. A géntranszfer nem volt teljes, így a hiányzó géneket saját génjükkel helyettesítették (García-Estrada et al. 2010 - Evolution of fungal β-lactam biosynthesis gene clusters).

Az eddig vizsgált fajok mindegyike többféle szekunder metabolitot is termel. Bár a szekunder metabolitok képződése (a mennyiség és a spektrum tekintetében is) nagymértékben függ a tápközeg összetételétől, megfelelően standardizált körülmények között vizsgálva a szekunder metabolit spektrum taxonómiai bélyegként is használható. Sok képviselőjük a növekedés kései exponenciális, stacioner, vagy hanyatló fázisában keletkezik és képződésük erős karbon represszió alatt áll (pl. Penicillium chrysogenum - penicillin), de ez korántsem általános. Számos példa van a növekedés alatt termelődő, karbon represszió által nem szabályozott (pl. Aspergillus rugulosus – echinocandin B) szekunder metabolitra is.

A szekunder metabolitok bioszintézise

Változatos kémiai szerkezetüknek megfelelően bioszintézisük is igen változatos. Számos képviselőjük poliketid szintázok (PKS), illetve nem riboszómális peptid szintázok (NRPS) segítségével keletkezik.

A poliketid szintázok működése, csoportosítása

Poliketid anyagok: acetil, propionil, butiril egységekből a zsírsavszintézissel analóg módon kialakuló igen változatos szerkezetű és funkciójú molekulák. Poliketidek szintézisére a prokarióták és gombák mellett, a növények, protozoák és egyes állatok (szivacsok, puhatestűek, rovarok) is képesek.

Szintézisük egy poliketid szintáznak (PKS) nevezett enzimkomplex felületén történik. Tipikus esetben a szintézisben ugyan olyan funkciójú domének/enzimek vesznek részt, mint a zsírsavszintézisben: ketoszintáz, aciltranszferáz, acilkarrier protein (ACP), ketoreduktáz, dehidratáz, enoilreduktáz, tioészteráz.

A poliketidek szerkezete azonban igen változatos és rendszerint nem is hasonlít a zsírsavak felépítésre (14. ábra; 15. ábra; 28. ábra, 29. ábra). E változatosság oka:

(1)   A poliketid lánc esetében a lánckezdő egység nem csak acetil-, de propionil-, és butiril-CoA is lehet. A láncnövelő egységként szintén nemcsak malonil-, de metilmalonil-, vagy etilmalonil-CoA is szolgálhat. Azaz, az egyes ciklusokban nem csak C2, de C3 és C4 egységek is beépülhetnek a molekulába, ami metil-, illetve etil-oldalláncok kialakulását eredményezi.

(2)   A ciklusok száma, így a molekula mérete változatos lehet. (pl. metil-butirát – két ciklus, nisztatin – 19 ciklus).

(3)   Az egyes ciklusokban egy, vagy több láncmódosító domén is hiányozhat, ezért az adott láncrész oxo-, vagy hidroxil-csoportot, illetve kettőskötést is tartalmazhat.

(4)   A megfelelő funkciós csoportok között keresztkötések alakulhatnak ki bonyolult gyűrűs struktúrákat eredményezve.

(5)   Az alapváz igen sokféle képen módosulhat további enzimek segítségével (új funkciós csoportok és gyűrűk kialakulása, cukor egységek kapcsolódása stb.).

A poliketid szintázok típusai

PKS I: multidomén fehérjékből álló nagyméretű komplexek. Két altípusuk van: processzív és iteratív módon működő poliketid szintázok.

Processzív PKS I: moduláris felépítésű. A modulokat az egy ciklusban résztvevő domének alkotják. A fehérje komplexen a szintetizálódó molekula modulról-modulra (ACP-ről ACP-re) halad végig, míg el nem éri a tioészteráz domént (14. ábra). Minden modul csak egyszer működik egy adott molekula szintézise alatt (pl. makrolid antibiotikumok, polién antifungális szerek szintézise). Ebből adódik, hogy szoros kapcsolat van az enzimkomplex felépítse és a képződött molekula szerkezete között: a modulok száma meghatározza a termék hosszát. A modulok domén összetétele (ketoreduktáz, dehidratáz, enoilreduktáz domének jelenléte, vagy hiánya) határozza meg, hogy a molekula adott pontján telített láncrész, kettőskötés, hidroxil-, vagy oxo-csoport jön létre. A domének szerkezete dönti el, hogy milyen lánckezdő, vagy láncnövelő egység épül be a molekulába az adott ciklusban (metil- és etil-oldalláncok kialakulása). A PKS-t kódoló gén módosításával (modulok, illetve domének eltávolítása, vagy beépítése) teljesen új molekulák tervezhetőek és szintetizálhatóak (McDaniel és munkatársai, 1999).

14. ábra A processzív módon működő PKS I felépítése és működése a nystatin szintézis példáján keresztül bemutatva. A szintetizálódó molekula ACP-ről ACP-re adódik át. Minden modul csak egy ciklust katalizál; az adott ciklus eseményeit a modul domén szerkezete határozza meg. Pl. a 6. ciklusban a beépült acetil-csoport oxo-csoportja redukálódik (KR), a hidroxil-csoport eliminálódik (DH), a kettős kötés redukálódik (ER) és így egy telített láncrész jön létre. A 8. ciklusban a KR és a DH domén jelenléte miatt kettőskötés alakul ki. A 12. ciklusban egy metilmalonil-CoA növeli a láncot (ATx) és nincs DH és ER domén, így egy metil és egy hidroxil-csoport keletkezik.

Iteratív PKS I– dimer szerkezetű; két multidomén fehérje alkotja (15. ábra), melyek egy-egy modult alkotnak. A szintetizálódó molekula egyik modulról a másikra adódik át (oda-vissza); minden második ciklust ugyanaz a modul végez, míg a lánc el nem éri a megfelelő hosszúságot. A szintetizálódó lánc megfelelő funkciós-csoportjai között gyakran keresztkötések jönnek létre, ami bonyolult kondenzált gyűrűs struktúra kialakulásához vezet (pl. grizeofulvin, lovasztatin szintézise).

15. ábra Az iteratív PKS I felépítése és működése a lovasztatin szintézis példáján keresztül bemutatva.

PKS II: több monodomén fehérje komplexe (egyetlen modulból áll). Legegyszerűbb esetben egy ketoszintázból és egy ACP-ből állnak (pl. metil-butirát, tetraciklin, daunomicin bioszintézis).

PKS III: homodimer szerkezetű, két multidomén fehérje alkotja, de ACP doménnel nem rendelkezik. Az iteratív PKS I-hez hasonlóan működik, de a szintézis nem ACP-hez, hanem CoA-hoz kötötten zajlik.

Nem riboszomális peptid szintázok (NRPS)

A nem riboszomális peptidek: aminosavakból peptid kötéssel kialakuló, nem a riboszómákon szintetizálódó szekunder metabolitok, melyek szerkezetileg és képződésüket tekintve is igen hasonlítanak egyes sziderofórokhoz. Változatos funkciójú, elsősorban a mikrovilágból ismert, de a növényeknél, protozoáknál és állatoknál is előforduló molekulák. Igen változatos szerkezetűek, gyakran nem is ismerhető fel a peptid struktúra (pl. penicillinek).

Jellemző rájuk, hogy:

(1)   Az aminosavak a riboszómáktól függetlenül kapcsolódnak össze.

(2)   Az aminosavak aktiválása közvetlenül ATP (adenilezés) és nem tRNS segítségével történik.

(3)   A fehérjealkotó aminosavakon túl nagyon sokféle más aminosavat – pl. D-aminosavak, N-metilált aminosavak és egyéb nem fehérje alkotó aminosavakat (pl. 2-aminobutirát, ornitin) is tartalmazhatnak.

(4)   A láncba beépített aminosavak gyakran módosulhatnak is (pl. N-metilálás, ciklizáció, epimerizáció).

(5)   Ciklikus szerkezetű, illetve elágazó alapláncúak is lehetnek.

(6)   A kiindulási alapváz további enzimek segítségével lényegesen módosulhat.

NRPS vesz részt többek között az alábbi molekulák szintézisében:

(1)   ACV-tripeptid (penicillin és cefalosporin bioszintézis kiindulási molekulája),

(2)   bacitracin, vankomycin,

(3)   actinomycin, bleomycin,

(4)   ciklosporin,

(5)   peptid típusú ergot alkaloidok,

(6)   egyes sziderofórok, pigmentek és toxinok.

Az NRPS jellemzői: moduláris szerkezetűek; processzív módon működnek (16. ábra), esetenként PKS modult is tartalmaznak (pl. bleomycin szintáz). A szintézis az N-terminálistól halad a C-terminálisig.

16. ábra Az NRPS felépítése és működése a bacitracin szintézis példáján keresztül bemutatva.

A szintézisben résztvevő domének:

(1)   F: formiláció (a kezdő aminosav módosítása),

(2)   A: adeniláció (az aminosav aktiválása ATP-vel),

(3)   PCP: peptidil karrier protein; a lánc megkötése a 4-foszfo-pantetein tiol csoportján,

(4)   C: kondenzáció két aminosav egység között (a lánc növelése),

(5)   Cy: ciklizáció két összekapcsolandó aminosav (az egyik Cys, vagy Ser) egység között (tiazolin és oxazolin gyűrű kialakítása) (a lánc növelése),

(6)   Ox: a tiazolin és oxazolin gyűrűk oxidálása tiazol és oxazol gyűrűvé (a lánc módosítása),

(7)   Red: a tiazolin és oxazolin gyűrűk redukálása tiazolidin és oxazolidin gyűrűvé (a lánc módosítása),

(8)   E: epimerizáció (D-aminosavak létrehozása, ha nem D-aminosav a szubsztrát) (a lánc módosítása),

(9)   NMe: N-metiláció, ha nem N-metilált aminosav a szubsztrát (a lánc módosítása),

(10)    TE: tioészteráz, felszabadítja a terméket az ACP-ről és kialakítja szükség esetén a gyűrűs struktúrát (termináció),

(11)        R: a tioészteráz-reduktáz aktivitás, a tioészter kötést megbontja és a karbonsavat aldehiddé, alkohollá redukálja (termináció).

A modulok szerkezete:

(1)   Start modul: (F/NMe)-A-PCP. Aktiválja az első aminosavat és a PCP-re juttatja; ha van megfelelő domén, akkor metilezi, vagy formilezi is.

(2)   Elongációs modul: -C/Cy-(NMe)-A-CPC-(E,Ox,Red). Aktiválja és a PCP-re juttatja a soron következő aminosavat, összekapcsolja a két egymást követő aminosavat, módosítja a láncot.

(3)   Terminációs modul: -C/Cy-(NMe)-A-CPC-(E,Ox,Red)-TE/R. Az utolsó elongációs modul, amely a szintézis végén felszabadítja a terméket az enzimkomplexről, szükség esetén kialakítja a gyűrűs struktúrát (laktám/lakton), redukálja a C-terminálist aldehiddé, vagy alkohollá.

A kialakult alapváz további enzimek segítségével másodlagosan módosulhat: glikoziláció, acilezés, halogénezés, hidroxilálás, stb.

A szekunder metabolitok előállítása

A szekunder metabolitok előállításának lehetőségei:

(1)   kémiai szintézis: egyszerűbb szerkezetű metabolitok esetében gazdaságos megoldást jelent (pl. foszfonomicin, klóramfenikol),

(2)   izolálás természetes forrásból: pl. alkaloidok izolálása szántóföldi növényekből, illetve szántóföldi növényeken „termesztett” gombák szkleróciumából,

(3)   fermentáció: a szekunder metabolitot termelő mikroba segítségével történik a termék előállítása; olcsó és veszélyes reagensektől mentes gyártást tesz lehetővé, de sok esetben az eredeti termelő törzs nem ismert, vagy iparban gazdaságosan nem tenyészthető,

(4)   heterológ gyártás: a szekunder metabolit génklaszter (vagy egyes génjeinek) expresszáltatása ipari körülmények között gazdaságosan tenyészthető, intenzív szekunder metabolit termelésre kifejlesztett az eredeti törzzsel, gyakran közeli rokon, és/vagy hasonló metabolitot termelő törzsben. Pl. a lovasztatin szintézisért felelős gének expresszáltatása intenzív penicillintermelésre kifejlesztett Penicillium chrysogenum törzsben, vagy polién antimikotikum génklaszter expresszáltatása amfotericin B gyártására kifejlesztett Streptomyces nodosus törzsben. A módszer előnye, hogy „megspórolható” vele az eredeti termelő törzs hosszadalmas és költséges nemesítése. Sőt, lehetővé teszi ipari körülmények között nehezen tenyészthető fajok metabolitjainak, illetve metagenomikai módszerekkel izolált, vagy mesterségesen létrehozott (pl. ’molecular breeding’) génklaszterek által meghatározott metabolitok gyártását is.

Az előállított szekunder metabolit lehet egy termék hatóanyaga, de lehet egy félszintetikus termék alapanyag is. A félszintetikus termékeket az alapanyag kémiai, vagy biokonverziós módosításával hozzák létre. A szekunder metabolitok fermentációs iparban történő előállításának sikere a megfelelő törzsnemesítő munkán és a létrehozott törzzsel kompatibilis fermentációs technológia kidolgozásán alapul. A törzsnemesítés néhány gyakori célja:

(1)   A szintézis út aktivitásának növelése. Pl. Leggyakrabban a teljes génklaszter, vagy a szintézis út fontosabb génjeinek – ha ismertek - kópiaszámát növelik meg. Eredményes lehet a klasszikus megoldás is (random mutagenezis, majd a mutánsok szisztematikus tesztelése), különösen akkor, ha a mutánsok tesztelése kis térfogatban is megvalósítható és automatizálható (’high throughput screening’; HTS).

(2)   A termelő törzs rezisztenciájának növelése. Ha a termelő törzs érzékeny az általa szintetizált hatóanyagra, akkor a szintézis út aktivitásának növelésével párhuzamosan szükséges lehet a törzs rezisztenciáját is megnövelni. A rezisztencia mechanizmusának ismeretben a megfelelő gének aktivitása megváltoztatható. Ha a rezisztencia mechanizmusa nem ismert, gyors megoldást jelent (random mutagenezist követően) a mutánsok egyre növekvő mennyiségű hatóanyagot tartalmazó tápközegben való szelektálása is.

(3)   A primer anyagcsere módosítása. Ahhoz, hogy a primer anyagcsere megfelelő mennyiségű metabolittal és kofaktorral tudja ellátni a megnövekedett aktivitású szekunder anyagcserét, szükséges lehet a primer anyagcsere átalakítására is. Ma még nehéz előre megjósolni, hogy mely gének aktivitását hogyan kell ehhez megváltoztatni, így a legcélravezetőbb eljárást a klasszikus törzsnemesítés jelenti. (E törzsnemesítő munka váltható ki a termék heterológ gyártásával.)

(4)   A melléktermékek számának, mennyiségének csökkentése. (Jelentősen csökkenti a termék tisztításának költségeit, lásd ’Down-stream’ folyamatok). Ha a génklaszter génjeinek funkciója ismert, a melléktermék képzésért felelős gének inaktiválhatóak, illetve a főtermék szintéziséért felelős gének aktivitása megnövelhető. Ha a melléktermék képzésért egy olyan gén felelős, amely szükséges a főtermék szintéziséhez is a fehérje aktivitásának módosításával lehet csökkenteni a melléktermékek mennyiségét. A módosított aktivitású enzimet kódoló mutáns gén előállítható protein ’engineering’ segítségével, illetve – szerencsés esetben - „készen” izolálható a természetből is (pl. metagenom könyvtárak ortológ génjeinek tesztelése). Fontos megjegyezni, hogy a mellktermékek egy jelentős része a főterméktől csak igen kis mértékben különbözik (ld. pl. echinocandin analógok). Képződésük megakadályozása, illetve a ’Down-stream’ folyamatok keretében történő eltávolításuk igen nagy kihívást jelent a szakemberek számára és gyakran alapvetően befolyásolja a termék előállításiköltségeit.

(5)   Egyéb, pl. nem kívánt szekunder metabolitok (pl. mikotoxinok) képződésnek megszüntetése, morfológia módosítása, spórázási tulajdonságok megváltoztatása stb.

A molekuláris biológiai módszerek előnye, hogy alkalmazásukkal igen eredményeses oldható meg egy-egy adott probléma feltéve, ha tudjuk, hogy mely gének aktivitását kell növelnünk, illetve csökkentenünk. A klasszikus törzsnemesítés előnye, hogy olyankor is eredményesen használható, ha nem tudjuk, hogy mely gének aktivitását kell megváltoztatni (csak az elérni kívánt fenotípust kell ismernünk). A penicillingyártásra használt ipari Penicillium chrysogenum törzsek esetében a klasszikus törzsnemesítés évtizedei alatt mintegy 400 (nagyrészt ismeretlen funkciójú) gén működése változott meg, noha a penicillin bioszintézisében közvetlenül csak három gén vesz részt. Molekuláris biológiai módszerekkel ma még 400 gén aktivitását nem tudjuk összehangolni, ráadásul nincs annyi ismeretünk a mikrobák anyagcseréjéről (sem), hogy előre ki tudjuk választani, mely gén aktivitásán kellene változtatnunk.

A klasszikus és a molekuláris törzsnemesítés kombinálása

Hagyományos technikákkal hoznak létre előnyösebb tulajdonságú mutánsokat, majd a mutációk genetikai hátterének és fiziológiai következményeinek feltérképezése után molekuláris biológiai módszerekkel (már célzottan) hoznak létre még tökéletesebb törzseket.

Új termékek keresése

A rezisztencia terjedése, a hatékonyabb terápia igénye folyamatosan új termékek kifejlesztésére sarkalja a kutatókat. Új hatóanyagok izolálásának/megalkotásának néhány lehetőségét itt vázoljuk.

A mikroba törzsek izolálása és szekunder metabolit spektrumának tesztelése. Régi módszer, de ma már szinte minden lépése automatizálható és a HTS (’high throughput screening’) technikáknak köszönhetően igen hatékony. Hátránya, hogy a mikrobák alig 2 %-a tenyészthető laboratóriumi körülmények között, így a mikrovilág nagyobb része e módszerrel nem vizsgálható.

A metagenomikai megközelítés

A törzsek izolálásának megkerülésével közvetlenül a DNS-t nyerik ki a mintából, melyből (az „összes” jelenlévő faj DNS-ét tartalmazó) metagenom könyvtárakat hoznak létre (Handelsman, 2004). A metagenom könyvtár vizsgálata (többek között) lehetővé teszi szekunder metabolit szintézisben résztvevő gének, akár teljes génklaszterek izolálását is. Az azonosított génklaszterek heterológ expresszáltatásával a szekunder metabolitok előállíthatóak és tesztelhetők. A szekunder metabolit termelésben résztvevő gének felhasználhatók a törzsnemesítésben (a protein ’engineering’ alternatívájaként), vagy ’molecular breeding’ (lásd alább) technikákban is.

A metabolomikai megközelítés

A megfelelő ’high throughput’ technikák segítségével a minták teljes metabolit spektrumát azonosítják és tesztelik. Az ígéretes metabolitokat – ha ez gazdaságosan megoldható - kémiai úton állítják elő. Ha erre nincs lehetőség az összegyűlt szerkezet-biológiai aktivitás adatokat használják fel kémiai úton gazdaságosan előállítható szintetikus, illetve félszintetikus termékek megtervezéséhez.

A ’molecular breeding’ módszere

Lényege, hogy hasonló szekunder metabolit szintézisért felelős génklaszterek génjeit (elsősorban az alapvázat módosító enzimeket kódoló géneket) véletlenszerűen építik be a vektorba. Az így kapott könyvtárat expresszáltatják és a megfelelő aktivitású terméket szintetizáló klónokat izolálják. E módszerrel egy-egy szekunder metabolit teljesen új (a természetben nem előforduló) változatait is létre lehet hozni, a későbbi ipari előállításához szükséges génklaszterrel együtt (Schmidt-Dannert és munkatársai, 2000).

Gyógyszeripari és/vagy élelmiszeripari szempontból érdekes mikrobiális eredetű szekunder metabolitok

Fontosabb képviselőik:

(1)   antibiotikumok,

(2)   antifungális anyagok (antimikotikumok),

(3)   alkaloidok,

(4)   egyes gomba eredetű pigmentek,

(5)   koleszterinszint csökkentő anyagok (az ergoszterin szintézis mellett a koleszterin szintézist is hatékonyan gátló antifungális molekulák),

(6)   immunszupresszív anyagok (az immunrendszer működését hatékonyan gátló toxikus molekulák),

(7)   tumor ellenes szerek (a humán sejtosztódást gátló toxikus molekulák),

(8)   egyéb hatóanyagok: rezisztencia faktorok működését gátló anyagok (pl. β-laktamáz gátlók), rezisztencia faktorok terjedést gátló anyagok (pl. pilicidek – a bakteriális konjugációt gátló anyagok), emésztőenzimek működését gátló inhibitorok.

Az antibiotikumokkal, antimikotikumokkal, alkaloidokkal, pigmentekkel és a koleszterinszint csökkentő anyagokkal a következő két fejezetben foglalkozunk részletesebben. Az immunszupresszív anyagokra, tumor ellenes szerekre és a fentiektől eltérő felhasználású metabolitokra egy-egy példa erejéig ebben a fejezetben térünk ki.

Ciklosporin

Többek között a Beauveria nivea (Trichoderma polysporum) és egyes Tolypocladium törzsek által termelt ciklikus szerkezetű nem riboszómális peptid (17. ábra). Immunszupresszív hatását annak köszönheti, hogy képes a T-limfociták ciklofilin fehérjéihez kötődni. A kialakuló komplex gátolja a kalcineurin működését és ezen keresztül az interleukin 2 transzkripciót. Ezen felül gátolja a limfokinek termelődését és az interleukinok felszabadulását, valamint a citokrom C felszabadulást kiváltva apoptózist indukál.

17. ábra A ciklosporin szerkezete.

Tacrolimus

Többek között a Streptomyces tsukubaensis által termelt poliketid típusú (processive módon múködő PKS I által termelt) immunszupresszív szekunder metabolit. A ciklosporinhoz hasonlóan a T sejtek interleukin-2 termelését csökkenti a kálcium-kalcinuerin jelátviteli útvonal gátlásán keresztül.

Rapamycin

A Streptomyces hygroscopicus által termelt szekunder metabolit. Bioszintézisében egy NRPS és PKS modulokat is tartalmazó enzimkomplex vesz részt. A TOR (target of rapamicin) jelátviteli útvonal működését gátolva megakadályozza a T és B sejtek interleukin-2 általi aktiválódását.

Mikofenolsav

Penicillium fajok (P. brevicompactum, P. glaucum, P. stoloniferum, P. echinulatum, P. roqueforti) által termelt poliketid típusú szekunder metabolit. Ipari léptékű előállítása elsősorban P. brevicompactum törzsekkel történik. Kereskedelmi forgalomban a mikofenolsav nátrium sója (MPS) és félszintetikus származéka (MMF – mofetil mikofenolsav, a mikofenolsav 2-(4-morfolinil) etilésztere) is elérhető. Mint inozin monofoszfát dehidrogenáz (GTP szintézis) inhibitor, a B és T sejtek osztódását gátolva fejti ki immunszupresszív hatását.

Hidroxidaunorubicin (doxorubicin)

A daunorubicin Streptomyces fajok (pl. Streptomyces peucetius) által termelt citosztatikus hatású poliketid molekula (18. ábra). A dsDNS-be interkalálódva gátolja a topoizomeráz II működését és ezen keresztül a transzkripciót és a replikációt. A terápiában a kevésbé toxikus 14-hidroxilált változatát, a hidroxidaunorubicint (doxorubicin) használják inkább. Az antraciklin tipusú kemoterápikumok „prototípusa”.

18. ábra A daunorubicin és a hidroxidaunorubicin szerkezete.

Actinomycin D

Streptomyces fajok által termelt nem riboszomális polipeptid típusú molekula (19. ábra). Képes a DNS GC-ben gazdag régióihoz kötődni és gátolni a topoizomeráz II működését. Erősen toxikus az emberi szervezetre nézve, ezért a kemoterápiában ritkán használják. A 7-aminoactinomycin D-t, mint DNS kötő fluoreszcens festéket a kutatásban alkalmazzák.

19. ábra Az actinomycin D szerkezete.

Bleomycin

A Streptomyces verticillus által termelt jellegzetes peptid-poliketid-peptid struktúrája van, amit cukor részek módosítanak. (20. ábra). Citosztatikus hatását annak köszönheti, hogy átmeneti fémeket (elsősorban vasat) képes megkötni és oxigén jelenlétében (pszeudoenzimként) szuperoxid és hidroxil szabadgyök képződést katalizál.

20. ábra A bleomycin szerkezete.

Mitomycin

A Streptomyces caespitosus és Streptomyces lavendulae által termelt aziridin-gyűrűt tartalmazó szekunder metabolit. Tumor növekedés gátló hatását annak köszönheti, hogy alkiláló ágensként, a DNS-ben hoz létre kettőskötéseket.

Romidepsin

A Chromobacterium violaceum által termelt nem riboszómális peptid. Hiszton deacetiláz inhibitorként apoptózist indukálva fejti ki rákellenes hatását.

Epothilone

Az epothilone vegyületeket a Sorangium cellulosum baktérium termeli. Bioszintézisükben egy NRPS és PKS modulokat is tartalmazó enzimkomplex vesz részt. A citoszkeletális rendszer működését akadályozva (az ab-tubulin heterodimerhez kötődve gátolják a dimer disszociációját) fejtik ki sejtosztódást gátló hatásukat.

Akarbóz

Pszeudotetraszacharid szerkezetű, Actinoplanes törzsek által termelt antidiabetikus hatóanyag. Glükozid hidroláz inhibitorként gátolja a keményítő lebontását a tápcsatornában és ezáltal fékezi a glükóz felszívódását.

Lipstatin

Többek között a Streptomyces toxytricini által termelt szekunder metabolit. Tetrahidrolipstatin formában fogyókúrás készítmények hatóanyaga. A pankreász lipáz irreverzibilis inhibitoraként fejti ki hatását.

Forrásmunkák

Barredo, JL. (2005) Microbial processes and products. Humana Press, Totowa, N.J.

Goldman, G.H. and Osmani, S.A. (2008) The Aspergilli: genomics, medical aspects, biotechnology, and research methods. Taylor & Francis, Boca Raton.

Hofrichter, M. (2010) The mycota X. Industrial applications. Springer, Berlin.

Kadir, F., Hamers, M. and Ives, P. (2008) Production and downstream processing of biotech compounds. Pharmaceutical Biotechnology (Szerkesztők: Crommelin, D.J.A., Sindelar, R.D. and Meibohm, B.), Informa Healthcare USA, Inc., New York, oldalak: 49-65.

Lee, Y.K. (2003) Microbial biotechnology: principles and applications. World Scientific, New Jersey.

Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S. and Higton, G. (2006) Industrial microbiology: an introduction. MA Blackwell Science, Malden.

Zhang, L and Demain, A.L. (2005) Natural products: drug discovery and therapeutic medicine. Humana Press, Totowa, N.J.

Önellenőrzés 3

4. fejezet - Antibiotikumok előállítása (Dr. Emri Tamás)

Antibiotikumok

Antibiotikumok: mikroorganizmusok által termelt baktériumellenes metabolitok. A prokarióta és eukarióta sejtek közötti alapvető különbségek miatt igen sok olyan antibiotikum ismert, melyek kis toxicitásuknak köszönhetően eredményesen használhatóak a humán terápiában. A jelen fejezet a peptidoglükán sejtfal szintézisét gátló antibiotikumok közül a foszfonomicinnel, bacitracinnal, vankomicinnel és a β-laktámokkal foglalkozik, míg a prokarióta riboszómák működését gátló antibitikumok közül az aminoglükozidokat, makrolid antibiotikumokat, tetraciklineket és a klóramfenikolt említi meg. Az antibiotikumok egy jelentős része nem a sejtfalszintézist, vagy a fehérjeszintézist gátolja. Példaként említhető a rifamycin, a polymixin B és a mupirocin is.

Rifamycin – a Streptomyces mediterranei által termelt makrociklusos, poliketid molekula; a prokarióta RNS polimerázhoz kapcsolódva a transzkripciót gátolja.

Fidaxomicin – Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenesis által termelt makrociklusos poliketid molekula. Clostridium fajok (elsősorban a humánpatogén C. difficile)és néhány más Gram pozitív baktérium ellen hatásos, szűkspektrumú baktericid hatóanyag. Szintén bakteriális RNS polimeráz inhibitor.

Daptomycin – Streptomyces roseosporus fermentlevéből izolált baktericidhatású, lipopeptid antibiotikum. Gram pozitív fajok ellen hatásos; zsírsav-oldallánca segítségével a citoplazma membránhoz kapcsolódik és depolarizálja azt.

Polymixin B – Bacillus polymixa által termelt nem riboszómális peptid antibiotikum; pozitív töltésének köszönhetően a külső membrán negatív töltéseihez kapcsolódva megbontja a membrán struktúráját, majd a külső membránból felszabaduló lipidek a citoplazma membránt is károsítják.

Mupirocin (pszeudomonsav A) – Pseudomonas fluorescens által termelt poliketid antibiotikum; a prokarióta izoleucin-tRNS szintáz inhibítora.

Néhány ide kapcsolódó fogalom

Bakteriosztatikum: a baktérium növekedését gátló, illetve a növekedő (osztódó) sejteket elpusztító anyagok. Pl. a sejtfalszintézist gátló antibiotikumok többsége a nyugvó tenyészetekben, ahol nincs intenzív sejtfalszintézis, lényeges kárt nem tudnak tenni, de a növekedő tenyészeteket elpusztítják. Baktericidek: a növekedő és nyugvó sejteket is elpusztítják (pl. membrán permeabilizáló hatóanyagok).

Az antibiotikumok egyes esetekben koncentráció-függő módon, illetve a baktérium fiziológiai állapotától függően mutatnak baktericid, illetve bakteriosztatikus hatást; pl. a fehérjeszintézist gátló antibiotikumok kis koncentrációban gyakran csak a növekedő (intenzív fehérjeszintézist mutató) tenyészetekben tesznek kárt, míg nagy koncentrációban a nem osztódó, csak minimális fehérjeszintézist mutató, sejteket is károsíthatják. A fentiekhez hasonlóan definiálhatóak a fungisztatikum és fungicid fogalmak is.

Egy mikroba érzékenységét egy adott antimikrobiális szerrel szemben leggyakrabban a MIC (’minimal inhibitory concentration’), ritkábban a MEC (’minimal effective concentration’) értékkel szokták jellemezni. MIC: a hatóanyag azon legkisebb koncentrációja, amely teljesen megakadályozza a tesztelt mikroba növekedését. E koncentráció felett biztosan hatásos a szer – ha nincs paradox effektus (lásd lentebb). MEC: a hatóanyag azon legkisebb koncentrációja, amely már jelentős mértékben gátolja a tesztelt mikroba növekedését, gyakran jól megfigyelhető morfológiai változást is indukálva. Ez a koncentráció is elegendő lehet a hatásos terápiához.

Rezisztencia: A mikroba növekedését, életképességét a tesztelt hatóanyag érdemben nem befolyásolja, illetve csak olyan koncentrációban hat rá, ami gyakorlati szempontból már nem jelentős. Megkülönböztetünk ’intrinsic’ (a fajra eleve jellemző), illetve szerzett (mutációk révén egy-egy törzsben kialakuló) rezisztenciát. Mindkét féle rezisztencia lehet konstitutív és (a hatóanyag által) indukálható is.

Paradox effektus (Eagle-effektus): a hatóanyag koncentrációjának növelése csökkenti annak antimikrobiális hatását (21. ábra). Oka nem minden esetben tisztázott, általában a stressz hatására indukálódó általános védekező mechanizmusokkal, illetve indukálódó rezisztencia faktorokkal van összefüggésben. Például β-laktámoknál az antibiotikum jelenlétében indukálódó β-laktamáz enzimek, echinocandinoknál a sejtfalkárosodás által indukált intenzív kitin szintézis okozhat paradox effektust.

21. ábra A paradox effektus hatása a mikrobák növekedésére növekvő hatóanyag koncentráció jelenlétében. A pirossal jelölt anyag esetben nem figyelhető meg paradox effektus. A feketével jelölt anyag esetében van paradox effektus. A MIC értéke ebben az esetben nagy, ezért (ha van rá lehetőség) érdemes a hatóanyag erősségét a MEC értékkel jellemezni.

Sejtfalszintézist gátló nem β-laktám antibiotikumok

Foszfonomicin

Elsősorban Streptomyces fajok (pl. Streptomyces fradiae) által termelt széles spektrumú antibiotikum, amit főleg húgyúti fertőzések kezelésére használnak. Felépítését tekintve (1R, 2S)1,2 epoxipropil-foszfonsav (22. ábra).

22. ábra A foszfonomicin szerkezete és bioszintézise.

Hatásmechanizmus, rezisztencia: mint foszfoenolpiruvát antimetabolit gátol minden PEP-függő folyamatot. A sejtek pusztulását elsősorban az okozza, hogy megakadályozza a PEP beépülését az UDP-N-acetil-glükózaminba (UDP-N-acetil-muraminsav szintézis), így gátolja a sejtfal monomerek képződését. A sejtekbe a glicerolfoszfát transzporteren keresztül jut be. Rezisztencia legkönnyebben e transzport rendszer inaktiválódásával alakulhat ki, de egyes fajokban az epoxid-csoport glutation-függő detoxifikációja is elég hatékony a rezisztencia kialakulásához. A termelő törzsek az intenzív foszfonomicin export mellett, foszfonomicin-foszfát és foszfonomicin-difoszfát képzésével tudják reverzibilisen inaktiválni a hatóanyagot. Bioszintézise PEP-ból indul ki (22. ábra). A szintézis út rövid, csak néhány lépésből áll, így a foszfonomicin heterológ expressziója könnyen megvalósítható. Előállítása – egyszerű szerkezetéből adódóan – jelenleg kémiai szintézissel történik.

Bacitracin

Bacillus fajok által termelt, Gram pozitív baktériumok (beleértve a meticillin rezisztens Staphylococcus aureus törzseket is) ellen hatásos ciklikus peptid antibiotikum. Emberre nézve is erősen toxikus, így elsősorban csak bőr és szem fertőzések kezelésére használják.

Hatásmechanizmus: a C55-izoprenil-PP defoszforileződését gátolja, és ezáltal megakadályozza a sejtfalszintézist. Rezisztencia legkönnyebben a bacitracinra is specifikus ABC-transzporterek segítségével alakul ki, melyek eltávolítják a bejutó antibiotikumot a sejtekből. A termelő törzsek rezisztenciájáért is elsősorban ezen efflux rendszerek felelősek. A Gram negatív fajok a külső membrán miatt természetes védelmet élveznek a bacitracinnal szemben. Bioszintézise NRPS segítségével történik. A bioszintézishez csak a primer anyagcserében megtalálható aminosavak szükségesek: Ile, Cys, Leu, Glu, Lys, Phe, Hys, Asp, Asn és a nem fehérje alkotó Orn (16. ábra). A D-aminosavakat (D-Glu, D-Orn, D-Phe, D-Asp) az enzimkomplex saját epimeráz doménjei hozzák létre és a cikláz domén alakítja ki a tiazolin gyűrűt is (Ile és Cys között). A peptid lánc záródásában egy láncközi Lys oldallánca és a láncvégi Asn karboxil-csoportja vesz részt. Előállítása többek között Bacillus licheniformis és B. subtilis fajokkal történik süllyesztett kultúrákban. A törzsfejlesztés elsődleges célja – ebben az esetben is – a szintézis út aktivitásának növelése (pl. a génklaszter klónozása és amplifikálása), a primer anyagcsere átállítása a megnövekedett aktivitású szintézis út kiszolgálására, a termelő törzsek rezisztenciájának növelése (pl. az efflux rendszert kódoló gének kópiaszámának növelésével).

Vankomicin

Actinobacteriumok által termelt, a Gram pozitív fajok, így a meticillin rezisztens Staphylococcus aureus törzsek ellen is hatásos peptid antibiotikum. Erősen toxikus emberre nézve, ráadásul csak intravénásan adható (a tápcsatornából nem szívódik fel), ezért akkor használják, ha más már nem segít. A vankomicin rezisztens törzsek növekvő száma miatt azonban ezen jelentősége is egyre csökken. Hatásmechanizmus, rezisztencia: a sejtfalszintézist gátolja azáltal, hogy kötődik a D-Ala-D-Ala dimerhez (23. ábra) és így megakadályozza az összeszerelt monomerek leválását a lipid hordozóról. A Gram negatív fajok a külső membrán miatt természetes védelmet (’intrinsic’ rezisztencia) élveznek a vankomicinnel szemben; a külső membránon nem jut át ez az antibiotikum. A Gram pozitív fajokban rezisztencia legkönnyebben úgy alakul ki, hogy egy vankomicin jelenlétében indukálódó enzim megváltoztatja a D-Ala-D-Ala oldalláncokat, pl. D-Ala-D-tejsav, vagy D-Ala-D-Ser-re, így az antibiotikum már nem tud megkötődni.

23. ábra A vankomicin szerkezete és kapcsolódása a D-Ala-D-Ala láncvéghez.

Rezisztencia mechanizmusa (24. ábra): a VanS transzmembrán fehérje (szenzor) érzékeli a vankomicin jelenlétét és aktiválja a regulátor fehérjét (VanR), ami a van operon átíródásához vezet. A VanH a piruvátból D-tejsavat hoz létre, amit a VanA D-alaninhoz kapcsol és ez a D-Ala-D-tejsav épül be a sejtfal-monomerekbe. A VanX az esetleg képződő D-Ala-D-Ala dimereket hidrolizálja, míg a VanY a monomerekbe beépült D-Ala-D-Ala-t bontja. A VanZ funkciója még nem ismert (Hughes, 2003). Hasonló folyamat teszi rezisztenssé a termelő törzseket is, de ott az érintett gének a vankomicin szintézis génklaszter részét képezik.

24. ábra A vankomicin rezisztencia indukálódásának szabályozása.

A vankomicin szintézise egy NRPS segítségével történik. Az alaplánc (lináris heptapeptid), több lépésben módosul (pl. keresztkötések alakulnak ki az aromásgyűrűk között citokróm P450-dependens monooxigenáz segítségével, haloperoxidázok klorid ionokat kapcsolnak az alapvázhoz, az alapváz cukoregységek egészül ki és több ponton metilálódik).

A peptidlánc egy Leu és egy Asn mellett nem fehérje alkotó aminosavakat, két β-hidroxi-Tyr-t (Tyr-ból alakul ki), két 4-hidroxi-fenilglicin-t (szintén Tyr-ból szintetizálódik) és egy 3,5-dihidroxi-fenilglicint (poliketid szintáz segítségével jön létre) tartalmaz (23. ábra). Az egyik β-hidroxi-Tyr és a két 4-hidroxi-fenilglicin a szintézis alatt az NRPS segítségével epimerizálódik. A vankomicint Amycolatopsis orientalis és néhány más Actinobacterium faj segítségével süllyesztett kultúrákban állítják elő. A speciális aminosavak szintézise és az alaplánc további módosításai miatt több mint 30 gén szükséges a vankomicin bioszintézishez (ráadásul a szintézis út génjeinek egy része még nincs azonosítva), ami megnehezíti a szintézis út klónozását, a kópiaszám növelését és a termék heterológ gyártását is.

β-laktámok

A β-laktám gyűrűt (savamid kötéssel záródó, négytagú gyűrű) antibiotikumok és β-laktamáz gátló szekunder metabolitok egyaránt tartalmazhatnak. A β-laktám antibiotikumokban a β-laktám gyűrű szerkezete a D-Ala-D-Ala dimer szerkezetéhez hasonlít (25. ábra). A β-laktám antibiotikumok irreverzibilisen képesek gátolni a D-Ala-D-Ala dimert felismerő enzimek (transzpeptidázok) működését, és ezen keresztül a sejtfalszintézis utolsó lépését, a keresztkötések kialakulását. Az antibiotikum a β-laktám gyűrű hidrolízisét követően irreverzibilisen kötődik az enzim aktív centrumához.

25. ábra Néhány, a természetben előforduló β-laktám vázas molekula szerkezete.

Rezisztencia: a Gram negatív fajok esetében a külső membrán védelmet nyújt számos (de nem az összes) β-laktám antibiotikum ellen (’intrinsic’ rezisztencia). Szerzett rezisztencia többféle képen is kialakulhat:

(1)   A külső membrán összetétele, illetve a sejtfal szerkezete megváltozik, így az antibiotikum nehezebben jut el a célpontjához.

(2)   A transzpeptidáz enzim túltermelődik, illetve az antibiotikum jelenléte β-laktámokra kevésbé érzékeny transzpeptidázok indukálódását váltja ki. A β-laktám antibiotikumot termelő baktériumokra gyakran jellemző ez a fajta rezisztencia.

(3)   Az antibiotikumot hatástalanító enzimek (b-laktamázok) termelése. Ez a leggyakoribb oka a rezisztenciának. A β-laktamázok, olyan módosult transzpeptidázok, melyek esetében az antibiotikum a β-laktám gyűrű hidrolízisét követően sem tud stabil kötést kialakítani az enzim aktív centrumával. A β-laktamáz inhibítorok olyan β-laktám molekulák, melyek ezen enzimeket képesek irreverzibilisen gátolni. Transzpeptidázt gátló hatásuk (sejtfalszintézis gátlás) rendszerint kicsi.

A β-laktám molekulák szerkezetük alapján lehetnek monobactam, penam, carbopenem, cephem és clavam vázúak (25. ábra).

Monobactam hatóanyagok

Az alapváz egyetlen (β-laktám) gyűrűből áll. Az ismertebb termelő fajok a Nocardia, Pseudomonas, Gluconobacter, Chromobacterium, Agrobacterium, Acetobacter nemzetségekből kerülnek ki. Gyakorlati szempontból egyik legjelentősebb képviselőjük a Chromobacterium violaceum által termelt aztreonam (25. ábra). A Gram negatív baktériumok, pl. a Pseudomonas aeruginosa, ellen is hatásos (képes átjutni a külső membránon), a legtöbb Gram pozitív, illetve anaerob faj transzpeptidázaihoz azonban csak gyengén kötődik. Egyes β-laktamázokkal szemben rezisztens. A tápcsatornából nem szívódik fel, ezért intravénásan adják. Az aztreonam bioszintézise eltér a klasszikus β-laktám szintézis (penicillin, cefalosporin) útvonaltól. Itt a β-laktám gyűrű Ser-ből alakul ki. Az iparban szintetikus úton állítják elő.

Carbopenem hatóanyagok

Az alapvázban a β-laktám gyűrűhöz egy telítetlen ötatomos gyűrű kondenzálódik. A fontosabb termelő fajok a Serratia, Erwinia, Streptomyces nemzetségekbe tartoznak. Elsőként izolált képviselőjük a Streptomyces cattleya által termelt thyenamycin (25. ábra). A legtöbb Gram negatív és Gram pozitív baktérium ellen is hatásos (széles spektrumú antibiotikum), a legtöbb β-laktamαzzal szemben rezisztens. A tαpcsatornαbσl nehezen szνvσdik fel. Rιszben ezιrt, rιszben amiatt, hogy csφkkentsιk a rezisztens tφrzsek kialakulαsαnak veszιlyιt, intravιnαsan adjαk. A thyenamycin bioszintιzise eltιr a klasszikus β-laktám szintézis útvonaltól. A β-laktám gyűrű Glu-ból és egy acetil-csoportból (acetil-CoA) alakul ki, a kéntartalmú oldallánc Cys eredetű. Az iparban szintetikus úton állítják elő.

Clavam vázas hatóanyagok

Az alapvázban a β-laktám gyűrűhöz egy oxigéntartalmú telített gyűrű kapcsolódik. Elsősorban Streptomyces fajok termelik. Egyes clavam vázas molekulák igen gyenge antibiotikumok, és nemcsak rezisztensek a β-laktamázokkal szemben, de inaktiválják is azokat. Ezen molekulákat, mint β-laktamáz inhibítorokat termelik a mikróbák, hogy a β-laktám antibiotikumaik hatékonyságát növeljék a rezisztens fajokkal szemben. Gyakorlati jelentőségük is ez: β-laktamázokra érzékeny antibiotikumokkal kombinálva adják, hogy az amúgy rezisztens törzseket is el tudják pusztítani. Legismertebb képviselőjük a Streptomyces clavuligerus által termelt clavulán sav (25. ábra). Amoxicillinnel (félszintetikus penicillin) együtt adják orálisan, az amoxicillinre rezisztens törzsek okozta fertőzések leküzdésére. A β-laktám gyűrű ebben az esetben egy Arg-ből (N atom) és egy glicerin aldehidből alakul ki. A clavulán savat fermentációs úton, leggyakrabban a Streptomyces clavuligerus segítségével állítják elő süllyesztett kultúrában.

Cephem vázas hatóanyagok

Az alapvázban a β-laktám gyűrűhöz egy telítetlen hatatomos, kéntartalmú gyűrű kondenzálódik (25. ábra). Cefamicinek – Streptomyces és más baktérium fajok (pl. Nocardia, Xanthomonas, Flavobacterium, Lysobacter) által termelt antibiotikumok. Cefalosporinok – gombák (Acremonium, Anixiopsis, Arachnomyces, Spiroidium, Scopulariopsis, Diheterospora, Paecilomyces) által termelt cephem vázas antibiotikumok. Legismertebb természetes képviselőjük a cefalosporin C, amelyet többek között az Acremonium chrysogenum termel. Bioszintézisük (26. ábra) kezdő lépését egy NRPS (ACV szintáz) végzi. Ez az enzim aktiválja, epimerizálja és kapcsolja össze az L-α-aminoadipinsavat (L-Lys-ből keletkezik), L-Cys-t és az L-Val-t egy tripeptiddé (d-L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D-valin; ACV tripeptid), melyből az izopenicillin N szintáz molekuláris oxigén segítségével alakítja ki penám vázat (izopenicillin N). Az izopenicillin N epimerizációt (izopenicillin N epimeráz) követően penicillin N-né alakul, amit a deacetilcefalosporin C szintáz/hidroxiláz alakít deacetilcefalosporin C-vé. A deacetilcefalosporin C egy O-karbamoil transzferáz, egy hidroxiláz és egy transzmetiláz aktivitásnak köszönhetően alakul cefamicin C-vé. Az Acremonium chrysogenumból ez utóbbi három lépést katalizáló enzim hiányzik, helyette egy acetiltranszferáz hozza létre a deacetilcefalosporin C-ből a cefalosporin C-t.

26. ábra A G penicillin, a cefalosporin C és a cefamycin C bioszintézise.

A cefalosporin C-t az iparban az Acremonium chrysogenummal állítják elő és félszintetikus cefalosporinok gyártására használják. A félszintetikus cefalosporinok szintéziséhez először 7-aminocefalosporin savat állítanak elő immobilizált penicillin aciláz segítségével. A 7-aminocefalosporin savat kémiai úton módosítják, majd az O-acetil oldalláncot szintén kémiai úton alakítják át. Penicillin aciláz felhasználásával lehetőség van közvetlenül a cefalosporin C módosítására is. Ilyenkor átfolyásos oszlopreaktorban nagy karbonsav, vagy karbonsavamid felesleg mellett az immobilizált aciláz végső soron transzacilezési reakciót hajt végre. A cefalosporin C elsősorban a Gram pozitív fajok ellen hatásos, bár megfelelő koncentrációban egyes Gram negatív fajokat is elpusztít. Néhány β-laktamázzal szemben rezisztens, és a tápcsatornából képes felszívódni, ezért orálisan is alkalmazható.

Az elsőgenerációs félszintetikus termékek (cefacetril, cefaloglicin, cefalotin stb.) viszonylag szűk spektrumúak, de hatásosak számos penicillináz termelő, meticillin érzékeny Staphylococcus és Streptococcus törzzsel, illetve egyes Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae és Proteus mirabilis törzsekkel szemben is. A második generációs cefalosporinok (cefaclor, cefonicid, cefuzonam, stb.) jelentősen szélesebb Gram negatív spektrummal rendelkeznek, megtartották hatékonyságukat a Gram pozitív kokkuszokkal szemben és nőtt a β-laktamázokkal szembeni rezisztenciájuk is. A harmadik generációs termékek (cefdinir, cefixime, cefteram, stb.) esetében tovább nőtt a Gram negatív spektrum és a β-laktamáz rezisztencia (nozokomiális fertőzések esetén gyakran használják); több képviselőjük képes átjutni a vér-agy gáton (meningitis kezelésére is alkalmasak), sőt a gonorrhea kezelésére is megfelelőek. Sok képviselőjük azonban csökkent aktivitást mutat a Gram pozitív fajokkal szemben. A negyedik generáció képviselőinél (cefclidine, cefoselis, cefpirome, stb.) tovább nőtt a β-laktamáz rezisztencia és ezek az első generációs termékekhez hasonlóan jó aktivitást mutatnak a Gram pozitív fajokkal szemben is.

Penám vázas hatóanyagok

Az alapvázban a β-laktám gyűrűhöz egy telített ötatomos, kén tartalmú gyűrű kondenzálódik. Mint végterméket, a penám vázas antibiotikumokat (penicillineket) csak egyes Ascomycota fonalas gombák (Penicillium, Aspergillus, Epidermophyton, Trichophyton, Polypaecilum, Malbranchea, Sartorya, Pleurophomopsis fajok) termelik. Bioszintézisük kezdő lépései megegyeznek a cefalosporinok, cefamicinek kezdő lépéseivel, de itt az izopenicillin N lényegesen már nem módosul. Egy aciltranszferáz segítségével az α-aminoadipil oldallánc cserélődik le a megfelelő karbonsavra (26. ábra).

Természetes penicillinek: a természetben is képződnek; a molekula oldalláncát (oldallánc prekurzor) a gomba állítja elő, és/vagy megtalálható a természetes élőhelyén:

(1)   Penicillin G (fenilecetsav az oldallánc prekurzor),

(2)   Penicillin F (hexénsav),

(3)   Dihidropenicillin F (hexánsav),

(4)   Penicillin K (oktánsav),

(5)   Penicillin X (p-hidroxi-fenilecetsav).

A fermentációs úton előállítható penicillinek a természetben nem képződnek, mert az oldallánc prekurzor a gomba élőhelyén nem fordul elő és a gomba sem tudja előállítani. Ugyanakkor, ha a fermentáció során biztosítjuk a gomba számára az oldallánc prekurzort akkor azt be tudja építeni a penicillin molekulába:

(1)   Penicillin V (fenoxiecetsav az oldallánc prekurzor),

(2)   p-Hidroxipenicillin V (p-hidroxifenilecetsav),

(3)   Butiltiometilpenicillin (ecetsav-bután tioéter),

(4)   Penicillin O (ecetsav-butén tioéter),

(5)     Penicillin S (ecetsav-klórbutén tioéter).

Félszintetikus penicillinek: A természetes, illetve fermentációs úton előállítható penicillinek származékai, melyeket biokonverzióval, illetve kémiai úton hoznak létre az oldallánc cseréjével. Az iparban elsősorban a G és V penicillint állítják elő Penicllium chrysogenum és néhány más gyakran szintén Penicillium chrysogenumként számon tartott Penicillium faj segítségével. A félszintetikus termékek esetében az oldalláncot cserélik le valamilyen másik komponensre. Ennek érdekében a fermentatív úton előállított G, vagy V penicillint előbb penicillin aciláz segítségével 6-aminopenicillinsavvá alakítják át és ezt alkilezik kémiai úton. A penicillin aciláz nemcsak az eredeti oldallánc eltávolítására használható fel, de az új oldallánc kialakítására is. A penicillin acilázt a saját penicillin aciláz génjét több kópiában tartalmazó Bacillus megatheriummal, vagy heterológ módon E. colival, B. subtilissel, ritkábban S. cerevisiaevel állítják elő. Szintén 6-aminopenicillinsavból állítják elő kémiai úton a sulbactam és tazobactam nevű β-laktamáz inhibítorokat.

A természetes penicillinek szűk spektrumúak, a Gram pozitív fajok ellen hatásosak, és β-laktamázokra érzékenyek. A G penicillin ráadásul savas pH-n bomlik, ezért szájon át nem adható. A félszintetikus származékok között széles spektrumú, Gram negatív fajok ellen hatékony, savstabil, β-laktamázok egy részével szemben rezisztens változatok is vannak. Pl. az amoxicillin: viszonylag szűk spektrumú, de egyes Gram negatív fajok ellen is hatásos félszintetikus antibiotikum. Előnye, hogy savstabil és könnyen felszívódik, ezért szájon át is adható. Minthogy β-laktamázokra érzékeny, ezért klavulánsavval együtt adják.

Fehérjeszintézist gátló antibiotikumok

Aminoglükozidok

Elsősorban Streptomyces (~mycin), illetve Micromonospora (~micin) fajok által termelt, Gram negatív és pozitív fajokkal szemben egyaránt hatásos, glikozidos kötéssel összekapcsolt aminocukrok. Ismertebb képviselőik: neomycin (Streptomyces marinensis), streptomycin (Streptomyces griseus), kanamycin (Streptomyces kanamyceticus), tobramycin (Streptomyces tenebrarius), gentamicin (Micromonospora echinospora) (27. ábra).

27. ábra A gentamicin szerkezete és a gentamicin szerkezetét módosító enzimek (rezisztencia faktorok) támadáspontja.

Hatásmechanizmus: a bakteriális riboszóma 30S, ritkábban 50S alegységéhez kapcsolódva megzavarják a ’proofreading’ funkciót (hibás fehérjék képződnek), zavarják a transzlokációt és a Gram negatív fajok esetében károsítják a külső membránt (feltehetőleg ez utóbbi felelős a sok esetben tapasztalható baktericid hatásért). A rezisztencia leggyakoribb okai:

(1)   A citoplazma membrán permeábilitása csökken a hatóanyagra nézve (pl. a megfelelő transzporterek inaktiválódása, módosulása miatt).

(2)   A riboszóma aminoglikozid kötőhelye változik meg (a 30S alegység esetében csak egyetlen kötőhely van). Egyes termelő törzsek egy 16 S rRNS metiltranszferázzal módosítják a riboszómájukat és intenzív transzporttal folyamatosan eltávolítják a termelt hatóanyagot.

(3)   Az antibiotikumot módosító enzimek (N-acetiltranszferáz, O-adeniltranszferáz, O-foszfotranszferáz) jelennek meg (ez a legfőbb oka a rezisztenciának) (27. ábra). A rezisztenciáért felelős géneknek nagy gyakorlati jelentősége van a biotechnológiában, mint szelekciós markergének.

Bioszintézisük glükóz-6-P-ból kiinduló, soklépéses (sok enzimet igénylő) folyamat. A kanamycin esetében például a génklaszter 24 fehérjét kódol. Az aminoglükozidok gyártása a megfelelő törzs felhasználásával süllyesztett kultúrákban történik, de mezőgazdasági és egyéb hulladékot hasznosító szilárd fázisú technológiák is ismertek. Törzsnemesítés: az antibiotikum termelés szorosan kapcsolódik a sejtek differenciálódásához; egyes morfomutánsok megnövekedett termelőképességgel rendelkeznek. A hagyományos módszerek mellett lehetőség van a teljes génklaszter klónozására és a kópiaszám növelésére is. Gyakran többféle termék is keletkezik, de a megfelelő gének inaktiválásával, módosításával a melléktermékek száma csökkenthető. Az antibiotikum heterológ szintézise szintén megoldható. Nehezen tenyészthető fajok antibiotikumainak előállítása iparilag kezelhetőbb Streptomyces fajokkal.

Makrolid antibiotikumok

Poliketid típusú, elsősorban a Gram pozitív fajok ellen hatásos antibiotikumok, melyek 14-16 tagú lakton-gyűrűből és az ahhoz kapcsolódó dezoxicukrokból (pl. dezózamin, kladinóz) állnak. Természetes képviselőik többek között az erythromycin (Saccharopolyspora erythraea), tilozin (Streptomyces fradiae), leukomycin (Streptomyces venequelae) (28. ábra).

28. ábra Az erythromycin szerkezete és szintézisének vázlata.

(lásd még a A poliketid szintázok működése, csoportosítása)

Hatásmechanizmus: a bakteriális riboszóma 50S alegységéhez reverzibilisen kötődve gátolják a peptidiltranszferáz működését. Rezisztencia elsősorban a riboszóma makrolidkötő helyének módosulásával, a 23S rRNS poszttranszkripcionális metilálódásával alakul ki. Az enzimatikus inaktiválás (észteráz, kináz aktivitások), illetve az ATP-függő efflux rendszerek aktiválódása ritkább. Bioszintézis: az alapváz ’processive’ módon működő PKS-I segítségével képződik, amit további enzimek módosítanak (glikozileznek). A PKS-I ismerete ebben az esetben is lehetővé teszi teljesen új molekulák létrehozását a modulok/domének módosításán keresztül (McDaniel és munkatársai, 1999). Ipari előállításuk a megfelelő Actinobacteria törzs segítségével süllyesztett kultúrákban történik (pl. erythromycin). A képződött terméket gyakran utólag módosítják (félszintetikus termékek; pl. erythromycinből clarithromycint hoznak létre). Egyes képviselőiket (pl. leukomycin) kémiai szintézissel állítják elő. A törzsfejlesztés elsődleges célja lehet a szintézis út aktivitásának növelése (pl. a génklaszter klónozása és amplifikálása) és a primer anyagcsere átállítása a megnövekedett aktivitású szintézis út kiszolgálására.

Tetraciklinek

Streptomyces fajok által termelt széles spektrumú, poliketid típusú antibiotikumok. A rezisztens törzsek elterjedése miatt ma már kevésbé hatásosak. Ismertebb természetes tetraciklinek: tetraciklin (Streptomyces aureofaciens), oxitetraciklin (Streptomyces rimosus), klórtetraciklin (Streptomyces viridifaciens) (29. ábra).

29. ábra Természetes tetraciklinek szerkezete.

Hatásmechanizmus: A bakteriális riboszóma 30S alegységéhez irreverzibilisen kötődve megakadályozzák az aminoacil-tRNS megkötődését a riboszómán. Rezisztencia háromféleképp is kialakulhat ellenük: megnövekedett efflux, enzimatikus inaktiválás (acetiltranszferáz aktivitás), vagy a riboszómákat a tetraciklinekkel szemben védő fehérjék megjelenése. Ez utóbbi fehérjék hatása többféle is lehet: a tetraciklinekhez kötődve megakadályozzák megtapadásukat a riboszómán; a riboszómához kötődve gátolják a tetraciklinek kapcsolódását a riboszómához; eltávolítják riboszómához kapcsolódott tetraciklineket. Bioszintézis: az alapvázat (6-metilpretetramid) egy PKS-II enzim komplex hozza létre 2-oxoszukcinamátból (L-Asp-ból keletkezik) és malonil-CoA-ból. Ezt követően további enzimek segítségével több lépésben módosul a megfelelő végtermékké. Előállításuk süllyesztett kultúrákban, a megfelelő Streptomyces törzs segítségével történik. A jól termelő törzseknek és az egyszerűen kivitelezhető fermentációnak köszönhetően gazdaságosan működő, mezőgazdasági hulladékokat (pl. földimogyoróhéj, kukoricacső) hasznosító szilárd fázisú fermentációk is kidolgozhatók. A képződött antibiotikumot gyakran félszintetikus termékek (pl. doxiciklin) előállítására használják.

Klóramfenikol

A Streptomyces venezuelae által termelt széles spektrumú, Gram pozitív és negatív fajok ellen is hatásos bakteriosztatikum (30. ábra).

30. ábra A klóramfenikol szerkezete és bioszintézisének vázlata.

A bakteriális riboszóma 50S alegységéhez kötődve gátolja a peptidiltranszferáz aktivitást. Rezisztencia háromféleképp is kialakulhat ellene: a membrán permeabilitása csökken a klóramfenikolra nézve, az 50S riboszóma alegység klóramfenikol kötőhelyeinek megváltozása, klóramfenikol aciltranszferáz enzim képződése. Bioszintézise az aromás aminosavak bioszintéziséhez kapcsolódik (sikiminsavból indul ki) (30. ábra). Az iparban kémiai szintézissel állítják elő; ez az első ipari léptékben kémiai úton előállított antibiotikum.

Pleuromutilin és pristinamycin

A fehérjeszintézist gátló antibiotikumok közül további két (három) molekulát említünk meg. A pleuromutilin Clitopilus passeckerianus (Pleurotus passeckerianus) és más Clitopilus fajok által termelt diterpén-típusú antibiotikum. Az 50S riboszóma peptidil transzferáz aktivitását gátolja.

A pristinamycin Streptomyces pristinaespiralis által termelt két komponensből álló elegy. Pristinamycin I egy makrociklikus poliketid, míg a Pristinamycin II egy nem riboszómális peptid antibiotikum. Mindkét hatóanyag a bakteriális fehérjeszintézis elongációs szakaszát gátolja. Külön-külön viszonylag gyenge bakteriosztatikus hatást mutatnak, kombinált alkalmazásuk azonban igen eredményes (szinergizmus). A szintézisükért felelős két génklaszter egy harmadik, poliketid génklaszterrel együtt egyetlen szuperklasztert alkotnak a genomban.

Forrásmunkák

Barredo, JL. (2005) Microbial processes and products. Humana Press, Totowa, N.J.

Goldman, G.H. and Osmani, S.A. (2008) The Aspergilli: genomics, medical aspects, biotechnology, and research methods. Taylor & Francis, Boca Raton.

Hofrichter, M. (2010) The mycota X. Industrial applications. Springer, Berlin.

Kadir, F., Hamers, M. and Ives, P. (2008) Production and downstream processing of biotech compounds. Pharmaceutical Biotechnology (Szerkesztők: Crommelin, D.J.A., Sindelar, R.D. and Meibohm, B.), Informa Healthcare USA, Inc., New York, oldalak: 49-65.

Lee, Y.K. (2003) Microbial biotechnology: principles and applications. World Scientific, New Jersey.

Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S. and Higton, G. (2006) Industrial microbiology: an introduction. MA Blackwell Science, Malden.

Zhang, L and Demain, A.L. (2005) Natural products: drug discovery and therapeutic medicine. Humana Press, Totowa, N.J.

Önellenőrzés 4

5. fejezet - Antimikotikumok, alkaloidok és pigmentek előállítása (Dr. Emri Tamás)

Antimikotikumok

Antimikotikumok (antifungális hatású anyagok) a gombák növekedését, differenciációját gátló, illetve a sejtjeiket elpusztító anyagok. A növények, baktériumok és maguk a gombák is igen nagy számban termelnek antifungális hatású molekulákat, melyek lehetnek szekunder metabolitok, enzimek, illetve egyéb fehérjék is. Gyógyszeripari jelentősége elsősorban az antifungális hatású szekunder metabolitoknak van. Az antifungális tulajdonságú enzimek (pl. kitinázok, β-1,3-glükanázok) a biológiai védekezésben (biokontroll, transzgénikus növények, lásd GM növények) jelentősek. A defenzin-szerű, kis molekulaméretű, antifungális fehérjék ígéretes kutatási területet jelentenek, ami a jövőben elvezethet humán terápiás, illetve mezőgazdasági célú felhasználásukhoz.

A gyógyászatban használt antifungális hatóanyagok száma lényegesen alulmúlja az antibiotikumokét. Nem véletlenül: a gombák, mint eukarióta szervezetek sejtjei sokkal jobban hasonlítanak az emberi sejtekre, mint a baktériumoké. Ebből adódóan az antifungális hatású molekulák gyakran az emberi szervezetre is mérgezőek, ami korlátozza a humán terápiában való alkalmazhatóságukat (Video 1 és Video 2).

Video 1 Humán keratocita sejttenyészet időbeli változása nem toxikus, kis moltömegű antifungális fehérje hozzáadását követően. A felgyorsított felvételen jól nyomonkövethető a sejtek szaporodása (eTox munkacsoport, Debreceni Egyetem).

Video 2 Humán keratocita sejttenyészet időbeli változása toxikus szekunder metabolit hozzáadását követően. A felgyorsított felvételen jól nyomonkövethető a sejtek pusztulása a metabolit hozzáadását követően (eTox munkacsoport, Debreceni Egyetem).

Fontosabb antifungális szekunder metabolitok: polién antimikotikumok, grizeofulvin, echinocandinok. Az antifungális terápiában szintén jelentős azolok (pl. imidazol-, triazol-, szulfonazol-származékok; lanoszterol 14 α-demetiláz inhibítorok), allilaminok (szkvalén epoxidáz inhibítorok), illetve flucitozin (a gomba sejtekben 5-fluorouridintrifoszfáttá, illetve 5-flourodeoxiuridinmonofoszfáttá alakuló RNS és DNS szintézist gátló hatóanyag) szintetikus antifungális molekulák. A sztatinokat – bár antifungális hatásúak – a vérkoleszterin szint csökkentésére használják.

Polién antifungális hatóanyagok

Streptomyces fajok által termelt poliketid típusú antifungális (fungicid) hatású hatóanyagok. Nemcsak a humán terápiában, de raktári kártevők megfékezésére és élelmiszerek tartósítására is használják. Ismertebb képviselőik: nystatin (Streptomyces noursei), amfotericin B (Streptomyces nodosus), natamycin (Streptomyces natalensis), filippin (Streptomyces filipinensis). Nagyméretű, hidrofób és hidrofil láncrésszel is rendelkező lakton-típusú molekulák (14. ábra). Hatásmechanizmus, rezisztencia: a polién antifungális szerek a membrán ergoszterol tartalmával kapcsolatba lépve (a hidrofób láncrész köti a szteroidot) hidrofil csatornákat alakítanak ki, ami elsősorban a K⁺ homeosztázis felborulásával vezet a sejtek pusztulásához. A csökkent ergoszterol tartalom, megváltozott szterol tartalom (ergoszterol helyett lanoszterol), az ergoszterolt kívülről elfedő (maszkírozó) fehérjék megjelenése vezet leggyakrabban rezisztencia kialakulásához. Egyetlen adat van arról, hogy egy amfotericin B-t módosító extracelluláris enzim termelése okozott rezisztenciát egy dermatofiton gombában. Bioszintézisük (14. ábra): az alapvázat egy processzív módon működő PKS I hozza létre. A nystatin esetében a PKS I hat gén terméke. Ez alakítja ki a telített láncrészeket (a megfelelő modulok ilyenkor ketoreduktáz, dehidratáz és enoilreduktáz domént is tartalmaznak), a gyűrű konjugált kettőskötést tartalmazó részét (a megfelelő modulok ketoreduktáz és dehidratáz domént tartalmaznak, enoilreduktáz domént nem), a hidroxil csoportokat (a dehidratáz domén hiányzik a megfelelő modulokból), az oxo-csoportot (nincs láncmódosító domén), a metil-csoportokat (malonil-CoA helyett metil-malonil-CoA felhasználása láncnövelésre) és a szintézis végén az utolsó modul tioészteráz doménje felelős a lakton-gyűrű kialakításáért. Ekkor jön létre az tetrahidropirán-gyűrű az oxo- és egy hidroxil-csoport kapcsolódásával. Az alapváz több lépésben módosul: az egyik metil csoport egy monooxigenáz segítségével karboxil-csoporttá oxidálódik, az egyik hidroxilhoz mikózamin kapcsolódik (GDP-mikózamin az aktivált forma) és egy új hidroxil-csoport jön létre egy másik monooxigenáz segítségével. A nystatin génklaszter mintegy 20 gént tartalmaz: 6 kódolja a PKS I-et; 3 gén felelős az alapváz módosításáért; 2 gén (legalább) a mikózamin képződésében vesz részt (mannózból alakul ki); egy gén felelős a szekrécióért (ABC transzporter); 4 gén szabályozó fehérjét kódol. A többi gén funkciója nem ismert. Ipari előállításuk a megfelelő Streptomyces törzs segítségével süllyesztett kultúrákban történik.

A törzsfejlesztés célja lehet:

(1)   A szintézis út aktivitásának növelése (pl. a teljes génklaszter klónozása és kópiaszámának növelése révén).

(2)   Az anyagcsere átállítása a megnövekedett aktivitású szintézis út kiszolgálására (’metabolic engineering’), vagy a génklaszter heterológ expresszáltatása egy már jól bevált termelő törzsben.

(3)   A melléktermékek (a molekula nem kívánt változatai) képződésének visszaszorítása (a génklaszter egyes génjeinek inaktiválása/aktiválása esetleg módosítása segítségével).

A poliketid szintáz domének és modulok ismerete lehetővé teszi, hogy teljesen új típusú poliéneket szintetizáljunk: új modulok építhetők be, illetve távolíthatóak el; a modulok domén szerkezete megváltoztatható stb., így megváltoztatható a molekula mérete, illetve egy-egy adott ponton módosítható szerkezete is (pl. metil-, oxo- és hidroxil-csoport, illetve kettőskötés kialakítása, megszüntetése). Az alapvázat módosító enzimeket kódoló gének lecserélésével (pl. ’molecular breeding’) szintén új termékeket lehet létrehozni.

Grizeofulvin

Penicillium griseofulvum és több más Penicillium (pl. P. nigricans, P. patulum, P. utricae) faj által termelt fungisztatikus hatású poliketid molekula (31. ábra).

31. ábra A grizeofulvin szerkezete és bioszintézisének vázlata.

Hatásmechanizmus, rezisztencia: a α- és β-tubulinhoz kötődve gátolja a poláris orsótest működését és a sejtosztódást, de befolyásolja a citoplazmában lévő mikrotubulusok működését is. Igen hatásos a Dermatophytonok okozta fertőzések ellen részben, mert e gombák rendelkeznek a felvételéhez szükséges transzportrendszerekkel, részben, mert az emberi szervezetben, a keratingazdag régiókban (pl. bőr) dúsul fel. Rezisztencia leggyakrabban a felvételéhez szükséges transzport rendszerek inaktiválódásával és efflux rendszerek aktiválódásával valósul meg. A termelő törzsekre is ez utóbbi jellemző. Az alapváz bioszintézisért egy iteratív módon működő PKS I (6-metilszalicilsav szintáz) felelős. Az alapváz több lépésben módosulva alakul grizeofulvinná (számos melléktermék képződése közben). A gyártás süllyesztett kultúrákban, esetenként olcsó, szilárd fázisú fermentációval történik, a megfelelő Penicillium törzs felhasználásával. A törzsnemesítés célja a szintézis út aktivitásának növelése, az ezt kiszolgáló primer anyagcsere kialakítása, a termelő törzs rezisztenciájának növelése és a grizeofulvin típusú melléktermékek eliminálásán túl a gomba által termelt egyéb (toxikus, vagy allergén) szekunder metabolitok (pl. patulin, penicillin) képződésének megakadályozása.

Echinocandin típusú antifungális anyagok

Gombák által termelt fungicid (pl. Candida fajok ellen), fungisztatikus (pl. Aspergillusok ellen) hatású antimikotikum. Ismertebb képviselői: echinocandin B-D (A. rugulosus), aculeacin A-G (A. aculeatus), mulundocandin (A. sydowi), sporiofungin A-C (Cryptosporyopsys sp.), „katekol-szulfát” echinocandinok (pl. Coleophoma empetri) valamint a pneumocandin A-E (Glarea lozoyensis). Szerkezetűket tekintve ciklikus hexapeptidek, melyekhez egy zsírsavlánc kapcsolódik (32. ábra). A hexapeptid gyűrű fehérje alkotó aminosavak (pl. Ser, Thr) mellett, hidroxilezett és/vagy metilezett Pro-t, Gln-t, Orn-t és homoTyr-t is tartalmazhat; a gyűrű a (dihidroxil)-Orn δ-amino csoportján keresztül záródik. A (dihidroxil)-Orn α-amino csoportjához kapcsolódik a zsírsav lánc. Egy-egy faj rendszerint többféle echinocandin változatot is termel, melyek leggyakrabban az aminosavak hidroxil-csoportjainak számában térnek el egymástól. A hexapeptid gyűrűhöz kapcsolódó zsírsavlánc felépítése és konformációja jelentősen befolyásolja a molekula antifungális hatását és toxicitását.

32. ábra Az echinocandin B szerkezete. Az echinocandin C esetében a homotirozinhoz csak egyetlen hidroxil-csoport kapcsolódik, míg az echinocandin D esetében az Orn két hidroxil-csoportja is hiányzik.

Hatásmechanizmus, rezisztencia: a β-1,3-glukán szintáz inhibítorként a gombák sejtfalszintézisét gátolják. Rezisztencia kialakulhat a β-1,3-glukán szintáz túltermelésével, a β-1,3-glukán szintáz echinocandin érzékenységét csökkentő mutációkkal, illetve a sejtfal kitin tartamának növekedésével (a β-1,3-glukán kitinnel történő helyettesítése). Az echinocandinok jelenlétében indukálódó kitin szintézis fontos része a termelő törzs echinocandin rezisztenciájának is. Bioszintézisük egy nem riboszómális peptid szintáz (NRPS) segítségével történik. A NRPS kapcsolja össze az aminosavakat és acilezi az Orn α-amino csoportját. Az alapváz részben utólag hidroxileződik oxidázok segítségével, részben már elve hidroxilezett aminosavakat épít be az NRPS a hexapeptidbe. Meglepő módon a homotirozin és a Lys-ből szintetizálódó metil-Pro képződéséhez szükséges gének nem képezik részét az echinocandin génklaszternek. Az echinocandin előállítása süllyesztett kultúrákban történik. A szintézis út génjeinek (beleértve a speciális aminosavak és zsírsav oldalláncok szintéziséért felelős géneket is) azonosítása és funkciójának feltárása az első lépés a megfelelő túltermelő törzsek kialakításához. A gyártás költségeit a főtermékhez nagyon hasonló szerkezetű melléktermékek (32. ábra) képződésének visszaszorítása, illetve a downstream processing során történő eltávolítása alapvetően meghatározza. A termelő törzsek sokféle biológiailag aktív szekunder metabolitot (pl. mikotoxinok) is szintetizálnak, ezek eliminálása (a megfelelő gének deléciója) szintén fontos része a költséghatékony gyártásnak. A törzsnemesítés célja a termelő törzs rezisztenciájának növelése is.

A természetes echinocandinokat magas toxicitás jellemzi, ezért a gyógyászatban félszintetikus változataikat használják (pl. az anidulafungint echinocandin B-ből, a caspfungint pneumocandin B0-ból állítják elő).

További antifungális metabolitok

A Streptomycesek által termelt allózamidin (oligoszacharid analóg) és egyes gombák (Gliocladium fajok) által termelt argadin és argifin (nem riboszómális peptidek) mint kitináz gátlók lehetnek hatékonyak a gombák ellen. A tunicamycin (Streptomyces iysosuperficus) és a nikkomycin Z (Streptomycestendae), mint kitin szintáz inhibítorok (nukleozid analógok) hatékony antifungális szernek bizonyultak, különösen echinocandinkkal való kombinált terápiában. Sok fonalas Ascomycota termel defenzin-szerű, kisméretű, bázikus antifungális fehérjéket (AFP -Aspergillus giganteus, ANAFP - Aspergillus niger, NAF - Penicillium nalgiovense, PAF – Penicillium chrysogenum), melyek a sejtek polarizált növekedését gátolják és a jelátviteli folyamatokat megzavarva apoptózist váltanak ki az arra érzékeny, elsősorban fonalas gombákban. Olcsó előállíthatóságuk (egyetlen gén termékei) és alacsony toxicitásuk, antigenicitásuk miatt ígéretes jövőbeni termékek lehetnek (Hegedűs és munkatársai, 2011).

Sztatinok – koleszterintszint csökkentő metabolitok

Poliketid típusú molekulák; a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reduktáz kompetitív inhibítorai, így gátolják a gombák ergoszterol szintézisét (antifungális hatás) és a humán koleszterol szintézist is. Bár a mikrobák, mint antifungális szert termelik a gyógyászatban a vérkoleszterin szint (LDL koleszterin) csökkentésére használják. Ismertebb természetes sztatinok: lovasztatin (Aspergillus terreus, Monascus rubere), mevastatin (Penicillium citrinum, P. brevicompactum) (33. ábra).

33. ábra Természetes és félszintetikus sztatinok szerkezete.

Bioszintézisük két poliketid szintáz segítségével történik. A lovasztatin esetében az LNKS (lovasztatin nonaketid szintáz – ’iterative’ PKS I) hozza létre az alapvázat, amely több lépésben monacolin J-vé alakul. A gyűrű záródásához (az LNKS megfelelő működéséhez) szükség van a lovC által kódolt ciklázra is. A másik PKS (LDKS -lovasztatin diketid szintáz) hozza létre a butirátot, amely metileződést követően (2-metil-butirát) a LovD (transzferáz) segítségével kapcsolódik a monacolin J-hez létrehozva a lovasztatint (15. ábra). Előállításuk süllyesztett kultúrában rendszerint fed-batch fermentációval történik. A törzsnemesítés célja a szintézis út aktivitásának növelése, az ezt kiszolgáló primer anyagcsere kialakítása, a termelő törzs rezisztenciájának növelése (a sztatinok szekréciójáért felelős transzporterek aktivitásának növelése), a reakcióút melléktermékeinek eliminálásán túl a gomba által termelt egyéb (toxikus, vagy allergén) szekunder metabolitok képződésének megakadályozása. A gyógyászatban a természetes sztatinok félszintetikus származékait (szimvasztatin, pravasztatin) (33. ábra), illetve a természetes sztatinok szerkezete alapján tervezett, szintetikus úton is gazdaságosan előállítható 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reduktáz inhibítorokat (szintetikus sztatinok, pl. atorvastatin) használják. A szimvasztatint lovasztatinból hozzák létre: alkalikus, vagy enzimatikus hidrolízissel (pl. Emericella unguis észteráz) távolítják el a metil-butirát oldalláncot (lovasztatinból monacolin J keletkezik), majd kémiai, vagy biokonverziós úton acilezik az alapvázat. A biokonverziós acilezéshez a LovD-t heterológ módon expresszáló E. coli sejteket, illetve Actinobacteria törzseket (pl. Streptomyces roseochromogenes) használnak. A mevasztatint élősejtes biokonverzióval alakítják pravasztatinná egy citokóróm P450-dependens monooxigenáz segítségével. Többnyire Actinobacteria törzseket (pl. Streptomyces carbophylus) használnak.

Alkaloidok

Erős fiziológiai hatást mutató, összetett szerkezetű, nitrogéntartalmú szerves vegyületek (gyakran aromásak és bázikusak), melyeket növények, gombák, baktériumok és ritkábban (gerinctelen) állatok is termelhetnek. Előállításuk lehetőségei:

(1)   Szántóföldi kultúrában termesztett növényekből izolálják (pl. ICN Alkaloida: morfin izolálása száraz mákgubóból és morfinszármazékok előállítása – magyar világszabadalom alapján).

(2)   Alkaloid termelő mikroorganizmusok segítségével termelik meg fermentációs úton, vagy más módon (pl. ergot alkaloidok - fermentáció, illetve szkleróciumok gyűjtése és a hatóanyag tartalmuk kinyerése).

(3)   Kémiai szintézis.

Új stratégiák:

(1)   Transzgénikus növények (pl. dohány) segítségével állítják elő az alkaloid tartalmú biomasszát szántóföldi kultúrában. Nagyobb a kihozatal; és a nehezen termeszthető növények alkaloidjai is előállíthatóak így.

(2)   Az alkaloidok szintézisében résztvevő géneket mikroorganizmusokban expresszáltatják (pl. benzil-izokinolin alkaloidok gyártása növényi, illetve gomba géneket expresszáltató E. coli, illetve S. cerevisiae törzsekkel). A transzgénikus növényeket tiltó országokban is alkalmazható eljárás. A megfelelő fermentációs technológia birtokában igen nagy volumenű gyártást tesz lehetővé.

Ergot alkaloidok előállítása

A Claviceps purpurea (anyarozs)szkleróciuma nagy mennyiségben tartalmaz ergot alkaloidokat. A Claviceps purpurean kívül sok más Ascomycota, Basidiomycota és Zygomycota faj (köztük Aspergillus és Penicillium fajok is) és néhány növény is termel ergot alkaloidokat. A szklerócium száznál is több biológiailag aktív vegyületet termel, amelyek között toxikusak is vannak (ergotizmus). Nem alkaloid típusú komponensek többek között a különféle kéntartalmú hisztidin-származékok (pl. ergithionein), speciális zsírsavak, indolditerpének, antrakinon-karbonsavak, ergochrom pigmentek. Az ergot alkaloidok az indol-alkaloidok közé tartozó ergolin-származékok (34. ábra). Két fő típusuk van: lizergsav-származékok (peptid ergot alkaloidok, lizergsavamid alkaloidok) és clavin-alkaloidok (pl. clavin, agroclavin, elymoclavin).

34. ábra Az ergot alkaloidok szerkezete.

Az ergot alkaloidok simaizom-összehúzó hatásúak. Centrális és periferiális vérzések csillapítására, illetve a méhösszehúzódások erősítésére (szülészeti céllal) használják. Jelentősége van a migrén és a Parkinson-kór kezelésében is. Szerkezetük hasonlít a szerotonin, dopamin és epinefrin szerkezetéhez, így azok receptoraihoz kötődve hatnak. Bioszintézisük (35. ábra) sokgénes folyamat. A szintézis út elágazó, így többféle termék is keletkezik egy időben, sőt gyakran a közti termékek is megjelennek a fermentlében. A szintézis Trp-ból indul. Az első lépést a 4DMAT szintáz (4-dimetilalliltriptofán szintáz) katalizálja. A szintézis út fontos köztes termékei: agroclavin (a szintézis út első ergot alkaloidja, a clavin alkaloidok mindegyike ebből keletkezik), elymoclavin (az agroclavin hidroxileződésével jön létre, oxidálódva lizergsavvá alakul), lizergsav (ebből indul ki a lizergsav amidok bioszintézise és a peptid ergot alkaloidok szintézise is). A peptid ergot alkaloidok szintézisében egy NRPS vesz részt. Az NRPS 4 modulból áll, a lizergsavhoz 3 aminosavat kapcsol. Az első Ala, Val, vagy aminobutirát, a második Phe, Val, Leu, Ile, homoleucin, vagy aminobutirát, a harmadik mindig Pro. Az NRPS végzi a tripeptid lánc kondenzált gyűrűrendszerré történő zárását is.

35. ábra Az ergotamin bioszintézisének vázlata.

Az ergot alkaloidok mikrobiológiai úton történő előállításának lehetőségei: Claviceps purpureaval mesterségesen fertőzött rozs-, illetve rizsföldekről (Ázsiában gyakran búza-rizs hibrideket használnak) a terméssel együtt az alkaloid tartalmú szkleróciumokat is begyűjtik és belőlük izolálják az alkaloidokat. Alkaloid-termelő szaprofita fajokkal fermentációs úton állítják elő a lizergsavat (pl. a szaprofita Claviceps paspali, C. fusiforms fajokat, illetve a C. purpurea szaprofita módon is jól növő törzseit, de Aspergillus, Penicillium fajokat is használnak erre a célra). A törzsnemesítés fontosabb céljai:

(1)   A kihozatal növelése: a szintézis út legalább egyes génjeinek amplifikálása, a primer anyagcsere átállítása az intenzív alkaloid szintézis kiszolgálására.

(2)   A melléktermékek eliminálása: a szintézis út oldalelágazásainak megszüntetése (pl. a kérdéses gének inaktiválásával); az intermedierek akkumulálódásának és szekréciójának megakadályozása (pl. az intermedier továbbalakításáért felelős gének túltermeltetésével).

(3)   Az előállítani kívánt termék (rendszerint a D-lizergsav) hatékony szekréciójának biztosítása.

Alternatív megoldások: a megfigyelések szerint az alkaloid termelés növelhető a sejtek immobilizálásával (pl. a hifák Ca-alginát gélbe ágyazásával). Az immobilizálás feltehetőleg a parazita növekedés körülményeit imitálja. A legújabb kutatások szerint az intenzív alkaloid termelés a heterokarionos hifákhoz kötődik (maguk a szkleróciumok is heterokarionosak), így heterokarionos tenyészetek kialakítása szintén növelheti a kihozatalt.

Gomba eredetű pigmentek

A növények mellett sok gomba és baktérium (pl. sok Zygomycota és bazidiumos élesztő, Streptomyces, Mycobacterium, Pseudomonas, Micrococcus, Mycobacterium, Chlorobacterium) termel karotenoid típusú vegyületeket, melyek sárgás-narancssárgás színt kölcsönöznek nekik. Ipari szempontból legjelentősebb a β-karotin és az asthaxantin (36. ábra).

36. ábra A β-karotin és az asthaxantin szerkezete és bioszintézisük vázlata.

A β-karotin felhasználása:

(1)   élelmiszerszínezék, kozmetikai szerek színezéke,

(2)   élelmiszeripari, kozmetikai tartósítószer (antioxidáns),

(3)   szájon át szedhető bőrbarnító (a bőrben halmozódik),

(4)   funkcionális élelmiszeradalék (antioxidáns hatása miatt csökkenti az érrendszeri és rákos megbetegedések kialakulásának kockázatát; az A vitamin prekurzora),

(5)   takarmányadalék (baromfik takarmányába keverve fokozza a tojás sárga színét).

Hátránya: az emberi szervezetben A-vitaminná alakul, ezért nagy koncentrációban toxikus lehet. A háziállatok esetében ez a veszély lényegesen kisebb.

Az astaxanthin felhasználása: az emberi szervezetben nem alakul A-vitaminná, így nagy mennyiségben sem toxikus. Az állati szervezetekben is jól akkumulálódik. Elsősorban, mint ételszínezéket, illetve takarmány kiegészítőt (pl. lazac, baromfi, díszmadarak) használják. A β-karotin és asthaxantin zömét szintetikus úton állítják elő. A nyomokban visszamaradó reagensek azonban az élelmiszeripari, vagy kozmetikai felhasználást megnehezítik ezért az utóbbi években előtérbe került a mikrobiális termelés is. A karotinoidok bioszintézise a szteroid bioszintézishez hasonlóan dimetilallil-PP (DAPP) és 3-izopentenil-PP egységekből indul ki. A farnezil-PP szintáz 1 DAPP-ot és 2 3IPPP-ot kapcsol össze két lépésben (geranil-PP köztiterméken keresztül). A geranilgeranil-PP szintáz egy további 3IPPP-ot kapcsol a farnezil-PP-hoz. A fitoén szintáz 2 geranilgeranil-PP-ot kapcsol össze. A fitoén deszaturáz alakítja ki a konjugált kettőskötés-rendszert. A fitoén β-cikláz hozza létre a láncvégi két gyűrűt. Az így létrejött β-karotin két lépésben alakul asthaxantinná: Az első lépést a β-karotin hidroxiláz (CytP450-függő monooxigenáz) a másodikat egy β-karotin ketoláz katalizálja (36. ábra). A legígéretesebb β-karotin termelők a Mucorales rendbe tartozó Zygomycoták: Blakeslea trispora, Choanephora, Mucor, Parasitella, Phycomyces, Pilaria. Alternatívát a Dunaliella salina és D. bardavil zöld mikroalgák jelentenek, melyek fermentatív úton is tenyészthetők, illetve mesterséges tavakban is elszaporíthatók. Az asthaxantin mikrobiológiai gyártása megvalósítható a Haematococcus pluvialis algával fermentorban, megfelelő megvilágítás biztosítása mellett. Ritkábban tengeri rákokból, illetve kagylókból vonják ki. Ígéretes alternatívát a Phaffiarhodozyma, illetve Xanthophyllomyces drendrorhous bazidiumos élesztőkkel történő fermentáció jelent.

Fejlesztési lehetőségek:

(1)   A szintézis gének azonosítása, a kópiaszám növelése.

(2)   ’Metabolic engineering’ (a primer anyagcsere átállítása a megnövekedett aktivitású szintézis út támogatására).

(3)   Heterológ karotenoid termelés megvalósítása könnyen tenyészthető ipari élesztőkben.

(4)   Új termékek (pl. karakteresebb szín, jobb akkumuláció) izolálása és a szintézis út génjeinek heterológ expressziója. Új termékek létrehozása ’molecular breeding’ technikával (Schmidt-Dannert és munkatársai, 2000).

Forrásmunkák

Barredo, JL. (2005) Microbial processes and products. Humana Press, Totowa, N.J.

Goldman, G.H. and Osmani, S.A. (2008) The Aspergilli: genomics, medical aspects, biotechnology, and research methods. Taylor & Francis, Boca Raton.

Hofrichter, M. (2010) The mycota X. Industrial applications. Springer, Berlin.

Kadir, F., Hamers, M. and Ives, P. (2008) Production and downstream processing of biotech compounds. Pharmaceutical Biotechnology (Szerkesztők: Crommelin, D.J.A., Sindelar, R.D. and Meibohm, B.), Informa Healthcare USA, Inc., New York, oldalak: 49-65.

Lee, Y.K. (2003) Microbial biotechnology: principles and applications. World Scientific, New Jersey.

Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S. and Higton, G. (2006) Industrial microbiology: an introduction. MA Blackwell Science, Malden.

Zhang, L and Demain, A.L. (2005) Natural products: drug discovery and therapeutic medicine. Humana Press, Totowa, N.J.

Önellenőrzés 5

6. fejezet - Az élelmiszer-alapanyagok összetételének genetikai módosítása (Dr. Pusztahelyi Tünde)

A genetikailag módosított organizmusok (GMO) olyan szervezetek, amelyek eltérő fajok DNS-ét tartalmazzák a rekombináns DNS technológia segítségével beépítve, a természetben elő nem forduló módon. Ezeket a szervezeteket más néven transzgénikus, genetikailag módosított (GM) szervezeteknek is nevezzük. Bármilyen élőlény lehet GMO: növények, állatok, mikroorganizmusok. Mindezen módosított élőlényeknek a leggyakoribb alkalmazását napjainkban a mezőgazdasági hasznosítás, ill. a gyógyszeripari alkalmazás jelenti.

Jelenleg nincs engedélyezve GM mikroorganizmus, mint élelmiszer. Ugyanakkor az élelmiszeripar számára jelentős mennyiségű élelmiszer adalék, savak, enzimek termelésére alkalmazzák a GM mikroorganizmusokat. Jelenleg nincs még forgalomban GM hal, ugyanakkor folyamatban van a kutatása. Jelenleg nincs forgalomban GM vágóállat és szárnyas, de ezek alkalmazása kisebb kockázatot jelentene, mint a mikroorganizmusoké. Elfogadottan, világszerte jelentős mennyiségű növényi eredetű GM élelmiszer van forgalomban (James, 2009).

A GMO termelésére, termesztésére szigorú, és jelentősen eltérő a szabályozás a Föld egyes részein. A termelésben (elsősorban a növényi GMO vonatkozásában) az USA jár elől, míg az EU szigorúan szabályozza a GMO termelését és forgalmazását (Európai Unió). Hat EU tagország él a jogával, hogy korlátozza, vagy tiltsa a GMO alkalmazásokat: Ausztria, Franciaország, Görögország, Magyarország, Németország és Luxemburg. Magyarország részvétele a termelésben nem jelentős, ugyanakkor a GM organizmusok kutatása nálunk is folytonos. GM alapanyagot tartalmazó élelmiszer Magyarországra is eljut (Toronyi, 2010), ezért az élelmiszerek idegen DNS, ill. idegen eredetű fehérje tartalmának vizsgálata egyre nagyobb jelentőséget nyer (37. ábra).

GM növények

Világszerte számos elérhető GM növény létezik (Európai Unió) ezek jó része élelmiszer: kukorica, szója, kelbimbó, paradicsom, cukorrépa, papaya, burgonya, káposzta, cukornád, rizs, zab, bors; vagy ipari növény, pl. len, gyapot, káposztarepce, dohány; de a dísznövények is alanyai a GM technológiának, pl. szegfű. Néhány további növény még nem jutott ki a nagyüzemi termelésbe, csak kísérletes körülmények között engedélyezett: búza, komló, szőlő, banán, ananász, sárgarépa, hagyma, zeller. A genetikai módosításokat történetileg és az elérendő célok alapján három fő vonalra tagolhatjuk. Az un. „első generációs” GMO képzésének elsődleges célja a rovar-, betegség- vagy vírusrezisztencia beépítése. Ennek eredményeképp az ipari alkalmazásnál a kisebb vegyszer felhasználást és a csökkenő pénzigényű termelést tűzték ki célul. A „második generációs” genetikai módosítások elsősorban a termények minőségi és mennyiségi jellegeinek változtatását irányozták: nagyobb fehérje tartalom, módosított zsírsav összetétel, módosított szénhidrátok, módosított íz, ásványi anyagok, vitaminok termelésének beépítése, ill. a termelés növelése, stressz elleni védelem, illetve a késleltetett érés érdekében. A „harmadik generáció” kifejezetten az egészségügyi hatás elérésére módosított termékeket kíván létrehozni, pl. funkcionális élelmiszer, probiotikum, vagy alternatív génterápia céljára.

A rovarrezisztencia kialakítása

A rovarrezisztencia beépítését elsődlegesen a Bacillus thuringiensis enterotoxinok alkalmazása jelentette. A Bacillus thuringiensis sokféle toxint termel. Ezek egy része a Cry proteinek – delta-endotoxinok (Bravo és mtsai, 2007). Ezek a sporuláció során termelődnek, specifikus kötőhelyhez kapcsolódó pórusképző fehérjék (38. ábra), így rombolják az ionáramlást a célsejtekben. Az emlősökben nincs specifikus kötőhely, ezért nem toxikus a magasabbrendű élőlényekre. Az egyes toxin változatok eltérő specificitással rendelkeznek a kötőhelyek változatosságának megfelelően (Augustnyiak és munkatársai, 1997).

A VIP3A (Vegetative Insecticidal Protein) B. thuringiensis fehérje a vegetatív életszakaszban és a sporuláció során termelődik. A Cry proteinekhez hasonló mechanizmus, de más kötőhely jellemző rájuk, és más jellegű az ioncsatorna képzése. Nem hatnak a Lepidoptera–n kívül egyéb gerinctelenekre. Az egyes gazdasági növényekbe a fő kártevő meghatározása után igyekeztek annak a rovar fajnak megfelelő specificitású toxin termelését beültetni. A Bt kukorica (MONSANTO) az egyik legnagyobb mennyiségben termelt növényi termék. Az alkalmazott Cry fehérje célorganizmusa aDiabrotica virgifera kukoricabogár.

A szója tripszin inhibítor (SBTI, Soybean Trypsin Inhibitor) gén beépítése szintén rezisztenssé teheti a növényeket a rovarokkal szemben. Az SBTI az emésztő enzimek (endopeptidázok) gátlásával gátolja a rovarok emésztését és a pusztulásukat okozhatja. A szójában természetesen jelenlévő inhibítor miatt a szójabab humán fogyasztása esetén feltétlenül szükséges a felhasználás előtti főzés a SBTI degradációjához. Ugyanakkor a szójaolaj finomított formában már nem tartalmazza a gátló anyagot, ezért közvetlenül fogyasztható.

Herbicid toleráns takarmánynövények

Számos herbicid toleráns GM növényt készítettek eltérő herbicidekkel szemben: cukorrépa, szója, gyapot, repce, kukorica - glifozát tolerancia; kukorica, szója, rizs, cukorrépa, repce - glufozát tolerancia; gyapot és repce – oxinil tolerancia; len és gyapot – szulfonilurea tolerancia; kukorica és repce – imidazolin tolerancia.

A Streptomyces genus bialafosz (vagy bianafosz, vagy PTT) termelő. A bianafosz glutaminsav analóg szerkezeti egység homológot, foszfinotricint [PTC vagy glufozinát, vagy 2-amino-4-(hidroximetilfoszfinil butanoát) és két alanin egységet tartalmaz (39. ábra). A szövetekben az intracelluláris peptidázok lehasítják az alanin egységeket. Az így keletkező glufozinát a glutamin szintáz inhibítora. Ennek eredményeként toxikus szintű az ammónia felhalmozódása a baktériumokban és a növényi sejtekben. A glufozinát detoxifikálásra képes Streptomyces hygroscopicus és S. viridochromogenes, ezekben a bar gén a foszfinotricin acetil transzferázt (PAT kódolja. A bar gént Alcaligenes faecalis baktériumból és archaeabaktériumokból szintén izolálták, és az Alcaligenes,Streptomyces és archebakteriális PAT enzim aminosav-szinten 30 %-ban azonos. A genetikai transzformációs protokollban a bar gént hordozó transzformánsok kiválasztása rendkívül egyszerű a glufozinát tolerancia alapján. Ugyanakkor a rezisztencia felhasználása a szántóföldi telepítésekben nem lehet kedvező a pollen keresztfertőzések és a gyomnövényekben lehetségesen kiépülő rezisztencia miatt, ez aláássa a glufozinát kereskedelmi hasznosítását. Ugyanakkor néhány országban van olyan növény, amely bar gént tartalmaz, mint szelekciós markert: cukorrépa, szója, rizs és kukorica.

39. ábra A bilalafosz (bianafosz, vagy PTT), a glifozát és a bromoxinil herbicidek kémiai szerkezete.

A glifozát (39. ábra) a növényi 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát szintáz (EPSPS) proteint gátolja, így az aromás aminosav szintézis sikiminsavas útvonalát. Az aromás aminosav bioszintézis hiánya pedig az aromás aminosavak hiányához és a növényi növekedés megálláshoz vezet. Az Agrobacterium sp CP4 törzs EPSPS enzime sokkal kisebb glifozát aktivitással bír, mint a növényi enzimek, ezért ezt beépítve a kultúrnövény tovább növekszik a herbicid alkalmazása mellett. Ilyen jellegű aromás aminosav bioszintézis nincs az állatokban: ez szelektivitást és alacsony emlős toxicitást biztosít.

Az oxinil herbicidek (39. ábra) a sejtlégzést gátolják, a toleranciát pedig a bxn gén által kódolt nitriláz biztosítja. A bxn gént Klebsiella pneumoniaesubsp. ozaenaeból izolálták. A bxn nitrilázt kódoló gént Agrobacteriumsp. által mediált transzformációjával (Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek) juttatták a gyapotba, ennek következtében a gént hordozó növény nem-toxikus vegyületekké alakítja az oxinil származékokat.

Vírusrezisztencia kialakítása

A rezisztencia kialakítása a vírus köpenyfehérje termeltetésével lehetséges. Például a burgonya Y vírus rezisztencia kialakítása így történt, az Y vírus köpenyfehérje bevezetésével. A rezisztencia kialakítása a vírus reprodukciójának, illetve sejtről sejtre jutásának megakadályozásával is történhet. Egyrészt növényi antivirális fehérjéket kódoló gének indukciójával, vagy antiszensz ill. ko-szupressziós technikával, pl. a replikáz esetében. Az antiszensz RNS (asRNS) felelős a cél RNS poszt-transzkripcionális degradációjáért. Az asRNS a növényi promoter mellé építve átíródik. A transzgén nagymértékű expressziója által aktivált növényi poszttranszkripciós géncsendesítő programja rezisztens fenotípust hoz létre. Ha a transzgén expressziója az RNS küszöbérték alatti, akkor a növény érzékeny az infekcióra (küszöb modell). Egyéb, a transzgénhez hasonló RNS (pl. vírus RNS) növekedő mennyisége megindítja a géncsendesítést („gyógyuló fenotípus”).

Az aberráns modellnél a transzgén és a virális RNS degradációját aberráns RNS (abRNS) indítja el. Az abRNS szubsztrátja a növény által kódolt RNS-dependens RNS polimeráznak és a képződő asRNS megfelel a transzgén metilált szakaszának. Az asRNS hozzákötődik a megfelelő RNS szakaszhoz és kiváltja a degradációját (Augustnyiak és munkatársai, 1997).

Gombarezisztencia kialakítása

A gombarezisztencia kialakításának egy része a növényi és gomba sejtek eltérő összetétele miatt működőképes. Például a gomba sejtfal hidrolízisére alkalmas enzimek termelésével kivédhető a gombák szaporodása. Ilyen enzimek pl. a kitinázok, glükanázok (lásd További antifungális metabolitok). Másik lehetőség, hogy növényi gének beépítésével javítják az ellenálló képességet. Ekkor fitoalexinek, proteináz inhibítorok vagy gomba-toxikus fehérjék aktiválásával emelhető a rezisztencia. Egyéb lehetőség a növényi hiperszenzitivitás előhívása. A hiperszenzitivitás során az egyedi sejtek gyors elhalása történik meg a fertőzés helyén, ez pedig hatékonyan gátolja a fertőzés terjedését. Szőlő esetében vizsgálják az alkalmazhatóságot.

Hímsterilitás

A hímsterilitás a GM növények esetében biztosíthatná a GM gének terjedésének a gátlását természetes körülmények között. Többféle lehetőség létezik a hímsterilitás elérésére; a legrégebbi módszer a káposztarepce esetében végzett összetett genetikai átalakítás volt. A hímsterilitás elérésének egyik módja az Escherichia coli DNS adenin metiláz (DAM) gén inzerciója, ami a pollenképzés és a pollentok képzés hiányához vezet. A másik lehetőség a barnase gén (Bacillus amyloliquefaciens ribonukleáz) beépítése, ekkor a fertilitás helyreállítható a barstar gén (B. amyloliquefaciens) által kódolt RNáz inhibítor beépítésével és indukciójával.

Az invertáz aktivitás megszüntetése szintén a pollentok képzés gátlásához vezet. Az invertáz a szacharóz bontását végzi, a képződő fruktóz és glükóz a pollenképzéshez elengedhetetlen tápanyag. A szacharóz bomlása nélkül a pollen nem képes a teljes fejlődésre. Az invertáz aktivitás megszüntetésére két módszert alkalmaztak: antiszensz technológiával az invertáz gént kapcsolták ki, vagy az enzim aktivitását gátolták invertáz inhibítorok alkalmazásával.

Második generációs növények

A zeaxantin halmozó burgonya elsősorban funkcionális élelmiszerként történő felhasználásra készült. Szensz és antiszensz technológiával készült a zeaxantin epoxidázzal transzformáció. Ekkor a zeaxantin magas szinten termelődik, és nem alakul át a zeaxantin violaxantinná. Emellett magas karotenoid szint és csökkent lutein termelés jellemző a terményre. A megfigyelések szerint tehát a genetikai módosítás a karotenoid szintézis egészére kihatott.

Amilóz mentes („vaxy”) burgonya is készült genetikai módosítással. Az Amflora nevű variáns (Paul van Eijck, 2010) szinte kizárólag amilopektint termel, mivel a granulumhoz kötött keményítő szintázt, az amilóz szintézis kulcsenzimét, antiszensz géntechnológiával lekapcsolták. Az Amflora-t csak szerződéskötés mellett lehet termelni és nem kerülhet a kereskedelembe.

Az első generációs módosításokon kívül második generációs módosításokat a gabonaféléken is elvégeztek. Az árpa esetében a gombás megbetegedések elleni rezisztencia kialakítása volt az elsődleges, illetve a megnövekedett keményítő tartalom kialakítása. Búza esetében a gombás megbetegedések elleni rezisztencia kialakítása szintén fontos volt. Ezen kívül a kenyértészta elasztikusságának növelésére készült olyan fajta, amely megnövekedett mennyiségben tartalmazza a nagy molekulatömegű glutenin alegységet. Vitamin-dúsított kukoricát készítettek dél-afrikai fehér kukoricából (M37W variáció), a terményt világos narancsszínű magok, 169 x növekedés a β-karotin termelésben, hatszoros C-vitamin és kétszeres folát termelés jellemzi.

A genetikailag módosított rizs (Golden Rice) esetében a mag endospermium β-karotin tartalmának növelése volt az elsődleges cél. Eredetileg csak a rizs maghéj tartalmaz karotint, de az a tisztítás során elvész. Az endospermiumban a geranilgeranil difoszfát megtalálható, de a szintézis út további része hiányzik. Két nárcisz (psy és lyc) és egy baktérium gén (crt1) genomi beépítésével (40. ábra) megvalósították a szintézis utat a β-karotin termeléséhez. Endospermium specifikus promoterrel alkalmazva megjelentek a fehérjék. Később kiderült, hogy a lyc beépítése felesleges volt, mert van saját likopén cikláz aktivitása a rizsnek. A GM rizsre 1,6 mg g⁻¹ összkarotin termelés jellemző üvegházban, szabadföldön ennek ötszöröse. A „Golden Rice 2” továbbfejlesztett GMO, ahol a kukorica fitoén szintázát kombinálták a rizs crt1 génjével. Emelkedett, 37 mg g⁻¹ összkarotin és 31 mg g⁻¹ β-karotin termelés jellemző rá.

A növényi érést a sejtfalak puhulása, az édes íz kialakulása, a likopin tartalom (szín), illat és aroma kialakulása jellemzi. Mindezek etilén növényi hormon (Ethylene: The ripening hormone) indukálta folyamatok. Az egyes fehérjék aktivitásának gátlásával megakadályozható az etilén termelődése. A szín és aroma kialakul ebben az esetben, de lassan puhul a gyümölcs. A növényi terméseket általában éretlenül szedik le, vagy etilénnel kezelik a szállítás előtt – így nem olyan ízletes, aromás. A puhulás a cellulázok, poligalakturonidázok és pektin metilészterázok feladata. A poligalakturonidáz csökkent aktivitásának elérése antiszensz technológia (Calgene) vagy ko-szupresszió (Zeneca) segítségével történt. A Calgene „Flavr Savr” márkanévvel vitte a piacra az így készült GM paradicsom terméket, de nem vált be a kereskedelemben.

Az olajnövények genetikai módosításai a második generációs GMO körében az olajösszetétel módosítására vonatkoztak elsősorban. Az egyes olajtípusok alkalmazása széleskörű és jelentős: laureát (20:0) - kozmetikumok, detergensek; palmitát (16:0), sztearát (18:0), oleát (18:1) – élelmiszerek; gamma-linoleát (18:3) - egészségügyi termékek; erukasav (22:1) – mérgező, élelmiszerben tilos az alkalmazása, de a műanyaggyártásban és a kenőolajokban használják. A repcét nagy mennyiségben először a II. világháború alatt termesztették ipari olaj kinyerésére. Az olajrepce eredetileg nagy mennyiségben tartalmazott erukasavat és glükozin-oleátot (mérgező). Ugyanakkor ez volt a legolcsóbban elérhető növényi olajforrás. A növény nemesítése révén vált a repce élelmezési célra is alkalmassá. Az első dupla nullás (zero erukasav/zero glükozinoelát) változatokat 1968-ban termesztették Kanadában, de nem volt még a humán fogyasztása engedélyezve. A repceolaj jellemző zsírsavösszetétele: 60 % oleát (18:1); 20 % linoleát (18:2); 8 % linolenát (18:3); 2-4 % palmitát (16:0); 1-2 % sztearát (18:0). Az olajrepce bioenergia nyerésére is kiválóan alkalmas: a biodízel termelés 84 %-át a repce fedezi. Élelmezési célra célszerű volt a laureát tartalom növelése: pl. az Umbellularia californica gén beépítésével korai zsírsav szintézis terminációt értek el, így a C12 származék felhalmozódik, akár 40 %-ban.

A GM szója termelése a világ egyik legjelentősebb GM növény termelése (GMO Compass), hiszen 2008-ban 221 millió tonna volt a termelése. A szója jellemző zsírsavösszetétele: 10 % palmitát (16:0), 4 % sztearát (18:0), 18 % oleát (18:1), 55 % linoleát (18:2) és 13 % linolenát (18:3). A gyenge oxidatív stabilitású linolenát miatt a szójaolaj oxidatív stabilitása rossz. Ezért elsősorban a szójaolajok arányának genetikai módosításokkal történő változtatására irányultak a kísérletek. Egyrészt a szójaolajok oxidációval szembeni stabilitásának növelését érték el a linolenát tartalom jelentős csökkentésével. A szójában három δ-15-desaturáz (FAD3 gén) van, de a FAD3A a meghatározó a linoleát tartalom elérésében. Egyik megoldás tehát a δ-15-desaturáz (FAD3A gén) mutációja. Másik megoldás a szintézis útban a δ-12-desaturáz elcsendesítése, ill. kiütése, vagy az ’upstream’ δ-9-desaturáz képzés meggátlása (41. ábra).

41. ábra A különböző olajtípusok bioszintézisében közrejátszó enzimek működésének módosítása termék-felhalmozódáshoz vezet. A gyenge oxidatív stabilitású linolenát tartalom csökkentésére több módszer van: a δ-15-desaturáz (FAD3) mutációja; a δ-12-desaturáz elcsendesítése, ill. kiütése, vagy a δ-9-desaturáz képzés meggátlása.

Másrészt olyan olajat kívántak előállítani, amely magas olvadáspontú, oxidációra kevésbé érzékeny és az egészségre kedvező hatása van: ez magas sztearát és oleát tartalmat és csökkentett sokszorosan telítetlen zsírsav tartalmat kívánt (Clemente és Cahoon, 2009). A sztearát tartalom megnövelésére is több módszer lehetséges. Például a Garcinia mangostana sztearoil-ACP tioészteráz (FatA) heterológ expressziója a szójában. A Garcinia mangostana 46 % sztearátot akkumulál. A δ-9-sztearoil-ACP desaturáz (SAD) mutációja vagy célzott repressziója, vagy az olaj-akkumuláló Umbelopsis ramanniana acetil CoA::diacil-glicerol aciltranszferáz (DGAT2)-típusú enzim génjének beépítése. A gén beépülése magspecifikus, a magtömeg növekedés: 21,5 %, míg az olajtartalom növekedés 20 %.

GM állatok

Nincs GM hús, tej és tojás a forgalomban, ugyanakkor a GM hal valószínűleg megjelenik hamarosan a kereskedelemben. A GM emlősöket elsősorban gyógyászati készítmények előállításánál alkalmazzák (III. generációs GMO), de nem kerülnek kereskedelembe maguk az állatok. Az állati klónok megjelenése, bár molekuláris technikákat kíván és a jövőben a megfelelő tulajdonságok örökítésének legfőbb módja lehet, nem jelenti GM állatok megjelenését.

GM háziállatok és szárnyasok esetében számos kísérlet történik (Transgenic farm animals), de számos mellékhatást regisztrálnak. A növekedési hormon kísérletekben, pl. a disznóknál, a zsírtartalom erősen csökkent és betegségek jelentkeztek. A csirke c-ski proto-onkogén (Proto-onkogének) miogén differenciációt indukált. Miosztatin deléciónál vagy nonszensz mutációnál pedig emelkedett izomtömeg és csökkent zsírtömeg volt tapasztalható.

A halak esetében másképp kell eljárni a genetikai módosítás során, mint az emlősök vagy növények esetében, mert egyrészt a külső megtermékenyítés jellemző rájuk, másrészt a peteburok erős fala akadályt jelent, ami miatt speciális eljárás szükséges a DNS bejuttatására. Technikailag a DNS beépítése a gamétákba vagy a megtermékenyített petékbe direkt transzfer útján történik mikroinjektálással, elektroporációval, retrovirális infekcióval vagy DNS belövéssel. A DNS bejuttatása általában a citoplazmába történik, ezért a transzgénikus halak nagy számban mozaikosak. A mozaicizmus az F1 szakaszban bekövetkező génbejuttatás esetén a mendeli aránytól sokkal kevesebb transzgént jelezhet.

A transzgénikus halakban elérendő kitűzött célok: a növekedési hormon termelés növelése, a fagyrezisztencia beépítése, a fertilitás megszüntetése, illetve a DNS vakcináció elérése. A növekedési hormon termelés növelésével a halak mérete a 200 %-ot elérte. A fagyrezisztencia gén beépítése a membránfluiditást biztosítja alacsony hőfokon, de az eddigi eredmények szerint túl lassú volt az expressziója, ezért nem növelte a hús minőségét.

A tej genetikai módosítása szintén kísérleti szakaszban van. Több cél elérése lehetséges: pl. a kazein tartalom növelése, módosított tejfehérjék előállítása vagy a humán tejfehérje gének beépítése bébitápszer előállításához. A savófehérjék mennyiségi növelése, pl. laktoferrin, lizozim. A β-laktoglobulin kiütése: a fogyasztók allergia elleni védelméhez megfelelő lenne, de nem ismertek a mellékhatások. A tejben a transzgénikus laktáz kifejeztetése a laktózmentes tej megvalósítását eredményezné, ami a laktóz-intoleranciában szenvedő fogyasztóknak lenne előnyös. A β-kazein kiütése lehetséges, nem okozott zavart, nem esszenciális alkotója a tejnek. Az α-laktalbumin kiütése ugyanakkor laktációs zavarokat és a laktóz termelés zavarát okozta mellékhatásként.

Forrásmunkák

Lee, J.K. (Ed.) Microbial Biotechnology. Principles and Application. 2nd edition, World Scientific Publishing Co., Singapore, 2006.

Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A., Levin, R.E. (Eds.) Functional Foods and Biotechnology CRC 2006.

Önellenőrzés 6

7. fejezet - Élelmiszer-összetevők és adalékok előállítása mikrobákkal (Prof. Dr. Pócsi István, Dr. Pusztahelyi Tünde)

Szerves savak előállítása biotechnológiai módszerekkel

Citromsav

A szerves savak közül az élelmiszeripar legnagyobb mennyiségben (1700000 t/év; 2007; E330) a citromsavat (42. ábra) használja fel, elsősorban ízesítő- és tartósítószerként, valamint színstabilizáló ágensként (a savas pH biztosítása által), pl. megtalálható gyümölcslevekben, lekvárokban, édességekben. Emellett nagy mennyiségben használják fel a mosószerek és piperecikkek gyártásakor, fémfelületek passziválására, illetve a mindennapos laboratóriumi gyakorlatban pufferkomponensként. A közeljövőben pedig várható biodegradábilis, biokompatibilis és nem toxikus citromsav-alapú polimerek térnyerése az orvosi biotechnológiában, pl. 3D sejtkultúrák létrehozásakor.

42. ábra Az élelmiszeriparban és a takarmányozásban legnagyobb mennyiségben felhasznált szerves savak és aminosavak.

Az iparban a citromsav előállítására döntően Aspergillus niger fonalas gombát használnak, de lehetséges más ascomyceta fonalas gombák és élesztők, pl. Yarrowia lipolytica, felhasználása is. A citromsav túltermelési folyamat biokémiai alapjai mára sok tekintetben tisztázódtak, ugyanakkor sok ponton további kutatások szükségesek. A citromsav túltermelést mai tudásunk szerint a következő biokémiai reakció utak, illetve tenyésztési körülmények teszik lehetővé:

(1)   Nagy (akár 200 g l⁻¹ feletti) kiindulási szubsztrátkoncentráció (glükóz, fruktóz, szacharóz – a gomba invertázzal rendelkezik), ami egy kis affinitású glükóztranszportert indukál. Ennek következtében a gombában növekszik a glükóz koncentrációja, ami felfüggeszti a hexokináz trehalóz-6-foszfát (a trehalóz fontos tartalék diszacharid) általi gátlását, illetve a megnövekedett fruktóz-2,6-biszfoszfát koncentráció révén stimulálja a foszfofruktokináz aktivitását. Fontos megjegyezni, hogy 50 g l⁻¹ szénhidrát koncentráció alatt nincs jelentős citromsavtermelés.

(2)   Régi megfigyelés, hogy bizonyos nyomelemek hiánya, elsősorban a Mn²⁺-ionoké, látványosan növeli a citromsav kihozatalt, továbbá a süllyesztett kultúrák morfológiáját (kis, <1 mm, tömör pelletek, sűrűn elágazó, kiöblösödött végű hifákkal) és, következésképpen, a fermentációs közeg reológiai sajátosságait is előnyösen befolyásolja. A mangánhiányt (<10⁻⁸ mol l⁻¹) hexaciono-ferrát adagolásával, illetve ioncserélők alkalmazásával lehet biztosítani. A mangánlimitáció a biomassza-gyarapodást is korlátozza, hiszen Mn²⁺-ionok hiányában minden anabolikus folyamat (fehérje-, DNS-, sejtfal- és sejtmembrán-szintézisek) gátolódik, ugyanakkor a proteinek lebontása (’turn-over’) fokozódik. Ennek következtében a citoplazma NH₄⁺-koncentrációja növekszik, ami felfüggeszti a foszfofruktokináz citrát általi gátlását. Nagy szubsztrát-koncentráció jelenlétében tehát a felvett szénhidrátok a glikolízis útvonalon gyorsan piruváttá alakulnak. A Mn²⁺-ionok hiánya a szekretált citromsav visszavételét is akadályozza. Bár a citromsav termelése szempontjából a vaslimitáció is hasznos, ennek biokémiai háttere azonban még nem tisztázott.

(3)   A glükózonként képződött 2 piruvát molekula egyike közvetlenül, a másik pedig oxálacetát, malát konverziót követően a mitokondriumba kerül, ahol belőlük egy molekula citrát lesz. A citrát túltermelését tehát a szintetikus folyamatok intenzívvé válása váltja ki. A felhalmozódó citrát a mitokondrium működését egy idő után gátolná, ezért a trikarboxilát karrieren keresztül a citoszolba kerül, ami valószínűleg ellenáramban éppen malátot juttat a mitokondriumba. A mitokondriumban felhalmozódó redukálóerő (NADH, ami a felvett malát oxidálásából származik) a mitokondrium alternatív oxidázán keresztül eliminálódik hőtermelés közben. A citromsav termelés O₂ igénye ezért jelentős (’dissolved oxygen tension’, DOT > 140 mbar), bármilyen fermentációs technológiát is alkalmazzunk. A képződő ATP valószínűleg a citoplazma pH-jának a stabilizálására szolgál a protonpumpák működtetése révén, hiszen a tápközeg pH-ja igen savas, Ł 2.

(4)   A tápközeg jelentős savanyodása a citromsav termelés velejárója és szükséges feltétele is. A tápközegben a spórák csírázása alatt a pH-t időlegesen a tápközeg-összetevő ammónium sók stabilizálják, majd gyors savanyodást figyelhetünk meg a képződő citromsav szekréciója révén (mind ATP-függő aktív, mind elősegített diffúzió lehetséges). A pH drasztikus csökkenése egyrészt meggátolja a glükonsav és oxálsav melléktermékek kialakulását, ugyanakkor fokozza a fermentorok korróziójának a veszélyét, ezért a fermentortesteket rozsdamentes acélból kell készíteni.

A fermentációs technológiákat tekintve a citromsav előállítására alkalmaznak felületi, süllyesztett és szilárd állapotú (’solid-state fermentation’, SSF) eljárásokat.

A felszíni tenyésztésű kultúrák a világ citromsav-termelésének ~20 %-át adják, és legtöbbször folyadékra (pl. melaszra) történő oltással valósítják meg. A fermentációs kamrákban polcos rendszerben acél tálcákat (tipikusan 2 m x 2.5 m x 12 cm) töltenek meg tápközeggel, majd a spórákkal történő felületi oltást követően 9-12 napos fermentáció következik 28-30 °C-on, majd a felületi micélium réteget szűréssel eltávolítják, majd alaposan átmossák. A fermentáció szempontjából kritikus a megfelelő intenzitású, folyamatos levegőztetés megfelelő páratartalmú levegővel. Tipikus kihozatal: 0,7-0,9 g g⁻¹ szénhidrát.

A süllyesztett kultúrával történő citromsav-termelést általában ’batch’, illetve ’fed batch’ üzemmódú kevert tartályreaktorban (általában 120-220 m³), vagy ’air lift’ fermentorban valósítják meg intenzív levegőztetés mellett. Tipikus kihozatal: 0,8-0,9 g g⁻¹ szénhidrát 7-10 napos fermentáció alatt.

A szilárd állapotú fermentációs rendszerek már használatban vannak (pl. Japánban, ’koji’ eljárás), illetve a fejlesztésük nagy intenzitással folyik. Tipikusan 5-20 cm vastagságú, keményítőt (pl. búzadarát) tartalmazó, 70-80 % nedvességtartalmú szubsztrát-rétegekre oltanak, és 5-8 nap múlva a citromsavat extrahálják. Tekintve, hogy ezzel az eljárással alacsony árú szubsztrátok (pl. mezőgazdasági hulladékok, így héjak, préselési maradékok) szénhidrát tartalma is jó hatásfokkal és kihozatallal alakítható át citromsavvá, így ezen technológiák térnyerése várható.

A fermentleveket, extraktumokat szűrik, majd általában meszezéssel leválasztják a citromsav kalcium sóját (pl. 95 °C-on 1 óra alatt, közel neutrális pH-n), amit alaposan mosnak, majd kénsavval felszabadítják belőle a szabad citromsavat. A gipsz kiszűrése után a citromsav oldatot aktívszénnel derítik, majd bepárlással töményítik, és alacsony hőmérsékleten kristályosítják. Centrifugálást követően a terméket szárítják és általában monohidrát formában kerül kereskedelmi forgalomba.

A citromsav ipari előállításával kapcsolatban további értékes technológiai ismeretek nyerhetők a következő irodalomból: Pécs, M. (2011) Fermentációs Feldolgozási Műveletek. Egyetemi tananyag. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar. A jegyzet 7. fejezete, melynek címe „Esettanulmány-1: Citromsav gyártása” (Pécs, 2011), részletesen bemutatja az ’up-stream’ és ’down-stream’ folyamatok egyes lépéseit.

Glükonsav

A glükonsavat (E574; 42. ábra) elsősorban savanyítószerként használják, illetve a vegyület, kiváló komplexképző sajátosságai révén, kalcium és vas vivőanyagként (gyógyszergyártás), továbbá vízkő- és rozsdaoldók összetevőjeként is felhasználásra kerül. A glükonsav előállítása a citromsavhoz hasonló módon Aspergillus niger gombával történik, de alapvetően eltérő fermentációs körülmények között. Ebben az esetben ugyanis a túlzottan savas pH értékeken igen instabil glükóz oxidázt védeni kell, amit mészkő, illetve NaOH folyamatos adagolásával biztosítanak (pH ~6,5). A mészkő alkalmazásakor számítani kell a kalcium-glükonát kicsapódására, ami korlátozza a kiindulási glükóz koncentráció nagyságát (~120-150 g l⁻¹). NaOH alkalmazásakor ez az érték elérheti a 380 g l⁻¹-t is. A fermentáció tipikus ideje 1 nap, hőmérséklete 33-34 °C, a kihozatal ~ 95 %. Újabb, sejtmentes konverziós technológiák lehetségesek glükóz oxidáz és kataláz felhasználásával.

Tejsav

A tejsavat (42. ábra) az élelmiszeriparban savanyítószernek használják, de az utóbbi időben teret nyer az alkalmazása piperecikkekben és emésztést javító készítményekben is. A bőripar és textilipar szintén használ tejsavat különböző technológiai folyamatokban a pH savasítására. A jövőben a tejsav felhasználása ugrásszerűen növekedhet a polilaktát alapú biodegradábilis műanyagok elterjedésével. Mikroorganizmusok, konkrétan tejsavbaktériumok, felhasználásával sztereospecifikus, azaz tiszta D(+) és L(-)enantiomerek előállítása is lehetséges igen jó konverziós (~90 %) rátával. Tipikus ipari termelők a Lactobacillus delbrueckii variánsai. A tejsavbaktériumok ~45 °C hőmérsékleten, gyengén savas pH-n (pH 5,5-6,0), kíméletes kevertetés mellett, 4-6 nap alatt kiváló konverziót biztosítanak. A jelenlegi fejlesztési irányok a keményítő-alapú tejsavgyártás (pl. Lactobacillus amylovoranssal) optimalizálására, illetve a kasszava- és burgonya-alapú gyártási technológiák kidolgozására irányulnak.

Ecetsav

Az Acetobacterek és Gluconobacterek szigorúan aerob anyagcseréjűek. Nemcsak az ecetgyártásban alkalmazott törzsek tartoznak ide, de több ketoalkohol, illetve ketosav (dihidroxiaceton, szorbóz, ketoglukonát) előállítására használható törzs is ismert. Az ecetsavgyártás alapanyaga az élesztővel erjesztett fermentlé szűrlete (cefre) vagy annak desztillálással dúsított koncentrátuma. Ez a kiindulási anyag általában tartalmaz annyi hasznosítható szerves anyagot, amely a baktérium szaporodásához szükséges szén-, nitrogén- és vitaminforrás igényt kielégíti. Élelmezési célra évente 2-3 millió m³ ecet készül, ami 150-200 ezer tonna ecetsavat jelent. Az ecetsavtermelésre használt baktériumok a képződő ecetsavat sem energiaforrásként, sem szénforrásként nem hasznosítják, ezért 95-98 %-os hatásfokkal valósítható meg az alkohol oxidációja.

A világ ecetsavtermelésének közel egyharmada Frings generátorokban készül. A generátorok 20-60 m³ hasznos térfogatú henger alakú fatartályok, amelyekben nyírfavesszőt, bükkfaforgácsot helyeznek el. A tartály alsó részén gyűlik össze a forgácson átszivárgó reakcióelegy (mozgó cefrés eljárás). A faforgácson találjuk az ecetsav baktériumokat, ezért rögzített sejtes bioreaktornak nevezhetjük. A lazán rétegzett faforgácstömegen alulról felfelé levegőt fúvatnak. A sejtek különösen érzékenyek a tenyészet az oxigénellátottságra, a tenyészeten átvezetett levegő 30-40 %-át képesek hasznosítani. A végtermék általában 11 % ecetsavat és 0,3 % alkoholt tartalmaz. Ennek egy részét elhasználják az újabb folyamat indításához szükséges 4 % alkoholt és 8 % ecetsavat tartalmazó kiindulási elegy készítéséhez. A nyers ecetet néhány hónapig érlelik, majd az érlelés után a nyers ecetet bentonit jelenlétében perlitből, vagy diatoma földből kialakított szűrőágyon élesre, majd membrán szűrőn baktériummentesre szűrik. Az ecetsav tartalom növelése a víz kifagyasztásával történik. Természetesen szubmerz kultúrás bioreaktorként mozgó cefrés eljárásban a Frings acetátor is ismert.

Nyugvó cefrés eljárásnak nevezzük a folyadék fázisban zajló, de nem kevert bioreaktoros eljárásokat: ilyen az orleans-i eljárás, és a Pasteur-eljárás. Az orleans-i eljárás során kádakban, folyadék fázisban zajlik a fermentáció: diffúziós anyagátadás jellemző a felületen, a baktériumok hártyát képeznek. A fermentációs idő 8 nap, ez alatt kb. 10 l orleans-i borecet képződik, amelyre a 4-5 % ecetsav tartalom jellemző. A Pasteur-eljárásban nagyobb felületen zajlik a fermentáció, itt 1 m2 alapterület, 30 cm magas folyadék fázis a jellemző. Az elérhető savtöménység is magasabb: 10 %.

Aminosavak és peptidek biotechnológiai előállítása

Általános tudnivalók

A mikroorganizmusok aminosav túltermelésének és szekréciójának két oka lehetséges. Az egyik az úgynevezett metabolikus egyensúlyvesztés vagy limitált lebontási kapacitás, mikor a növekedés csak peptidek nagy volumenű lebontásával lehetséges, és a nem, vagy nehezen metabolizálható aminosavak sejten belüli felhalmozódása súlyos metabolikus zavarokat okozna ’feed-back’ gátlások révén. Ilyenkor az aminosav szekréciója az exponenciális növekedési fázisban figyelhető meg (pl. a lizin szekréciója Corynebacterium glutamicum által a természetben). A másik lehetséges ok a metabolit túlcsordulás jelensége, mikor egyébként kielégítő tápanyag- és energia-ellátottság mellett valamilyen gátló hatás (növekedési faktor hiány, környezeti stressz, genetikai tényezők) miatt egyes metabolikus útvonalak áteresztőképesség limitálttá válik, aminek következtében a mikróba nem tud sejttömeget gyarapítani (növekedésgátlás), és az alapvető sejtfunkciók fenntartásához bizonyos felhalmozódó metabolitok szekréciója szükséges, ilyen pl. a C. glutamicum glutamát túltermelése.

Mivel a metabolikus fluxusok ma már megkonstruálhatók (’metabolic engineering’), így sok esetben az is technikai kérdéssé vált, hogy az ipari törzsek metabolit túltermelése a biomassza-gyarapodáshoz (pl. az Escherichia coli treonin termelése), vagy azt követően, az idiofázishoz (pl. a C. glutamicum lizin termelése) kapcsolódik. Ma, technológiai szempontból, aminosav túltermelés mind lazább központi és perifériás metabolizmus szabályozással rendelkező baktériumban (pl. C. glutamicum), mind szorosabban szabályozott metabolizmusú mikróbában (pl. E. coli), megvalósítható.

Az aminosav túltermeléshez szükséges metabolikus hálózat elemei: szubsztrátfelvétel, központi metabolikus hálózat, az aminosavak bioszintéziséhez szükséges útvonalak, az aminosavak exportjához szükséges transzporterek. Fontos további tényezők: globális és lokális génszintű, továbbá enzimszintű szabályozási mechanizmusok, energia- és redukálóerő mérlegek, az aminosavakat lebontó folyamatok, a termék újrafelvételét lehetővé tevő transzporterek. A C. glutamicum technológiai alkalmazhatóságának az egyik kulcseleme az, hogy a baktérium két hatékony enzimmel, ezek a piruvát karboxiláz és a foszfoenolpiruvát karboxiláz, képes feltölteni szénvázzal (oxálacetáttal) a citromsav ciklust, ami alapvetően fontos bármelyik, a ciklusból kiágazó bioszintézisű aminosav túltermeltetése szempontjából.

L-Glutaminsav

L-Glutaminsavat (42. ábra) nagy mennyiségben használ fel az élelmiszeripar ízfokozóként (1100000 t/év), és ezt a mennyiséget továbbra is kizárólag C. glutamicummal állítják elő. A baktérium sok stressztényező hatására, pl. biotin-limitáció (a biotin a zsírsav bioszintézis, konkrétan az acetil-CoA karboxiláz fontos kofaktora), detergensek adagolása, β-laktámok adása, hőstressz, ozmotikus stressz, a lipidek bioszintézisét érintő mutációk, nagy mennyiségben L-glutamátot szekretál, aminek a pontos molekuláris hátterét még nem ismerjük. Valószínűsíthető, hogy a megfigyelhető változások a sejtmembrán lipidösszetételében egy L-glutamát carriert aktiválnak. Ugyanakkor drasztikusan csökken a citrát ciklusban fontos szerepet játszó α-ketoglutársav dehidrogenáz enzim (a működése szukcinil-CoA létrejöttét eredményezi) aktivitása, miközben az egyébként is kiemelkedő aktivitással rendelkező glutamát dehidrogenázé (ez az enzim felelős a glutaminsav szintéziséért) nem változik. Ez önmagában is jelentős L-glutamát túltermelést eredményez. Az anaplerotikus útvonalak (piruvát karboxiláz és foszfoenolpiruvát karboxiláz aktivitások) fluxusának a növekedésével párhuzamosan növekszik a glükóz beáramlása a glikolízis úrvonalba a pentóz-foszfát út rovására.

A L-glutamát előállítása kevert tartály fermentorokban (240-500 m³) történik megfelelően szabályozott NH₃- koncentráció, O₂-nyomás (DOT) és pH mellett. A kihozatal elérheti a 60-70 %-ot a kiindulási glukóz mennyiségére vonatkoztatva. Az aminosav eltávolítása anioncserélővel történik, amiről nátrium-hidroxiddal eluálják. Tisztítás (dekolorizáció, kristályosítás) után a nátriummal képzett só kerül forgalomba.

L-Lizin

Az L-lizint (42. ábra) az állattenyésztésben használják nagy mennyiségben (550000 t/év) takarmány-kiegészítőként, mivel a növényi eredetű fehérjék, pl. a szója, fontos esszenciális aminosavakból (L-metionin, L-lizin, L-treonin) nem tartalmaz az állati szervezet számára elegendőt, és ez a többi aminosav hasznosulását is korlátozza. Emlékeztetésképp: a három aminosav bioszintézise közös kiindulási pontú, és a kiindulási lépést katalizáló aszpartát kináz (C. glutamicum) illetve aszpartát kinázok (E. coli) szoros végtermék ’feed-back’ gátlás alatt állnak. Az L-lizin túltermelése a legjobban tanulmányozott biokémiailag/genetikailag, illetve a legjobban megtervezett folyamatok egyike. A lizin termelés kiindulási metabolitja az oxálacetát a baktériumokban, így a C. glutamicumban is. A következő genetikai változtatásokkal lehetett a L-lizin túltermelését elérni:

(1)   a bioszintézis kiindulási lépését katalizáló aszpartát kináz L-lizin (és L-treonin) általi ’feed-back’ gátlásának a megszüntetése, és a deregulált kináz túltermeltetése,

(2)   a dihidropikolinát szintáz aktivitásának a növelése,

(3)   a citrát-ciklus anaplerotikus útvonalai aktivitásának a fokozása,

(4)   a NADPH-termelő pentóz foszfát út aktivitásának a növelése,

(5)   az L-lizin exporter (LysE) fehérje túltermeltetése.

A L-lizin fermentáció alapanyagai lehetnek:

(1)   szénforrások: melasz, szacharóz, keményítő hidrolizátum;

(2)   nitrogénforrások: ammónium-szulfát, ammónia;

(3)   a növekedési faktorokat fehérje hidrolizátummal, kukoricalekvárral, vagy a faktorok hozzáadásával biztosítják.

A kiindulási glükóz elfogyása után a bioszintézis szénigényét a glükóz folyamatos adagolásával (’feed’) biztosítják. A kihozatal 45-50 g l⁻¹szénforrás, és elérheti a 170 g l⁻¹ koncentrációt is a fermentlében. Az elsődleges termék L-lizin szulfát, amit ioncserével alakíthatnak át L-lizin hidrokloriddá.

L-Treonin

Az L-treonin (42. ábra) Szintén nagy mennyiségben (50000 t/év) előállított takarmány-kiegészítő. A fermentáció genetikailag tervezett E. coli törzsekkel történik. A L-treonin túltermelő törzseket a következőképpen alakították át:

(1)   az L-treonin bioszintézis útvonalon működő aszpartát kináz L-treonin általi ’feed-back’ gátlásának a megszüntetése,

(2)   a triozin bioszintézis enzimeinek (ThrA, ThrB, ThrC) a túltermeltetése plazmidok segítségével,

(3)   az L-lizin, L-metionin és L-izoleucin bioszintézis elágazási ponti enzimeinek a genetikai eliminálása,

(4)   az L-treonin dehidratáz (L-treonin lebontás) aktivitás eltávolítása (szintén gén szinten),

(5)   az E. coli szacharóz hasznosítási képességének a kialakítása.

A fermentáció ebben az esetben is glükóz táplálásos (’feed’), a nitrogénforrás ammónia, a konverzió 60 % a szénforrásra nézve, és elérheti a fermentlében a 100 g l⁻¹ koncentrációt. Tekintve, hogy az L-treonin oldékonysága vízben relatíve kicsi, így a sejtmentes (szűrt) fermentlé töményítését, és hűtését követően kikristályosodik.

L-Metionin

Az L-metionint (42. ábra) kémiai ipar állítja elő jelenleg nátrium-dietil-ftálimidomalonát klór-etil-metil-szulfiddal történő alkilezését követően a termék hidrolízise és dekarboxilezése révén. A termék bár D,L-enantiomereket tartalmaz, az állati szervezetek a D-metionint is metabolizálni tudják, így a kémiai eljárás rentábilis. Tiszta L-metionin előállítható N-acetil-(D,L)-metioninból Aspergillus oryzae N-aciláz felhasználásával.

L-Fenil-alanin

Ezt az aromás aminosavat (42. ábra) szintén nagy mennyiségben gyártják (10000 t/év), és az aszpartám nevű mesterséges édesítőszer előállítására használják. Az aminosav előállítása E. colival történik, melyben az L-fenil-alanin túltermelését szintén a metabolizmus átalakításával érték el. Ennek a molekuláris törzsfejlesztésnek a fő lépései a következők voltak: a pentóz-foszfát út enzimeinek a túltermeltetése az eritróz-4-foszfát termelés fokozására (ez az aromás aminosavak szintézisének a kiindulási metabolitja); a foszfoenol-piruvát fogyasztó útvonalak, pl. a foszfát transzfer rendszer (PTS) limitálása; a bioszintézis első enzimének, a 3-dezoxi-D-arabino-heptulozonát-7-foszfát (DAHP) szintáz ’feed-back’ gátlásának (L-fenil-alanin, L-tirozin) az eliminálása; a korizmát szintáz és prefenát dehidratáz túltermeltetése továbbá az L-tirozin auxotrófia kialakítása (így L-tirozin ’feed-back’ gátlások nem jelentkeznek).

Az L-fenil-alanin fermentációk többfázisúak, a kiindulási glükóz elfogyása után glükóz táplálás (’feed’) következik, amelyet folyamatos kontroll mellett úgy állítanak be, hogy a négy glükóz konverziós termék (biomassza, L-fenil-alanin, ecetsav, CO₂) közül az aminosav kihozatala a lehető legkedvezőbb legyen. Az L-fenil-alanin termelése nagymértékben növekszik a közeg L-tirozin tartalmának az elfogyása után. A fermentáció tipikus ideje fél nap, a kihozatal 27,5 % a szénforrásra vonatkoztatva, ami körülbelül 50 g l⁻¹ koncentrációt jelent.

L-Triptofán

Az L-triptofánt (42. ábra) Szintén takarmány-kiegészítőnek használják, de ma még igen kis mennyiségben (~500 t/év). A termelés olyan E. coli törzzsel folyik, amelyben az L-triptofán operon szabályozó régióját a korai bioszintézis és szabályozó génekkel együtt eltávolították, ami a bioszintézis utolsó lépését katalizáló L-triptofán szintáz túltermeléséhez vezet. Az enzim in vivo az indol-3-glicerin-foszfát és az L-szerin közötti kondenzációt katalizálja, az ipari folyamatban viszont indolt (petrolkémiai termék) és L-szerint (cukorrépa melaszból nyerik ki ioncserés kromatográfiával) reagáltatnak. A down-stream kinyerési folyamat megszokott tisztítási lépéseket (szűrés, dekolorizáció, kristályosítás, szárítás) tartalmaz.

L-Aszparaginsav

A savas oldalláncú aminosavat (42. ábra) az L-fenil-alaninhoz hasonlóan az aszpartám gyártásához használják fel kb. évi 10000 t mennyiségben. A gyártásban glutáraldehiddel és hexametilén-diaminnal keresztkötött k-karragenánban immobilizált E. coli sejteket használnak, amelyekkel oszlopreaktorokat töltenek meg. A baktérium sejtekben lévő aszapartáz aktivitást kihasználva fumarát + ammónia ® aszparaginsav konverziót hajtanak végre kiváló kihozatallal (1 mol l⁻¹ fumársavból kiindulva 987 mmol l⁻¹ L-aszparaginsav lesz). Egy 1000 l-es oszloppal 3,4 t L-aszparaginsav gyártható naponként 200 mmol h⁻¹ (g sejt)⁻¹ térfogati aktivitást feltételezve.

Az aszpartám gyártása

Az aszpartám kémiai szerkezete N-(L-α-aszpartil)-L-fenil-alanin-1-metil észter, és kb. 180-200-szor édesebb, mint a szacharóz. A gyártás során először az L-fenil-alanin-1-metil észtert állítják elő kémiai észterezési (+metanol+HCl) reakcióban, majd a peptidkötést a benzil-oxikarbonil (BOC) védőcsoporttal ellátott (az amino-csoportot védi) L-aszparaginsavval Bacillus thermoproteolyticus által termelt termolizin segítségével alakítják ki. A termék az L-fenil-alanin-1-metil észter túladagolásakor addíciós komplexként leválik, amely pH változtatással szolubilizálható. A képződött BOC-aszpartám védőcsoportját hidrogénezéssel távolítják el.

Íz- és illatanyagok biotechnológiai előállítása

Az ételek íz- és illatanyagai általában szénhidrátok, lipidek és aminosavak komplex degradációs termékei. A biotechnológiai úton előállított anyagok ára akár egy nagyságrenddel olcsóbb lehet, mint pl. a természetes növényi extraktumoké. A biotechnológusok érdeklődését a terület régóta vonzza, hiszen egy évi ~11 milliárd euró forgalmat lebonyolító, és dinamikusan bővülő piacról van szó. Ugyanakkor a a különféle technológiai eljárásokkal előállított termékeknek csupán 15 %-a biotechnológiai eredetű.

Az íz- és illatanyagoknak többféle csoportosítása ismert. Az ízanyagok önmagukban lehetnek illékonyak és nem illékonyak (pl. citromsav, glutaminsav); az illékonyak pedig kémiai szerkezetük szerint lehetnek alifás vegyületek (pl. a hexán-származék „levél” alkoholok és aldehidek, ’green notes’, továbbá illékony ketonok és észterek), aromás származékok (pl. benzaldehid, vanillin, továbbá a frambinon, a „málna keton”), terpének (pl. limonén, a citrusfélék, karvon, a kömény, nootkaton, a grapefruit, továbbá ambroxán, az ámbra illatanyagai), laktonok (pl. dekalaktonok) továbbá ként és nitrogént tartalmazó vegyületek. Ezek a vegyületek lehetnek mikrobiális bioszintetikus és konverziós aktivitások termékei is, és a biotechnológiai ipar éppen ennek a kihasználására törekszik. Az általában alacsony árú kiindulási anyagok konverziója értékes íz- és illatanyagokká történhet enzimekkel és sejtes rendszerekkel, de ma már komoly lehetőség rejlik a felhasznált mikroorganizmusok genetikai átalakításában is.

Az utóbbi időben bíztató előrehaladásról számoltak be kutatók a ’biovanillin’ biotechnológiai előállítása területén. Jelenleg a mesterséges (kémiai úton szintetizált) vanillin piaci forgalma 12000 t/év (15 euró/kg), a természetes vanilla extraktumé pedig 50 t/év (4000 euró/kg). A biotechnológiai úton előállított ’biovanillin’ becsült piaci forgalma kb. 5000 t/év lenne (800-1000 euró/kg). Sok értékes szabadalom került benyújtásra és, több, ezeken alapuló technológiai folyamat került kidolgozásra a közelmúltban, ami megnyitotta az utat a vanillin biotechnológiai ipari előállítása felé. Az egyik bíztató eljárásban eugenolt (kereskedelmileg hozzáférhető) konvertálnak egy Pseudomonas fajjal ferulinsavvá, majd ezt tovább egy Amycolatopsis fajjal vanillinná (43. ábra). A kihozatal kiváló, 78 %-os a kiindulási eugenolra vonatkoztatva. A másik terület, ahol jelentős előrehaladás történt a dekalaktonok (gyümölcsök, pl. banán, őszibarack, körte illatanyagai) biotechnológiai előállításában (43. ábra). Ezen folyamatok lényege az, hogy olcsó zsírsavból kiindulva, pl. a ricinusolaj ricinoleinsav tartalmát konvertálják élesztő fajokkal (Yarrowia, Saccharomyces) β-oxidációs folyamatban 4-hidroxi-dekánsavvá, amit savas pH-értéken alakítanak laktonná. A γ-dekalakton becsült piaca 3,5 t/év. A laktonok ára 1200-6000 EUR/kg között van. Várható, hogy a metabolikus útvonalak jobb megismerésével, és a megfelelő mikroorganizmusok genetikai módosításával az íz- és illatanyagok biotechnológiai előállítása még inkább teret nyer.

43. ábra Vanillin és g-dekalakton biotechnológiai előállítása.

Vitaminok és ezek prekurzorainak a biotechnológiája

A vitaminok és ezek prekurzorainak (44. ábra) a gyártása évi 10 milliárd USA dollár piacot jelentenek. A termékek egy része biotechnológiai eljárásokkal készül, illetve olyan kémiai ipari termékek, melyek előállításakor biotechnológiai, pl. biokonverziós lépések is voltak.

44. ábra Biotechnológiai úton előállított vitaminok.

Ergoszterin

Az ergoszterin (44. ábra) élelmiszer- illetve takarmány-kiegészítő, amely UV sugarak hatására D₂-vitaminná (ergokalciferol) alakul át. Jelenleg kizárólag pékélesztőből (Saccharomyces cerevisiae) nyerik, amely szénhidrát, vagy alkohol szénforráson tenyésztve, jó levegőztetés mellett nagy mennyiségben termeli. Ilyen feltételek mellett az élesztő ergoszterin tartalma elérheti akár a száraz sejttömeg 10 %-át is. A kiszűrt sejttömegből az ergoszterin lúgos sejtfeltárást követően éteres extrakcióval állítható elő.

Riboflavin (B₂ vitamin)

A riboflavin (44. ábra) értékes vitamin, takarmány-adalék, élelmiszer-színező anyag, melynek az éves termelése ~10000 t. Az előállítására egyformán rentábilis kémiai és biotechnológiai eljárások vannak. A biotechnológiai eljárásokban az Ashbya gossypii aszkuszos gombát alkalmazzák. A fermentáció trofofázisára etanol és lipid akkumulálódás jellemző, majd az idiofázisban a lipidek és az alkohol konverziója történik B₂-vitaminná. A biotechnológiai folyamat versenyképességét nagyban megnövelte, illetve növelheti a jövőben az A. gossypii gombán végrehajtott biomérnöki munka, melynek az eddigi főbb lépései a következők voltak: (1) a fermentáció optimalizálása nagy O₂-tenzió biztosításával, illetve a tápközeg szupplementálása zsírokkal, illetve glicinnel (szükséges a riboflavin bioszintézis kiindulási metabolitjának, a GTP-nek az előállításához), (2) a lipidek lebontásának a hatékonyabbá tétele az ICL1 izocitrát liáz gén kópiaszámának a növelésével, (3) GLY1 treonin aldoláz gén overexpressziója, amely terméke L-treonin®glicin konverziót biztosít. Az A. gossypii ugyanis a L-treonint nagyságrendileg hatékonyabban képes felvenni, mint a glicint, és ennek eredményeképpen a riboflavin kihozatal is nagyságrendileg megnő. (4) A VMA1 vakuoláris ATPáz alegység gén inaktiválása, hiszen ennek hiányában nincs riboflavin transzport a vakuólumba, csak a fermentlébe. Vannak Candida famata élesztőn, illetve Bacillus subtilis baktériumon alapuló biotechnológiai eljárások is a riboflavin előállítására.

B₁₂ vitamin (kobalamin)

B₁₂ vitamint (44. ábra) szintén nagy mennyiségben (~10000 t/év) használnak élelmiszer- és takarmány-additívumként, illetve a humán gyógyászatban is. A vitamin előállításához Pseudomonas denitrificanst, vagy Propionibacterium shermaniit használnak. Az utóbbival a B₁₂ vitamin előállítása kétlépéses folyamat: az első, anaerob fázisban a baktérium biomasszát (25-35 g l⁻¹) gyarapít, propionsavat akkumulál (20-40 g l⁻¹), illetve a B₁₂ vitamin prekurzor 5,6-dimetil-benzimidazol hiányában kobamid intermediert termel (ezért nincs jelentős ’feed-back’ gátlás). A növekedés a propionsav toxicitása miatt leáll, ezt követi a fermentáció aerob fázisa, mikor az 5,6-dimetil-benzimidazol hozzáadását követően kobalamin termelés figyelhető meg 25-40 mg l⁻¹ körüli kihozatallal. Mindkét fermentációs fázis kb. 72-88 h hosszúságú. A termék egyrészt cianidizációs eljárással leválasztható (cianokobalamin képződik, amit gyógyszerkészítményekben használnak fel), vagy a Propionibacterium biomasszájával együtt formulázható (’food-grade’ termék).

C-vitamin (aszkorbinsav)

A C-vitamin (44. ábra) a legnagyobb mennyiségben előállított vitamin (100000 t/év), amit az élelmiszeripar nagy mennyiségben használ fel antioxidánsként is. A C-vitamin gyártása hagyományosan a Reichstein-féle szintézissel történik, amely öt kémiai és egy biotranszformációs (a D-szorbitol®L-szorbóz konverzió Acetobacter xylinummal) lépést foglal magába. Jelenleg többféle próbálkozás zajlik egy tisztán (vagy döntően) biotechnológiai eljárás kifejlesztésére. Például Corynebacterium 2,5-diketo-D-glükonsav reduktáz gént vittek be Erwinia herbicola baktériumba, amely így egy fermentációs lépésben D-glükózból kiindulva 2-keto-L-glukonsavat, a C-vitamin szintézis közvetlen prekurzorát, képes előállítani jó kihozatallal (20 g l⁻¹, 50 % a kiindulási D-glükózra vonatkoztatva) 3 nap alatt.

A lipidek biotechnológiája

ω-3 és ω-6 Zsírsavak

Az ω-3 zsírsavak (45. ábra) biotechnológiai előállítására irányuló fejlesztéseket nagyban elősegíti az a tény, hogy ezek a zsírok jótékony hatásúak olyan fontos betegségek megelőzése szempontjából, mint a szív- és érrendszeri megbetegedések és a rák. Hagyományosan az ω-3 zsírsavak, mint pl. az eikozapentaénsav, EPA (45. ábra) és a dokozahexaénsav, DHA (45. ábra), fő forrása a halolaj. A halak ezekre a fontos zsírsavakra az olajban dús mikroalgák elfogyasztásával tesznek szert. A vegyületcsoport fontosságát tovább növeli a felhasználásuk eikozanoidok, pl. prosztaglandinok, prosztaciklinek, tromboxánok, leukotriének, előállítására.

45. ábra Biotechnológiai úton előállítható ω-3 és ω-6 zsírsavak.

A DHA biotechnológiai termelésének a lényege egysejt olaj (’single cell oil’) fermentációja heterotróf növekedésre képes tengeri algák, pl. a dinoflagelláta Crypthecodium cohnii, illetve a stramenophila Schizochytrium fajok felhasználásával. A törzsnemesítés eredményeképpen ezen algák már nagy Cl⁻-koncentrációt nem igényelnek a növekedésükhöz (ezek a tápközegek igen korrozívak), ugyanakkor a biomassza- és olajtermelésük igen jó (100 g l⁻¹ biomassza, melynek olajtartalma 20 % (w/w száraztömeg), és aminek a DHA tartalma nagyobb, mint 25 %-a teljes zsírtartalomnak. A fermentációt követően a biomasszát kiszárítják (’spray drying’), majd hexánnal extrahálják. Ezt követi az olaj finomítása, szagtalanítása.

Az ω-6 zsírsavak közül a γ-linolénsav (GLA; 45. ábra) gyulladáscsökkentő hatású. A GLA biotechnológiai előállítása a GRAS (’generally recognized as safe’) besorolású zygomyceta gombával, a Mucor circinelloidessel (más néven Mucor javanicus) történt. A gomba olajtartalmának 18-20 %-a volt GLA, amit igen nagy C/N arány biztosításával (nitrogénéhezés) értek el. A fermentációs technológiát időközben kiszorította a piacról az ott megjelenő nagy mennyiségű növényi (borágó, Borago officinalis) eredetű GLA.

Ma is fermentációs technológiával állítják elő viszont az izomzat és az idegrendszer fejlődése szempontjából fontos arachidonsavat. A fermentációban Mortierella alpina gombát használnak, és a megfelelő olaj kihozatalt a nitrogénforrás szabályozott adagolásával (’feed’) érik el. A biomassza produkció ~ 50 g l⁻¹.

Olajok és zsírok módosítása lipázokkal

Az olajok és zsírok átalakításában kitüntetett szerepet játszanak a mikrobiális lipázok. Vizes oldatban ezek az enzimek a triglicerideket zsírsavakká, részben hidrolizált gliceridekké és glicerinné alakítják át. Vízlimitáció esetén (pl. szerves oldószerekben) az inter-észterifikációs reakciók válnak dominánssá.

A mikrobiális lipázok csoportosítása:

(1)   I-es csoport: nincs semmiféle sztereospecificitás az interészterifikációs reakciókban. Termelő fajok pl. Candida cylindracae, Propionibacterium acnes.

(2)   II-es csoport: sn-1 és sn-3 pozíciókban segíti elő a zsírsavcserét. Termelő fajok, pl. Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus arrhizus.

(3)   III-as csoport: interészterifikáció sn-1 és sn-3 pozíciókban, ha ott hosszú szénláncú, 9-es pozícióban cisz kettőskötést tartalmazó zsírsavak, pl. oleinsav, palmitoleinsav, linolsav, linolénsav vannak. Termelő mikróba: pl. Geotrichum candidum.

Az interészterifikációs reakciókat kevert tankreaktorban, töltött ágyas reaktorban vagy membrán reaktorban hajtják végre. Az enzimeket immobilizálják, többször, vagy folyamatos üzemmódban használják. A konverziót apoláros szerves oldószerben hajtják végre, ami az enzimek stabilitását és a konverzió hatásfokát növeli.

Az egyik legfontosabb konverziós termék a kakaóvaj ekvivalens zsír előállítása (46. ábra). Az értékes kakaóvaj a különleges összetételének, 1(3)-palmitoil-3(1)-sztearoil-2-monoolein (POS) és 1,3-disztearoil-2-monoolein (SOS) elegye, köszönhetően éles olvadásponttal bír 32-35 °C között, ami miatt a csokoládé készítmények a szájban olvadnak szét. A kakaóvaj ekvivalens zsírt a pálmaolaj középső és szilárd frakciójának (nagy POP tartalom jellemzi ezeket) a sztearoilsavval történő átészteresítésével állítják elő, II-es típusú lipáz felhasználásával. A terméket szerves oldószeres ellenáramú extrakcióval és kristályosítással tisztítják.

46. ábra Kakaóvaj ekvivalens zsír előállítása.

Ugyancsak jelentős az úgynevezett kis kalóriájú, diétás zsírok előállítása, mikor a kókuszdió-, pálma- és repceolajok behensav (C22:0) tartalmát részben C8:0 és C10:0 zsírsavakra cserélik le.

A humán anyatej OPO összetételű zsírt tartalmaz, ami biztosítja a csecsemő jó emésztését és zsírhasznosítását. Az OPO ekvivalens zsír szintén előállítható töltött ágyas reaktorban, mely katalizátorként immobilizált Rhizomucor miehei lipázt tartalmaz. A reaktorban szerves oldószerben oldott PPP növényi zsírt és olajsavat (O) áramoltatnak át, és az OPO zsír optimális képződését a mólarányok és a reakcióidő alkalmas megválasztásával, továbbá a konverzió ismétlésével biztosítják. A terméket frakcionált kristályosítással választják el, míg a zsírsav mellékterméket (döntően palmitinsav), vákuumdesztillálással szeparálják.

Pigmentek biotechnológiai termelése

Karotenoidok

A karotenoidok fontos színanyagok, antioxidánsok, és néhányuk A-provitamin. A karotenoidok mikrobiális előállítása lehetséges, pl. az asztaxantint (36. ábra) Haematococcus pluvialis zöldalgával (kihozatal 40 g kg⁻¹ száraztömeg), továbbá Phaffia rhodozyma bazídiumos élesztővel, a β-karotént (36. ábra) pedig Dunaliella salina zöldalgával, illetve Blakeslea trispora járomspórás gombával lehet előállítani (lásdGomba eredetű pigmentek). Előrehaladott kísérletek folynak annak érdekében, hogy a β-karotént annak termelésre eredetileg nem képes E. coli baktériumban állítsák elő. Remélhetően a különféle élőlények β-karotén bioszintetikus génjeinek az E. coliban történő egyidejű kifejeztetésével nemcsak a hagyományos karotenoidok termeltethetők majd meg, hanem új, tervezett szerkezetű vegyületek is kialakíthatók majd. A végrehajtott, illetve megkívánt genetikai változtatások kiterjednek a metabolikus szűk keresztmetszetek (’bottle neck’) kiküszöbölésére, pl. a foszfoenolpiruvát szintáz és a geranil-geranil-pirofoszfát szintáz túltermeltetése révén. Új termékre példa a 3-OH-g-karotén, amit bakteriális (Erwinia) és növényi enzimek koexpressziójával sikerült előállítani E. coliban (tipikus kihozatalok: 1-1,5 mg karotenoid g⁻¹ száraztömeg).

Monascus pigmentek

A távol-keleti konyha évezredek óta használja a Monascus purpureus és Monascus ruber által termelt vörös pigmenteket (pl. monascorubin; 47. ábra) különféle élelmiszerek, pl. rizs, rizsborok és szójasajtok, színezésére. Ezek a színanyagok igen könnyen reagálnak a fehérjék amino-csoportjaival. Hagyományosan száraz spórás rizsszemekkel oltják a gőzölt rizs felületét, majd a fermentációt követően a színes rizst kiszárítják és porrá őrlik. Ma már igen kifinomult süllyesztett kultúrás fermentációs technológiák is vannak.

47. ábra Monascorubin szerkezete.

A fermentációkat rizsliszt és tapióka keményítő szénforráson, Zn²⁺-ionok szupplementálásával, pH 5-6-os értéken, 30 °C-on végzik. Fontos az amilázok adagolása a tápközegbe a megfelelő viszkozitást és oxigén-transzfert elősegítendő. Ugyanakkor a robbanásszerű glükóz-felszabadulást el kell kerülni, mert a pigmentek termelése glükóz-represszió alatt áll. Új eljárás ezen a területen a szilárd-folyadék fázisú fermentálás, ahol a fermentor falát zselatinizált tapióka-keményítővel vonják be. A keményítő lebontása és a pigmentek szintézise parallel zajlanak igen jó biomassza termelés és pigment kihozatal mellett.

Alga eredetű pigmentek

A β-karotén algákkal, pl. Dunaliella salinaval, történő előállítását már fentebb említettük. Az élelmiszeriparban használt zöld, vörös és kék színanyagok gazdag forrását jelentik a Chlorealla zöldalga (klorofill), továbbá a Rhodophyta és Cyanophyta (vörös és kék fikobiliproteinek) fajok. Az élelmiszerekben (rágógumi, italok, joghurtok) használt kék színanyagot a Spirulina platensis cianobaktériummal állítják elő, amely pH 7,2-9,0 tartományban, 27 °C-on és 30 g l⁻¹ sókoncentráció mellett nő jól.

Antioxidánsok termelése

Az élelmiszerek íze, színe, illata, textúrája előnytelenül változhat meg az idő múlásával, ami oxidációs, pl. lipid-peroxidációs, folyamatoknak a következménye. Ezt antioxidánsok, pl. C-vitamin (44. ábra; lásd C-vitamin (aszkorbinsav)), karotenoidok (36. ábra; lásd Karotenoidok), glutation (48. ábra), illetve antioxidáns enzimek, pl. Saccharomyces cerevisiae vagy Lactobacillus lactis szuperoxid dizmutázok, alkalmazásával védhetjük ki. Alternatív lehetőséget jelent az O₂ teljes elhasználása glükóz oxidáz (Aspergillus niger) – kataláz rendszerekkel glükóz additívum jelenlétében.

48. ábra Az antioxidáns glutation és a vaskomplexáló koprogén szerkezete.

A glutation előállítása

A glutation (γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin; 48. ábra) egyre inkább felváltja (felválthatja) a C vitamint az élelmiszerekben, mint antioxidáns hatású vegyület. A glutation túltermelését pékélesztőben (S. cerevisiae) valósították meg. A kihozatal javítása érdekében a következők tehetők meg:

(1)   a citrát ciklus fenntartása, az alkohol termelés minimalizálása, ami a glükóz szakaszos adagolásával biztosítható,

(2)   előnyös a prekurzor aminosavak (L-glutaminsav, L-cisztein és glicin) adagolása,

(3)   a közeg savanyítása (pH 3,5) javítja a glutation szekrécióját,

(4)   a termelő törzsben célszerű eliminálni a glutation felvételét lehetővé tevő transzporter génjét.

A fermentációt követően a tripeptidet vagy ioncserélővel nyerik ki, vagy CuO-dal csapják le, és a csapadékból H₂S-nel szabadítják fel CuS képződése közben.

Sziderofórok

Vizsgálataink szerint az élelmiszeriparban felhasznált Penicillium fajok által termelt vaskomplexáló vegyületeknek, pl. a triszhidroxámsav típusú sziderofór koprogének (48. ábra), szív- és érrendszer védő hatásuk. Mivel a redoxaktív vasat ezek a vegyületek termodinamikailag inert komplexekbe zárják, így nem meglepő, hogy gátolják a kis sűrűségű lipoprotein (LDL) partikulumok szabad hem mediálta oxidációját, és vaszkuláris endotélium sejttenyészetekben szintén gátolják a sejtek oxidált LDL kiváltotta pusztulását. Egér modellszervezetben igazoltuk, hogy a koprogén a tápcsatornából felszívódik. A koprogén mennyisége a Penicillium roquefortiivalérlelt kék márványsajtokban elérheti a 38 mg kg⁻¹ nedvestömeg értéket, aminek ráadásul kb. 1/3-a nincs vassal komplexálva. A koprogén termelést Neurospora crassa gombában optimalizáltuk, és kimutattuk, hogy a kihozatal nagy glükóz- és aszpartát-koncentrációknál, továbbá vashiányos tápközegben (a kék márványsajt is ilyen) és neutrális pH értéken optimális.

Élelmiszer-additívum oligoszacharidok előállítása mikróbákkal

Az élelmiszeriparban hagyományosan felhasznált poliszacharidok általában tengeri moszatokból előállított sűrűsítő és stabilizáló anyagok, ilyenek pl. az agar, az alginát. Ezeket ma már kiválóan helyettesítik a mikrobiális biotechnológiai termékek, pl. a kurdlán (Alcaligenes fajok), dextrán (Leuconostoc mesenteroides tejsavbaktérium), xantán (Xanthomonas campestris) és a gomba eredetű pullulán (Aureobasidium pullulans). A poliszacharidok előállításakor a fermentációs közeg reológiai sajátosságai a fermentáció különböző fázisaiban jelentősen eltérnek a változó viszkozitás miatt. A fermentációkat követően a polimereket általában szerves oldószerrel lecsapják, majd kiszárítják és őrlik.

Az utóbbi időben jelentősen megnőtt a vastagbélben Bifidobacteriumok és Lactobacillusok által metabolizálható, prebiotikum hatású poliszacharidok, pl. az inulin (egy fruktóz polimer) iránti kereslet. Ezt az igény egyelőre növények (csicsóka, örménygyökér) felhasználásával elégítik ki. Ugyancsak prebiotikus hatásúak a növényi pektinek, melyeket gyenge savas extrakcióval nyernek ki (pl. alma, citromhéj). Esetenként a hatékony pektinkinyerés érdekében a növényi részeket fermentálják, pl. a mandarinhéj fermentációja Trichosporin penicillatummal egy napon át.

Fruktózszirup (fruktózszörp) előállítása

A konverzió lényege, hogy keményítőből kiindulva az üdítőitalokban nagy mennyiségben felhasznált fruktózt előállítsák. A konverzió lépései a következők: a keményítőzagy (30-35 w/v %) elfolyósítása magas hőmérsékleten (104-107 °C, 5-8 perc, vagy 94-97 °C, 90-120 perc) 0,05-0,1 w/w % (a keményítőre vonatkoztatva) bakteriális α-amiláz jelenlétében; visszahűtés után a glükóz monomerek felszabadítása gomba eredetű glükoamilázzal (60-62 °C, 65-75 h); glükóz-fruktóz konverzió töltöttágyas, immobilizált glükóz izomerázt tartalmazó oszlopreaktorban. Az oszlopreaktor töltete 140-240 napig aktív, folyamatos működés mellett, de az idő múlásával a szirup tartózkodási idejét növelik az oszlopon az enzimaktivitás csökkenés függvényében. A konverziós ráta 42 % a glükóz-fruktóz átalakulásra nézve.

Húshelyettesítő mikrobiális fehérje (egysejtfehérje, ’single cell protein’, SCP)

Számos szénhidrát, metanol és szénhidrogén alapú technológia került kidolgozásra, de jelenleg csak a Quorn mikoprotein ér el említésre méltó piaci forgalmat. A mikoproteint a Fusarium venenatum (korábbi irodalmakban Fusarium graminearum) folyamatos fermentációjával állítják elő. A fermentáció paraméterei: hígítási ráta: 0,2-1,0; hőmérséklet: 30 °C, pH 6, keményítő hidrolizátum szénforrás, 15-20 g l⁻¹ biomassza kihozatal. A fermentációt követően a biomasszát 64 °C-ra melegítik 20-30 percre, hogy a termék RNS-tartalmát 9-ről 2 % alá csökkentsék.

Élelmiszeripari enzimek

Az enzimek ma a legnyereségesebb biotechnológiai termékek. Az USA-ban 2002-ben ezen termékek  forgalma 1,3 milliárd dollár volt, ez 2007-re 4 milliárdra növekedett és valószínűleg eléri a 7 milliárd dollárt is 2013-ban. Ezen ipari szegmens termékeinek egy részét a nagyvolumenű felhasználás jellemzi az élelmiszer és takarmány gyártás részéről. Ebbe beletartoznak a sütőiparban, italgyártásban, tejiparban, illetve a kiegészítők, zsírok és olajok gyártásánál használt enzimek. Egy tanulmány szerint a jelenlegi enzimfelhasználás 31 %-a élelmiszeripari, 6 %-a takarmánygyártási és a fennmaradó az úgynevezett technikai enzim. Az ipari enzimek 90 %-a mikrobiális, 6 %-a állati és 4 %-a növényi eredetű. A legtöbb ipari enzim mikrobiális eredetű, ezeket a nagy specifikus kihozatal jellemzi, nincs termelés-fluktuáció. A mikrobiális enzimek rendkívül széles spektruma szelektálható, és az ipari genetikai eszközök nagy tárháza elérhető az enzimkihozatal és a tulajdonságok további javításához. Az enzimek felhasználása preferált a sejtekével szemben, mivel a szubsztrát nem alakul biomasszává, a mellékreakciók száma limitált, a reakciókörülmények az enzimre optimalizálhatók és a termék(ek) izolálása könnyebb. A legnagyobb tömegben előállított enzimek: Bacillus proteáz, amiloglükozidáz, Bacillus amiláz, glükóz izomeráz, mikrobiális rennet, gomba amiláz, pektináz, gomba proteáz.

A felhasznált enzimek többsége extracelluláris hidroláz, de az intracelluláris enzimek volumene is nő: pl. glükóz oxidáz, aszparagináz. A sütőipar a-amilázokat, proteázokat, xilanázokat, a sörgyártás amilázokat, glükanázokat, proteázokat (maláta), b-glükanázokat (elősegítik a szűrést), amiloglükozidázokat (alacsony kalóriájú sörök) és proteázokat (zavarosodást gátolnak) használ. A tejipar mikrobiális rennint (mikrobiális koagulánsokat), lipázokat (érlelést segítik), laktázokat használ elsősorban a sajtgyártásban. A keményítő-feldolgozás során amilázokat, amiloglükozidázokat és glükóz izomerázokat alkalmaznak.

A genetikailag módosított mikróbákkal előállított enzimek részaránya nő, különösen, ha az enzim forrása extremofil, nehezen tenyészthető, potenciálisan patogén mikróba vagy magasabbrendű organizmus (pl. Humicola lanuginosa lipáz termeltetése Aspergillus oryzae-ben). Az enzimek tulajdonságainak irányított megváltoztatása („protein engineering”) vagy egyszerű kémiai módosítása („site-directed-mutagenesis”) is lehetséges. Lehetséges célkitűzések: az enzimaktivitás növelése, az enzimstabilitás fokozása, a működési pH- és hőmérséklet-optimum megváltoztatása, az enzimspecificitás megváltoztatása, a termékspektrum módosítása. A kedvező paraméterek javítása, pl. kihozatal, enzimstabilitás növelése. Kedvezőtlen tulajdonságok mérséklése, pl. inducer-igény eliminálása, „feed-back” és termék-gátlások megszüntetése, katabolikus (szén, nitrogén) repressziók feloldása (konstitutíve termelő törzsek, „fed-batch” technikák alkalmazásával), veszélyes, illetve kellemetlen tulajdonságú kísérő metabolitok termelésének megszüntetése.

Az élelmiszeriparban és gyógyászatban felhasznált enzimekre további különleges előírások érvenyesek: alacsony fokú allergén sajátosság, toxikus kisérő metabolitokat teljes hiánya, illetve, hogy a veszélyes mikróbákat el kell távolítani, illetve el kell ölni.

A termelt enzimek 5 %-át már rögzített formában használják (pl. L-aminosavak, szerves savak, fruktóz szirup előállítása). Ennek előnye, hogy az enzimek újra felhasználhatók, stabilabbak, katalitikus tulajdonságaik előnyösen változnak, a termékekben nincs enzim, folyamatos alkalmazást biztosítanak a bioreaktorokban, sőt multienzim rendszerek kialakítása is lehetséges, összetettebb folyamatok kialakítására. Az immobilizálás módja lehet fizikai megkötés (flokkuláció, adszorpció), kémiai megkötés (keresztkötések kialakítása, felülethez kötés), gélbe zárás (főleg sejtek esetén), kapszulázás. Az élelmiszeripar például immobilizált glükóz izomerázt (aminoetil-cellulóz, glutáraldehiddel keresztkötött sejt-homogenizátum, DEAE-Sephadex; fruktóz-szirup gyártás), aminoacilázt (L-aminosavak gyártása), illetve a tejipar laktázt (cellulóz-acetát szálak; laktóz-mentes tej) alkalmaz.

Forrásmunkák

Becker, J. és Wittmann, C. (2011) Systems and synthetic metabolic engineering for amino acid production – the heartbeat of industrial strain development. Current Opinion in Biotechnology 23, 1-8. nem hozzáférhető

Dhillon, G.S., Brar, S.K., Verma, M. és Tyagi, R.D. (2011) Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food Bioprocess Technology 4, 505-529.

Eggeling, L., Pfefferle, W. és Sahm, H. (2006) Amino acids. Basic Biotechnology (Szerkesztők: Ratledge, C. és Kristiansen, B.), Cambridge University Press, Cambridge, oldalak: 335-357.

Fernandes, P. (2010) Enzymes in food processing: a condensed overview on strategies for better biocatalysts. Enzyme Research Article ID 862537, 19 pages doi:10.4061/2010/862537

Feron, G. és Waché, Y. (2006) Microbial biotechnology of food flavor production. Food Biotechnology (Szerkesztők: Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. és Levin, R.E.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, oldalak: 407-441.

Karaffa, L. és Kubicek, C.P. (2003) Aspergillus niger citric acid accumulation: do we understand this well-working black box? Applied Microbiology and Biotechnology 61, 189-196.

Krämer, R. (2006) Production of amino acids: physiological and genetic approaches. Food Biotechnology (Szerkesztők: Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. és Levin, R.E.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, oldalak: 155-192.

Kubicek, C.P. és Karaffa, L. (2006) Organic acids. Basic Biotechnology (Szerkesztők: Ratledge, C. és Kristiansen, B.), Cambridge University Press, Cambridge, oldalak: 359-380.

O’Toole, D.K. és Lee, Y.K. (2006) Food ingredients. Microbial Biotechnology. Principles and Applications (Szerkesztő: Kun, L.Y.), World Scientific Publishing Co., Singapore, oldalak: 351-374.

O’Toole, D.K. és Lee, Y.K. (2006) Enzyme modified food products. Microbial Biotechnology. Principles and Applications (Szerkesztő: Kun, L.Y.), World Scientific Publishing Co., Singapore, oldalak: 375-387.

Pándi, F., Sólyom, L. (1982) Az ecetgyártás. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

Pécs, M. (2011) Fermentációs Feldolgozási Műveletek. Egyetemi tananyag. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

Pócsi, I., Jeney, V., Kertai, P., Pócsi, I., Emri, T., Gyémánt, Gy., Fésüs, L., Balla, J. és Balla, Gy. (2008) Fungal siderophores function as protective agents of LDL oxidation and are promising anti-atherosclerotic metabolites in functional food. Molecular Nutrition and Food Research52, 1434-1447.

Roukas, T. (2006) Biotechnology of citric acid production. Food Biotechnology (Szerkesztők: Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. és Levin, R.E.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, oldalak: 349-405.

Ruijter, G.J.G., Kubicek, C.P. és Visser, J. (2002) Production of organic acids by fungi. The Mycota, X. Kötet, Industrial Applications (Szerkesztő: Osiewacz, H.D.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, oldalak: 213-230.

Sandmann, G. (2006) Production of carotenoids by gene combination in Escherichia coli. Food Biotechnology (Szerkesztők: Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. és Levin, R.E.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, oldalak: 143-153.

Schrader, J. (2007) Microbial flavour production. In Flavours and Fragrances (Szerkesztő: Berger, R.G.), Springer-Verlag, Berlin, oldalak: 507-574.

Stahmann, K.P. (2002) Vitamins. The Mycota, X. Kötet, Industrial Applications (Szerkesztő: Osiewacz, H.D.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, oldalak: 231-246.

Wynn, J.P. and Ratledge, C. (2006) Microbial production of oils and fats. Food Biotechnology (Szerkesztők: Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. és Levin, R.E.), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, oldalak: 443-472.

Önellenőrzés 7

8. fejezet - Probiotikumok és starterkultúrák az élelmiszeriparban (Dr. Pusztahelyi Tünde)

A normál humán mikroflóra általánosan 1014 sejtből áll: ez tízszer több mint az átlagos emberi test 10¹³ sejtszáma. A mikroflóra komplex, dinamikus, változó az étrenddel, korral, életmóddal. A normál emésztőrendszeri mikroflóra számos jelentős tényezőért felel, ilyen az emésztés, átalakítás, patogén érzékenység, enterohepatikus cirkuláció, immunomoduláció. Az enterális mikrobapopulációk tagjai lehetnek autochton állandóan magas szinten jelen lévő fajok, normális gyakori, számában változó, néha eltűnő fajok; valódi patogének – időközönként megjelenő, fertőzést és betegséget okozó fajok; és allochton – más forrásból származó, ideiglenesen megjelenő populációk.

Probiotikumok

Ilja Metcsnikoff (Nobel-díjas tudós) jellemezte először az anyatejjel táplált gyermekek mikroflóráját és leírta a különféle Lactobacillus és Bifidobacterium fajok jelenlétét. Ezek olyan emberek, állatok, madarak emésztőrendszerében élő baktériumok, amelyek túlélik az emésztőtraktust. A megfigyelt számos, a fogyasztó számára előnyös tulajdonságuk miatt a probiotikum elnevezést kapták. A probiotikumok a bélhámsejtekkel kapcsolódva a sejtalkotók és a mikroflórára tett hatás segítségével javítják az immunrendszer állapotát, védik a nyálkahártya integritását, gátolják a káros vagy patogén mikroorganizmusokat (Kiani, 2006):

(1)   antimikrobiális hatás és kolonizáció gátlás,

(2)   immunhatás: adjuváns hatás; citokin expresszió; fagocitózis stimuláció; IgA szekréció serkentése;

(3)   antimutagén hatás; antigenotoxikus hatás;

(4)   hatás az enzimaktivitásokra; enzimszállítás;

(5)   a prokarcinogén és karcinogén anyagok termelésének csökkentése;

(6)   a másodlagos epesavak koncentrációjának változtatása;

(7)   butirát termeléssel az abnormális sejtek (rák) apoptózisának stimulációja;

(8)   laktózbontás;

(9)   a vér koleszterinjének csökkentése.

Ma már számos baktérium probiotikus hatása ismert és alkalmazott (49. ábra). Ezek között a Lactobacillus és Bifidobacterium fajok a jelentősebbek. De egyéb tejsavbaktérium és nem-tejsavbaktérium szintén alkalmazott.

49. ábra Probiotikus termékekben alkalmazott baktériumok. LAB, tejsavbaktérium.

Fontosabb baktériumok ismertetése

Lactobacillusok: kb. 140 faj tartozik ide. Ezek mind Gram-pozitív, kataláz negatív, nem mozgó, nem-spórázó, fakultatív anaerob, mikroaerofil vagy obligát anaerob baktériumok. Vékony pálcák, esetleg spirálisak vagy kokkobacilluszok. A G+C tartalom rendkívül változatos, a 32 % (L. mali) – 54 % (L. pontis és L. fermentum) eltérése átlépi az egy genuszba való tartozás G+C tartalomra vonatkozó kritériumát, ezért lehetséges, hogy nem egy genuszba tartoznak.

A Bifidobacterium tejsavtermelő Gram-pozitív baktérium, amely a Lactobacillusszal ellentétben nem a Clostridia tagja, hanem az Actinomyces osztályba tartozik. A G+C tartalma szintén eltérő: >55%. Nem képez spórát, pálcika, vagy Y illetve V alakú. Általánosan anaerobnak tekinthető, de az oxigéntolerancia változó a fajtól függően. Biokémiai és ökológiai hasonlóságaik miatt a tejsavbaktériumokhoz soroljuk. Ugyanakkor sokkal érzékenyebbek a környezeti változásokra (oxigéntartalom, pH). Probiotikumként történő alkalmazására jellemző, hogy általában önállóan, tiszta tenyészetként szaporítják fel, mivel gyenge kompetíciós képességgel bír és a Lactobacillus-októl eltérő a tápanyagigénye. Gyengébb a túlélőképessége a tápcsatornában és az epesókkal szemben, és eltér az epithél sejtekhez való kötődési képessége. A termékben nem befolyásolják a kialakuló ízt vagy aromát, nem növelik a kialakuló savtartalmat. Szaporításához tápközegként alkalmazható a tej, a savó szerves nitrogénnel és redukáló szerekkel (pl. aszkorbát, cisztein) és a szójatej. Definiált tápközegben nem tenyészthető.

Proteolítikus rendszer

A tejsavbaktériumok (LAB) proteolítikus rendszere biztosítja a baktériumok tejben való növekedését és az aromaanyagok kialakulását a sajtokban. A LAB-ra jellemző az aminosav auxotrófia, több aminosavat igényelnek a növekedésükhöz (pl. a Lactococcus hatot). A tej szabad aminosav tartalma nem elégséges a nagy biomassza eléréséhez a startertenyészetek képzésekor, ezért jelentős proteolítikus rendszerre van szüksége a sejteknek, hogy a megfelelő aminosavakhoz hozzájussanak. A tej fermentációjakor képződő peptidek és aminosavak közvetve vagy közvetlenül részt vesznek az íz kialakításában pozitív vagy negatív módon. A proteolítikus rendszer megismerését követően genetikai úton ennek befolyásolására is lehetőség van. A proteolítikus rendszer alkotói: citoplazma membránon kívül eső (extracelluláris) enzimek, transzport rendszerek; citoplazma enzimek.

A Lactococcus-nak egy plazmidon kódolt extracelluláris szerin proteáza (PrtP) van, ez egy pre-pro-proteináz. Kb. 100 féle oligopeptid képzését biztosítja, amely 20 %-a elég kicsi ahhoz, hogy a transzport rendszeren keresztül belépjen a sejtekbe. Az enzim elvesztése az egytizedére csökkenti a sejtdenzitást. Számos transzport rendszer jellemzi a sejteket. Jellemző a csoport-specifikus aminosav transzport; di/tripeptid transzport rendszerek is vannak, de az oligopeptid transzport rendszer a legfontosabb. Egy operonon kódolt: két ATP kötő fehérjét, két integráns membrán proteint és egy szubsztrát kötő fehérjét tartalmaz; ez 4-18 egységes oligopeptideket szállít oldallánctól függetlenül. Számos sejten belüli enzimet is ismerünk: peptidázok, aminopeptidázok, tripeptidázok, dipeptidázok.

Bakteriofágok elleni védekezés

A tejsavbaktériumok fenntartásának legnagyobb problémája a bakteriofágok elleni védekezés (50. ábra). Legalább tizenkét azonosított tejsavbaktérium fág már ismert, ezek dsDNS cirkuláris vagy ragadós végű fágok, és vannak köztük lizogén vagy temperált fágok is. A fágok elleni harcot Lactococcusban ötféle fágellenes lókusz kódolja, ezek mind plazmidon kódoltak és konjugációs transzferre képesek. Egy adszorpció ellenes, két restrikciós-modifikációs rendszer, és két abortív infekciós mechanizmust kódoló rendszert találunk ezekben a sejtekben. Az fágadszorpció számos tényezőtől függ: a bakteriofág specificitása, a sejtburok állapota, a receptorok hozzáférhetősége és sűrűsége, a plazmamembrán elektromos potenciálja.

50. ábra A bakteriofágok működése a baktériumsejteken és az ellenük fellépő természetes védekezési mechanizmusok. R/M: restrikciós –modifikációs rendszer.

A bakteriofágok először reverzibilisen kötődnek a sejtburokhoz kapcsolt poliszacharidhoz, majd csak ezután lépnek kapcsolatba irreverzibilisen a sejtmembrán fehérjékkel. Az adszorpció gátlására több módszer lehetséges: pl. a fágreceptor eltakarása galaktóz tartalmú lipoteichoin savval (pl. Lactococcus lactis subsp. cremoris SK110); a membrán fehérje kiütése: Lactococcus lactis subsp. lactis C2 törzsben a 32 kDa membrán fehérje hiánya meggátolta az infekciót.

A restrikciós–modifikációs rendszerek gyakoriak, plazmidhoz kötöttek. A két tagja egy helyspecifikus módosító enzim, és a megfelelő hely-specifikus restrikciós endonukleáz. Ez a rendszer segít a saját DNS és a fág DNS elkülönítésében, és inaktiválja az idegen DNS-t. A restrikciós-modifikációs rendszer működésének végeredménye a bakteriofág utódok számának csökkenése. A csökkenés mértéke függ a restrikciós-modifikációs rendszer aktivitásától és a bakteriofág genom restrikciós endonukleáz hasító helyeinek számától. A restrikciót nem szenvedő bakteriofág utód már megváltozott, az adott restrikciós nukleázzal szemben védett utódokat képez. Az ilyen bakteriofágok vizsgálata kimutatta, hogy a genom méretükhöz viszonyítva nagyon kevés restrikciós hellyel rendelkeznek. A régen meglévő fágokban evolúciósan csökkent a restrikciós helyek száma, míg az újonnan létrejövő fágok sokkal érzékenyebbek. A védett fágokban már a restrikciós-modifikációs rendszer módosító enzimének működőképes kópiáját is megtalálták.

Az abortív bakteriofág fertőzés rendszere gyakori a laktokokkuszokban és gyakran kódolt plazmidon vagy episzomákon. Ez meggátolja az adszorpciót követő DNS penetrációt és a bakteriofág lítikus ciklusának korai szakaszát. Eddig 17 gént azonosítottak a laktokokkuszokban, amelynek ebben a funkcióban szerepe van. Minden eddig azonosított génnek szokatlanul alacsony G+C tartalma van, ez horizontális géntranszferre utal. Ezek a gének a restrikciós-modifikációs rendszerrel működnek együtt. A restrikciós-modifikációs rendszer csökkenti az életképes bakteriofág genomok számát, míg az abortív bakteriofág fertőzés rendszere csökkenti a sejtekből kijutó olyan bakteriofág utódok számát, amelyek elkerülték a restrikciós-modifikációs rendszert. Néhány fág képes az abortív bakteriofág fertőzés rendszerét kijátszani, ezek vagy nagyon kicsi változást hordoznak a genomjukban, vagy a gazdasejt DNS-ének egy kis darabját tartalmazzák.

Starterkultúrák előállítása

Választható a gyártó számára, hogy kész starterkultúrát alkalmaz, vagy maga tartja fenn és szaporítja a kultúrákat. Ez sok tényezőtől függ, legfontosabbak a szakértelem és a pénzügyi háttér. A készen vásárolt starterek fagyasztva, liofilizálva, vagy aktív kultúraként kerülnek a gyártó üzemekbe. A starterek előállítóinak alkalmazniuk kell a HACCP rendszer (’Hazard Analysis and Critical Control Points’, veszélyelemzés és kritikus ellenőrzőpontok; lásd HACCP), így biztosított a megfelelő és stabil oltóanyag minőség.

A probiotikus mikroorganizmusokat fagyasztva besűrített, vagy fagyasztva szárított formában állítják elő. A közvetlen felhasználásra alkalmas un. Direct-Vat-Set (DVS) starter kultúrák sejtszáma a megfelelő technológiai hatás eléréséhez 10¹⁰-1011 CFU g⁻¹, a kész fermentált termékben pedig az élő probiotikus sejtszám általában 10⁸-10⁹ CFU cm³ (51. ábra). Így elérhető, hogy a szükséges mennyiségű tejsavbaktérium kerüljön a fogyasztás során a humán szervezetbe.

51. ábra A probiotikus organizmusokat a kellő egészségügyi hatás érdekében nagy sejtszámban kell fogyasztani, ezért a termék gyártása során a sejtek életben maradását biztosítani kell.

A törzstulajdonságokat mára nemzetközileg szabványosították és csak azok ismertethetők el nemzetközileg probiotikus törzsként, amelyek valamennyi tulajdonsága kielégíti az elvárásokat (52. ábra).

52. ábra A probiotikus tenyészetek kiválasztásánál számos követelménynek, elvárásnak kell megfelelnie a vizsgálatok során a tenyészetnek.

A starterek fermentációja során a tenyésztés körülményei, a toxikus melléktermékek, az oldott oxigén mennyisége, és a megfelelően magas végső sejtszám lényeges. A ’down-stream’ folyamatokban (lásd ’Down-stream’ folyamatok) a mechanikai stressz, a szárításnál alkalmazott tápközeg, az esetleges extrém hőhatások, az oxigén-stressz és a dehidráció befolyásolja az életképességet. A tárolás során a hordozó élelmiszer savas jellege, az oxigén stressz, a kompetíció, a hőmérséklet és a nedvességtartalom hat a sejtekre. Az emésztőrendszerbe jutva a gyomorsav, az enzimaktivitások, a fermentálható cukrok és az epesavak jelenléte hat a végül kialakuló sejtszámra (53. ábra).

53. ábra Az előállítástól a felhasználóig a probiotikus törzsekre ható környezeti tényezők.

A probiotikumok előállítása majdnem teljesen kizárólagosan ’batch’ fermentációban zajlik. A ’down-stream’ folyamatokban a sejtek életben maradásának növelésére számos vizsgálat történt. A sejtek életben maradása és szaporodása a környezeti változásokhoz történő alkalmazkodásától függ. Ez pedig rendszerint nagy mennyiségű gén indukciójával jár, stresszválasz-fehérjék szintézisével és az eltérő stresszhatásokra kialakuló keresztrezisztenciával. A jelenleg alkalmazott technikák a termelés, tárolás és emésztés során kapott környezeti stressz hatások kivédésére a sejteknek valamilyen stressz (pl. éhezés, hő, magas só-koncentráció, epesavak, oxidatív stressz, alacsony pH) melletti inkubációját alkalmazzák. Az is ismert, hogy a stacioner fázisban a sejtek toleranciája sokkal magasabb, mint az exponenciális szakaszban. A fermentáció során szubletális stressz hatásoknak teszik ki a sejteket, vagy protektáns anyagokat (pl. betain) adnak, vagy a sejteket mikroenkapszulációval védik.

Leggyakoribb a membrán bioreaktor rendszerben, illetve a sejtcsapdás rendszerben történő fermentáció. A membrán-fermentoros rendszerben a folyamatos tápanyag ellátás biztosított, viszont a sejtek nem mosódnak ki a rendszerből, mert ultraszűrő, vagy mikroszűrő membránnal határolt térben vannak. Így a tápanyagok a sejtekhez jutnak, a termelt metabolitok viszont nem gátolják a további szaporodást.

A polimer rendszerben történő fizikai csapdázás, kikötés, vagy mikroenkapszuláció lehetséges a sejtek védelme érdekében. Élelmiszerben történő alkalmazásokhoz a sejtcsapdázás a legelterjedtebb immobilizációs technika. Hővel történő emulzifikációval (pl. karragenan, gellán), illetve ionotrópos gélképzéssel (alginát, kitozán) cseppekbe zárják a sejteket. A megfelelő tápközegben inkubálva ezeket a gyöngyöket nagy sejtsűrűség érhető el a gömbök felszínétől a gömb belseje felé addig a pontig, ahol a sejtek növekedése már gátolódik a szubsztrát hiánya, a termelt gátló hatású anyagok vagy a helyileg kialakuló alacsony pH miatt. Így nagyobb sejtszám érhető el, a fertőződésektől és a bakteriofágoktól jobban védett a fermentáció, növekszik a plazmidok stabilitása és védettek a rendszerből történő kimosódástól. A gyöngyök felszínéről folyamatosan szakadnak le sejtek, amelyek kimosódhatnak, vagy inokulumként szolgálhatnak egy másik reaktorban (kétfázisú fermentáció).

A mikroinkapszuláció: szilárd, folyadék, vagy gáznemű anyagok miniatűr kapszulákba zárása, amelyek kontrollált viszonyok között engedik ki tartalmukat. Vízben nem oldódó, száraz, kisméretű (<100 mm) kapszulákkal lehet a Bifidobacteriumokat az élelmiszertermékekbe juttatni. Így érhető el a kultúra nagyobb stabilitása, könnyebb kezelhetősége és tárolása, illetve az élelmiszer kisebb hatással lesz a sejtekre.

A Lactobacillusokra jellemező, de a Bifidobacteriumokra nem jellemző a folyamatos tenyészet, ugyanakkor a Bifidobacteriumok szaporítását immobilizált sejtcsapdás fermentációval folyamatos tenyészetben is meg lehet oldani, pl. B. infantis tenyésztése karragenan/szentjánoskenyérmag liszt kevert gyöngyökben, vagy B. longum gellán gyöngyökben. A legújabb kutatások szerint a poliszacharid gyöngyökben immobilizált sejtekkel kevert (pl. kompetitív Lactobacillus /nem kompetitív Bifidobacterium) ’batch’ és folyamatos tenyészetet is alkalmazni lehet. A sejtek immobilizációját mind nagy sejtszám vagy metabolit termelésénél alkalmazzák.

Molekuláris fejlesztési lehetőségek

1982-től nyílt meg a LAB molekuláris genetikai módosításának lehetősége. Ekkor jött létre a Streptococcus (Lactococcus) lactis DNS transzformáció protokollja. Ezután számos plazmid klónozó vektor készült. A 80’-as évektől a genetikai ’engineering’ megszokott lett az ipar számára. Jelentősebb genetikai lehetőség nyílt a LAB proteolítikus rendszereinek megismerésére, feltérképezésére. Az egyéb starterek (Propionibacterium, Brevibacterium, Bifidobacterium) genetikailag nem ennyire feltártak és nem jellemzőek a plazmidok sem rájuk.

A sejtek genetikai elemei a következők: kromoszómák, intronok, transzpozonok, plazmidok. A kicsi kromoszómák (1,8-3,4 Mbp) és a kis redundancia miatt kedvező molekuláris fejlesztési lehetőségeket találunk. A plazmidok számos, ipari szempontból lényeges gént tartalmaznak: laktóz metabolizmus, proteináz aktivitás, oligopeptid transzport, bakteriofág rezisztencia mechanizmus, bakteriocin termelés és immunitás, exopoliszacharid termelés, citrát hasznosítás. Az izolált eddig plazmidok egy kivétellel mind cirkulárisak, a kivételt a Lactobacillus gasseri 48,5 kb méretű lineáris plazmidja alkotja. A rekombináns DNS technológia alkalmazása lehetővé teszi, hogy bizonyos géneket kiüssenek, új bakteriofág rezisztencia mechanizmusokat építsenek be, bizonyos enzimekre túltermelővé tegyék a sejteket.

A legtöbb vektort Lactococcus lactis törzsre fejlesztették ki, de ezeknek a vektoroknak a többségét más LAB sejtekre is alkalmazni lehet. Mind a gördülő kerék, mind a theta-típusú replikációs mechanizmust követő plazmidokat hordoznak, a kialakított vektorok is hasonlóan theta, vagy kerék replikációjúak. A gördülő kerék replikáció során a kialakuló vektor sokkal stabilabb mind szerkezetileg, mind szegregáció szempontjából. Első generációs vektorok: természetes plazmidok replikációs origóját tartalmazzák, élelmiszerben alkalmazható szelekciós markerrel. Lehetnek szűk gazdaspecificitású vektorok (pl. pCI305 Lactococcusban), vagy széles gazdaspecifikussággal bíró vektor (pl. pVS 40). A vektorokba beépített szelekciós markerekre egyre nagyobb az igény, hiszen olyan génekre van szükség, amelyek élelmiszerekben is használhatóak. A szelekciós markerek egy része új fenotípust hoz létre: xilóz, melibióz hasznosítás; kadmium rezisztencia; bakteriocin rezisztencia (nizin, laktacin). A szelekciós markerek más részénél alkalmazható bármely, a sejtek vitalitásához szükséges funkció kondicionális inaktivációja, amely auxotróf mutánst hoz létre: pl. LacF laktóz gén inaktivációjával (L. lactis), vagy az alanin racemáz mutációjával (L. plantarum).

Fág vagy transzpozon integratív rendszereket ismerünk (pl. A2 fág L. caseiben, Mv4 L. delbrueckiiben, TP901-1 L. lactisban). De vannak homológ rekombináción alapuló rendszerek is, ahol nem replikálódó plazmidot alkalmaznak integratív vektorként.

A plazmidok alkalmazása kézenfekvő, de számos hátránya lehet: pl. a plazmid kópiaszáma eltérő lehet, szelekció nélkül elveszhet, és szerkezetileg instabilitás jellemezheti. Ezért egyéb technikák alkalmazása előnyösebb lehet.

Bizonyos DNS szakaszokat a sejtek genomjába is beépíthetünk. Az integráció stabilizálhat egy gént, vagy egy expressziós rendszert, vagy kitörölhet nem kívánt DNS régiókat. Speciális molekuláris jelzések (tag-ek) szintén beépíthetők a törzsek elkülönítésére. Ezek a folyamatok a homológ rekombináción alapulnak. Ekkor viszont gyakran az a hiba, hogy a rekombináció frekvenciája alacsony. Ennek kiküszöbölésére alkalmazható a permisszív replikon, amely csak bizonyos körülmények között (pl. hőmérsékletre) replikálódó plazmid, amit a sikeres sejtbe juttatást követően nem engedünk replikálódni és így a homológ rekombinációt erőltetjük rá. Az allélhelyettesítés stabil DNS inzertálást eredményez, vagy olyan genetikai módosítást, amelyben utána nem kerül egyéb idegen DNS a genomban, mint a kívánt.

Kétszeres ’cross-over’ két homológ régió között lehet spontán folyamat a transzformációkor, vagy lehet elősegített folyamat pl. termoszenzitív plazmidra épülő rendszerben. Ekkor olyan mutációt választottak a vektorban, amely a replikációt csak 30 °C-on engedi, de 37 °C-on nem. Ez a plazmid homológ integrációt biztosít, ha megfelelő hosszúságú DNS szakaszt hordoz (500 bp).

További lehetőségek nem GMO fejlesztésre (Ahmed, 2003), pl. a kémiai mutagenezis, vagy a LAB törzsek közötti génátadás pl. proteolítikus enzimek génjeinek (PepN, PepC, PepX) beépítése élelmiszer szintű vektor rendszerrel, vagy a fágrezisztens törzsek konstrukciója.

A GMO kialakításának lehetőségei pl. GDH beépítés (Peptostreptococcus asaccharolyticus), vagy Bacillus sphaericus alanin dehidrogenáz beépítése.

A specifikus gének expressziója nagyon jelentős a tejiparban. A különböző fenotípus változást, új enzimeket, gátlóanyagokat, vagy a bélrendszer immun-stimulációjához megfelelő felületi antigének expressziójához többfajta rendszer létezik, amelyek beépíthetők a létező vektorokba, pl. nizin, vagy laktóz indukált promoter használható. A Bifidobacteriumokban expresszált gének között vannak már olyanok is, amelyek tumor szupresszor fehérjéket kódolnak, és úgy vélik, hogy ezek a sejtek képesek arra, hogy a tumor hipoxiás részében növekedjenek. Megtörténtek már az első humán kísérletek a rekombináns interleukin-10 termelő Lactococcus törzzsel is. Az élelmiszer-szintű laktokokkuszok, mint bakteriális DNS szállítók alkalmazhatók, így élő, orális DNS vakcinaként az orvosi biotechnológia használja őket.

Forrásmunkák

Doyle, M.P. and Beuchat, L.R. (Eds.) Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers, 3rd edition, Asm Press, Washington, 2007.

Parvez, S., Malik, K.A., Ah Kang, S., and Kim, H.-Y. (2006) Probiotics and their fermented food products are beneficial for health.. J. Appl. Microb. 100, 1171-1185

Önellenőrzés 8

9. fejezet - Ételmérgezést okozó baktériumok és ezek kontrollja (Dr. Pusztahelyi Tünde)

A WHO (World Health Organization) megfogalmazása szerint bármilyen megbetegedés, amit élelmiszer vagy víz közvetít vagy okoz az ételmérgezés. Ennek eredete sokféle lehet: virális, bakteriális, fungális, protozoális, de okozhatják peszticidek, herbicidek, egyéb toxikus vegyületek is. A bakteriális ételmérgezés általában enterális tünetekkel járó hirtelen fellépő tömeges megbetegedés, amelynek az eredete bakterológiai vizsgálattal eldönthető. Mivel ez a leggyakoribb és a legsúlyosabb következményekkel járó, csak ezzzel foglalkozunk ebben a fejezetben.

A patogén baktériumok jellemzése

Hatásuk szerint megkülönböztetünk obligát patogén organizmusokat, amelyek bármely esetben megbetegedést okoznak, és fakultatív patogéneket, amelyek csak bizonyos esetekben váltanak ki megbetegedést. A patogenitás fokát a virulencia fejezi ki. A patogenitásban számos faktor segíti az organizmusokat: ezek az adherencia, penetráció, invázió létrejöttében, illetve toxinok és egyéb anyagok révén a gazdaszervezet károsításában játszanak szerepet. A virulencia tényezők között nem toxikus tényezők pl. az adhéziót biztosító felületi faktorok (fimbriák, tok, egyéb felületi antigének), vagy az antifagociter tulajdonságok hordozóit (pl. extracelluláris enzimek, amelyek antifagociter hatású invazív jellegű faktorok) találhatjuk. Toxikus virulencia tényezők a különböző exotoxinok és endotoxinok.

Az ételmérgezés lehet a nagy sejtszám miatti megbetegedés, azaz infektív bakteriális ételmérgezés, pl. Salmonella, Campylobacter, Vibrio parahaemolyticus és egyéb Vibrio, Yersinia enterocolitica és Y. pseudotuberculosis, enteropatogén és enteroinvazív Escherichia coli (EPEC és EIEC) esetében. Ezek az organizmusok általában Gram-negatív festődésű bacillusok, amelyek kataláz pozitívok. De lehet toxin által okozott ételmérgezés is. Ekkor beszélhetünk az ételben történő baktérium felszaporodásról és toxintermelésről (pl. Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, egyes Bacillus cereus törzsek), illetve a fogyasztó szervezetében történő felszaporodásról és toxintermelésről is (pl. Clostridium perfringens, Bacillus cereus, egyes E. coli (ETEC és EHEC) típusok). Esetlegesen lehet mindkettő egyszerre is (nagy sejtszám és toxintermelés), ezt toxo-infekciónak nevezzük (pl. Salmonella esetében). A toxinok elsősorban az emésztőrendszerre hatnak, de van néhány erős, idegrendszerre ható is, pl. C. botulinum, Staphylococcus neurotoxinja.

A patogenitásban fontos faktorok számos helyen lehetnek kódolva a bakteriális genomban, de általában un. génklaszterekben több ilyen gént találunk egy helyen. Ezeket a helyeket patogenicitási szigeteknek (PAI) nevezzük (54. ábra). Ezek csak patogén törzsekben fellelhető DNS szakaszok. A PAI általában sokkal kisebb G+C% tartalmú, mint a genom egyéb része. Ez általában az evolúciósan nagyon jelentős horizontális géntranszferre utal (Schmidt és Hensel, 2004).

A Salmonella SPI-2 PAI 40 kb méretű, ez a szakasz hiányzik az Escherichia coliból, bár közeli rokonok, és ebből csak 25 kb az, ami a szisztémás infekcióhoz szükséges és a III. típusú szekréciós rendszert és a szabályozó fehérjéit (T3SS rendszer), a szekretált fehérjéket és egyéb szabályzó fehérjéket kódol. A másik része (15 kb) nem szükséges a virulenciához, és metabolikus, még ismeretlen funkciójú géneket kódol pl. az anaerob növekedéshez szükséges alternatív elektron akceptorokhoz szükséges enzimrendszert. A Yersinia enterocolitica HPI PAI az instabil PAI jó példája. A vasfelvétel az extracelluláris proliferációhoz szükséges a gazdaszervezet kolonizációjakor, ennek génjei kódoltak itt. A Staphylococcusaureus Sal PAI nagy számban tartalmaz jelentős funkciókat pl. enterotoxin termelés, vagy lipoprotein termelés.

Az élelmiszer-mérgező baktériumok élettani jellemzői

A Yersinia enterocolitica és a Listeria monocytogenes -1,5 °C-on képes szaporodni. 4,4 °C-on pedig naponta legalább egyszer osztódni képes (1. táblázat). Mivel ez a hőmérséklet a hűtőszekrényekben alkalmazott hőfok, ezért a patogének veszélyes szintre történő szaporodásának meggátlására a tárolási időt szabályozni kell. Ez öt generációt jelent, amely még minimális veszélyforrás, ez pedig öt napnak felel meg. Ez alatt az idő alatt a legtöbb nyers termék szennyeződik (változik a színe, állaga, szaga) a pszikrotróf szennyezők által, amelyek legalább kétszer olyan gyorsan szaporodnak, mint ezek a patogének. Ha 10 Listeria monocytogenes sejt/g élelmiszer (ez elég magas szennyezettség szint) négy generációja osztódik, az 160 sejt/g, ez pasztörizálással biztonságos szintre inaktiválható. Nyersen fogyasztott élelmiszer esetében az alapos lemosás a patogének jó részét eltávolítja és jóval az 1000/g megbetegedést okozó sejtszám alá viszi a terméket.

Clostridium botulinum E típus és bármely nem–proteolítikus törzs esetében a tény, hogy bármely nem-proteolítikus törzs 3,3 °C-nál osztódni képes, azt jelenti, hogy minden pasztőrözött és hűtött élelmiszert, amelyet 5 napnál tovább kell tárolni, 3,3 °C alá kell hűteni. A spórák inaktivációjához az élelmiszereket 82,2 °C-on 15 percig kell melegíteni. Ez alatt a toxinok is eliminálódnak (1. táblázat).

A Bacilluscereus spórái mindenhol megtalálhatók. A baktérium által okozott megbetegedés nem veszélyezteti az életet, inkább nagyon kellemetlen lefolyású. Az élelmiszer újramelegítése nem növeli az élelmiszerbiztonságot, hiszen a hányást okozó toxin jelentős hőstabilitással bír. Az élelmiszer maximum öt napig való tárolása 5 °C-on megfelelő. Hosszabb idejű tárolás esetén a pasztőrözött és lehűtött terméket 3,3 °C alatt kell tárolni (1. táblázat).

A Salmonellaspp. esetében a 4,6 pH érték nem megfelelő a kontrolljához, mivel néhány Salmonella 4,1 értéknél is szaporodik (1. táblázat). Ha tojástartalmú élelmiszerekről van szó (saláták, dresszingek) a pH értéket 4,1 vagy az alatti értéken kell tartani szobahőmérsékleten történő tárolás esetén (citromlé, ecet alkalmazásával elérhető). Ebben az esetben szobahőmérsékletű tárolás mellett is inaktiválódnak a sejtek.

A Staphylococcusaureus hőrezisztens, ezért jó indikátora a pasztőrözés hatékonyságának, higiénés indikátor. Az újramelegítés nem eliminálja a képződő toxint (1. táblázat).

A Campylobacterjejuni élelmiszerben általában nem szaporodik (1. táblázat). Kevesebb, mint 500 sejt betegséget okozhat a fogyasztó számára. Gyakran található szárnyas húsokban több mint 10⁴ CFU g⁻¹ mennyiségben. Könnyen inaktiválható melegítéssel.

A patogének szaporodásának kontroll lehetőségei

A patogén organizmusok szaporodásának kontrolljára általában a különböző fizikai, kémiai és biológiai módszereket alkalmazza az ipar (2. táblázat).

Mindezeken felül számos olyan anyag alkalmazható, amelyek antimikrobiális hatásúak. Ezek lehetnek állati, növényi és mikrobiális eredetű anyagok.

Állati eredetű természetes antimikrobiális hatású anyagok:

(1)   Lizozim: főleg Gram-pozitív baktériumok ellen (Listeria, Clostridium). Hőstabil, alacsony pH-n főzés után is aktív.

(2)   Laktoperoxidáz és tiocianát: Gram negatívok és Gram pozitívok ellen.

(3)   Vaskötő fehérjék: laktoferrin, ovotranszferrin. Például a Mozarella sajt gyártásánál a L. monocytogenes gátlására használják.

Növényi eredetű természetes antimikrobiális hatású anyagok:

(1)   Illóolajok: legerősebb a szegfűszeg, a fahéj, oregano és kakukkfű (eugenol, fahéjaldehid, timol, stb.).

(2)   Egyéb fitoncidok: kémiailag eltérő csoport, illóolaj, mustárolaj, glikozidok.

(3)   Allicin -hagyma, garlicin- fokhagyagyma, tomatin –paradicsom, humulon és lupulon – komló, kapszicidin-paprika.

Ezek általában széles spektrumú gátlóanyagok. A sárgarépalé például gátolja a Listeria fajokat. A kapszicidin a napos csirkéknek adva növeli a Salmonella-val szembeni rezisztenciát. A vörösfenyő kivonat (5 %) elnyomja a Salmonella és az E. coli növekedését húsféléken. A szárított szilva húsfélékben gátolja a E. coli O157:H7, Salmonella, Listeria, Y. enterocolitica és Staphylococcus növekedését. Egyéb anyagok:

(1)   Fitoalexinek,

(2)   Patogenezis függő (PR) anyagok,

(3)   Terpenoidok, alkaloidok, glikoszteroidok,

(4)   Jázminsav, etilén, abszidinsav, szalicilsav,

(5)   Allixin (fokhagyma): antimikrobiális, antioxidatív, antitumorális hatású; gátolja az aflatoxin B2 DNS kötődését,

(6)   Szerves savak és sóik: citromsav, benzoesav, almasav.

A mikrobiális eredetű természetes antimikrobiális hatású anyagok közé az antibiotikumok (lásd Antibiotikumok) tartoznak, amelyek használatára az élelmiszeriparban csak korlátozott lehetőség van. Szigorúan szabályozott a rezisztencia, és keresztrezisztencia kialakulása miatt. Csak a nem gyógyászati célra alkalmazott antibiotikum használható élelmiszerekben, pl. ilyen a natamicin (55. ábra). A natamicin gombaellenes hatású; keménysajtokban és szalámikban alkalmazzák.

55. ábra A natamicin kémiai szerkezete.

A bakteriocinek baktériumok által termelt baktericid vagy bakteriosztatikum hatású fehérjék, amelyek szűk hatásspektrumúak. Bakteriocin termelő kultúrákat gyakran használnak starterként is az élelmiszer gyártásakor, pl. fermentált húsfélék esetében. Kémiai szerkezet szerint három csoportjukat különítjük el.

(1)   Kisméretű lantionint (56. ábra) és metillantionint tartalmazók (pl. nizin),

(2)   Kisméretű, lantionint nem tartalmazó hőstabil peptidek (pl. laktacin),

(3)   Nagyméretű hőre érzékeny fehérjék (pl. heveticin).

56. ábra A lantionin szerkezete.

A bakteriofágok szintén alkalmazhatók antibakteriális tényezőként (Andreoletti és munkatársai, 2009). Temperált vagy virulens vírusok alkalmazhatók. Ezek két úton okozhatnak sejtlízist: a fágszaporodás következtében belülről vagy fágszaporodás nélkül kívülről. A bakteriofágok nagy számban izolálhatók állati eredetű élelmiszerről. Alkalmazásukhoz minél szélesebb gazdaspecifitású fágokra van szükség, de mindig lehetnek mutáns sejtek, amelyek rezisztensek az adott fágra. Passzív kezelés: a külső nagy fág szám esetén a lízis jelentős lehet, és nincs szó a restrikciós enzimek nyújtotta természetes rezisztenciáról. A külső lízis szélessé teszi a gazdasejt elleni specificitást. Aktív kezelés: kis fág mennyiséggel kezelve azok a környező inert baktériumokban felszaporodva a patogén baktériumokat kis kiindulási számuk ellenére is fellelhetik. Az időfaktor jelentős ennél a kezelésnél és a gazdasejteknek jelentős feleslegben kell lenniük. Bizonyos fágok alkalmazhatók a patogén baktériumok kontrolljára az élelmiszerekben (Wagner és Waldor, 2002). Ezek a fágok nem élelmiszer-eredetűek, de olyan forrásból származnak, ahol a patogén jelen van pl. szennyvíz, ürülék, talaj. A fágok alkalmazhatók a bakteriális szennyeződés kivédésére. Ezek a fágok általában élelmiszerből vagy élelmiszergyártásból származnak. De használhatók az antibiotikum rezisztencia csökkentésére antiszensz DNS-t hordozó bakteriofág által szupresszált rezisztencia génekkel. Ez egyelőre kísérleti fázisban van. A fágok alkalmazásának határait a pH tartomány (pH 5-8, vagy 4-10, alacsony hőfokon), a hőmérséklet (függ a fág eredetétől, de általában a fágok toleránsabbak, mint a gazdasejt), a fény (az UV sugárzás DNS sérülést okoz), és az ozmotikus viszonyok (ozmotikus sokk esetén fágszellemek jelennek meg, ahol a DNS hiányzik) határozza meg.

Forrásmunkák

Doyle, M.P. and Beuchat, L.R. (Eds.) Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers, 3rd edition, ASM Press, Washington, 2007.

Jay, J.M., Loessner, M.J., Golden, D.A. (Eds.) Modern Food Microbiology. 7th edition, Springer, New York, 2005

Önellenőrzés 9

10. fejezet - Élelmiszeripari hulladékok és élelmiszer maradékok feldolgozása (Dr. Pusztahelyi Tünde)

Élelmiszeripari hulladék és maradék minden olyan élelmiszer, amely a gyártás vagy a fogyasztás helyén válik hulladékká. A Földön általában 30 %-ra tehető az az élelmiszer hulladék, amely nem is kerül el a fogyasztóhoz, a maradék kb. 15 % pedig a fogyasztóknál válik hulladékká. Az élelmiszeripar részvétele a környezetszennyezésben ugyanolyan jelentős, mint más iparágaké, ezért a hulladékkezelés is ugyanolyan jelentőséggel bír, mint más iparágakban. A szennyezés lehet folyékony vagy szilárd, és rendkívül változatos (összetétel, térfogat, koncentráció). Sajátossága az esetleges szezonalitás.

Élelmiszeripari hulladékok eredete: zöldségek, gyümölcsök tisztítása során keletkező növényi hulladék, állati eredetű tisztítási hulladékok, keményítő gazdag gabonaszemek, agráripari hulladékok (melasz, tejipari savó, gabona hulladék), fermentációs ipari hulladékok. Ezek felhalmozódása nemcsak környezeti károkat okoz, de a nagy mennyiségű maradék hasznosítható anyag (pl. szénhidrátok) elvesztése gazdasági kárt jelent.

Hulladékhasznosítás lehetőségeit jelentik a bioremediáció, talajfertilizáló anyagok és állati takarmány gyártása, biodízel üzemanyagok, egysejtfehérje, és bakteriális poliszacharidok előállítása illetve a biogáz előállítása.

Szerves anyag tartalom, biokémiai oxigén igény (BOI), szilárd anyag tartalom, oldott oxigén tartalom, savasság/bázikusság, hőmérséklet alapján három fő csoportba sorolhatók a szennyvizek: nagy erősségű (KOI > 3000-4000 mg/L, BOI > 1500 mg/L), közepes erősségű, és gyenge szennyvizek. Az aerob szennyvízkezelésre a jelentős BOI csökkenés jellemző.

Aerob szennyvízkezelés

A szennyvizek esetében általában a tisztítás első fokozata a mechanikai tisztítás, amit a biológiai tisztítás követ. Ez gyenge szennyvizek esetében természetes eljárással is véghez vihető talajra árasztással, tavas módszerekkel, illetve gyökérzónás szennyvíztisztítással. A mesterséges eljárásokban csepegtetőtestes, vagy eleveniszapos tisztítás történik. Ezt követi a fizikai-kémiai tisztítás fokozata. A szennyvízben a tápanyag összetétel nagyon változatos, emellett a mikroorganizmusok faja, száma is eltérő lehet. A szennyvíztisztítási eljárásokra változatos aerob és anaerob mikroorganizmusok (heterotrófok, talaj, bélflóra eredetűek, esetleg patogének) jelenléte jellemző. A mikroorganizmusok szaporodását a tápanyagok elérhetősége befolyásolja a legerőteljesebben, de lényeges a szennyvíz reaktorban töltött ideje, a megfelelő oldott oxigén szint biztosítása és a pH értéke. A pH változása, a savanyodás gátló hatású lehet a mikroorganizmusok növekedésére. A magas ammónia, szulfát, foszfát vagy fémtartalom biológiai tisztítást gátló hatásával számolni kell. Emellett a szulfid emisszió oxigén, szulfát és kéntartalmú szennyvizek esetében szintén jelentős lehet. A toxicitás, a korrozív tulajdonság, a kellemetlen szag és magas oxigénigény miatt a szennyvíz erőteljes ellenőrzést igényel. A mikrobák többsége kemoorganotróf, de kemolitotrófok (nitrifikáló és denitrifikáló baktériumok) és nyitott tavak esetén fotolitotrófok is jellemzőek lehetnek. Másodlagos szelekciós tényezőként a nyomás, a sejttömeg és az elektromos töltés ismerhető fel. Minden tisztítóban egyedi organizmus közösség alakul ki. Az aktiv iszapos tisztítókban szuszpendált rendszereket találunk, míg az úgynevezett biológiai szűrőket helyhez kötött organizmusok alkotják.

Az aerob szennyvízkezelési rendszerekben az oldott oxigén koncentrációja lényeges a szén és nitrogénvegyületek oxidálására. Az oxigén oldhatósága függ a gáznyomástól, a vízhőfoktól és a sótartalomtól. Levegőztetéssel állandóan pótolni kell. A levegőztetés növeli az aerob aktivitást. A keveréssel az oxigén bejuttatása, a partikulumok szuszpenzióban tartása és a mikrobasejtek és a szubsztrát találkozásának maximalizálása történik. Nagy tisztaságú oxigén alkalmazása nagy erősségű ipari szennyvizeknél jellemző. Szuszpendált organizmusok keverék tenyészete esetében az aktív iszapos folyamatok folyamatos tenyészetben a mikroorganizmusok diszkrét csomósodását okozzák: ez a flokkuláció.

Az üledék (flokk) képződése során elsődleges partikulumok (2,5 µm), másodlagos partikulumok (13 µm) és harmadlagos partikulumok (125 µm) képződnek számos extracelluláris polimer (poliszacharidok, aminopoliszacharidok, fehérjék és lipidek) és szervetlen anyagok (karbonát, foszfát, nitrát, fém-hidroxidok) segítségével. Az ülepedés hatásosságának növelésére flokkuláló (pelyhesítő) anyagokat, un. flokkulólószereket alkalmazhatnak (pl. PAC (BOPAC), SEDOSAN, FLOKONIT). Ezek a flokk méretét, és így az ülepedési sebességét növelik. Diszpergált növekedés előfordulhat a magas BOI miatt, a magas fonalas organizmus arány (Nocardia-k) miatt is, ekkor tűhegynyi partikulumok jönnek létre. Deflokkuláció bekövetkezhet alacsony pH, vagy oldott oxigén tartalom, toxikus szennyezők illetve erős turbulencia miatt. De a sejtek erőteljes gázképzése (szén-dioxid, metán, kén-hidrogén, nitrogén) és a habképződés szintén akadályozhatják a flokkulációt és az ülepedést. A habképződés oka lehet a magas zsírsav tartalom, a meleg (>18 °C) illetve a hosszú kezelési idő (>9 nap).

A biológiai tisztításban több mint 300 baktérium faj izolálható: pl. Pseudomonas, Flavobacterium, Zoogloea, Arthrobacter, Acinetobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Cytophaga, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter. Holozoikus és szaprobionta protozoák (több mint 200 faj és magas egyedszám jellemzi), ülepedők, helytülők és szabadonúszók is jelen vannak. Rotifera-k vesznek részt az uj partikulumok készítésében a régiek felszabdalásával. Gombák leginkább a savas pH-jú szennyvizekben, egyébként kisebb számban vannak jelen. Az iszapképzésben részt nem vevő organizmusok kimosódnak a rendszerből. Megfelelő méretű partikulumok esetén a belső zóna anaerob lehet, ami kedvező pl. a denitrifikációnak.

A denitrifikálók felelősek a nitrogén termelésért, ezek fakultatív anaerobok, amelyeknél a nitrát elektron akceptor. Ilyen a heterotróf baktériumok között pl. Pseudomonas illetve az autotrófok között pl. Thiobacillus. Jellemzően pH >5 és oldott oxigénből kevesebb, mint 1 mg/L szükséges.

A nitrifikálók aerob kemolitotrófok. Ammóniumból nitrát 4,2 g oxigén /g ammónium nitrogén érték felett képződik. A Nitrosomonas-ok ammóniumból nitritet, míg a Nitrobacter-ek nitritből nitrátot képeznek. Kis növekedési ráta jellemzi ezeket, nagyobb partikulumokban szaporodnak (3-5 nap). Ez hosszabb idő, mint amennyi időt a szennyvíz a reaktortérben tölt. Ezért más technológia kell: kétlépéses technológia a BOI eltávolítás és nitrifikáció megoldására.

A foszfor eltávolítása is jelentős bizonyo sszennyvizek esetében. Ez történhet kémiai úton (csapadékképzés, átalakítás értékes anyagokká, membrános eljárások) vagy biológiai módszerekkel, pl. polifoszfát akkumuláció a sejtekben aerob viszonyok között és felhasználása energiaként anaerob viszonyok között. Ilyen esetekben az egymást követő reaktorok anaerob, aerob, anaerob, aerob rendszerben működnek. Jellemzőek az Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella, illetve Aeromonas fajok.

Az aerob reaktorok egy része fix filmes reaktor. Ezekben a biofilm reaktorokban mozgó vagy álló fázishoz kötődő organizmusok végzik az átalakítási folyamatokat. Alkalmazásukra jellemzők a szűrőágyas reaktorok, itt 1,5-2,5 m mélységű reaktorban 0,5-1 órát tölt el a szennyvíz. A szilárd felületet ásványi anyagok, pl. kő vagy gránit (25-100 mm) adhatják, de a műanyag részecsék, pl. PVC, polisztirén, polipropilén alkalmazása jelentősen megnövelte a készíthető szűrőágyat. Mivel könnyűek a részecskék, itt akár 8 m mély szűrőágy is készíthető, és ez már nagyerősségű szennyvizek tisztítsára is alkalmas. A biofilmet hordozó részecskék lyukakkal, csatornákkal ellátottak a felület és átjárhatóság növelésére. A biofilm képződésében az elektrosztatikus felületi kötődések, a sejtek hidrofilicitása, a felület egyenetlensége, illetve a sejtek által képzett ragacsos mátrix játszik szerepet.

A végső tisztítási lépésként a minőség javítására membránszűréses eljárások alkalmazhatók, de ezek igen drága eljárások.

A szennyvíz anaerob kezelése

Magas KOI és BOI értékkel bíró szennyvizek esetében nem elégséges az aerob kezelés, ugyanakkor a szennyviz alkalmas metán és/vagy hidrogén előállítására. Ezeket a folyamatokat csak baktériumok végzik, az aerob tisztítással szemben.

Az anaerob tisztításnál a folyamat anaerob tavakban vagy zárt emésztőkben (reaktorokban; 57. ábra) mehet végbe. Az iszapfermentációk gazdaságosságát a megfelelő szerkezetkialakítás és a szigetelőanyagok megválasztása biztosítja. A fermentációkban a hőmérséklet szélső értékei 30–60 °C. Hideg rothasztás (15 °C alatt) vagy fűtött rothasztás szintén lehetséges - ezen a hőfokon jelentős biogáz termelés érhető el (Kutasi, 2007;Tóth, Bulla, Nagy, 2011).

Fűtött anaerob rothasztás két hőmérsékleti tartományban mehet végbe:

(1)   Mezofil tartomány (32-38 °C)

(2)   Termofil tartomány (52-58 °C)

A fűtött rothasztásnál kétféle eljárás lehetséges:

(1)   Nedves rothasztás 6 % szárazanyag tartalomnál; ez anaerob rothasztás, mezofil tartományban megy végbe.

(2)   Félszáraz rothasztás 20-30 % szárazanyag tartalomnál; ez kétlépcsős technológia, aerob előkezelés, majd anaerob termofil rothasztás.

57. ábra Konvencionális álló (balra) és új rendszerű (jobbra) anaerob reaktorok.

A szennyvízkezelés mikrobiológiája

Az iszaphidrolízisben először a hidrolizáló mikroorganizmusok a biopolimerek bontásában vesznek részt (zsírok, cellulóz, keményítő, fehérjék lebontása). A savas erjesztést az acidogén és acetogén mikroorganizmusok végzik, amelyek a cukrok, aminosavak, zsírsavak bontásáért felelősek. Az anaerob metanogén mikroorganizmusok képezik a metánt. A metántermelésre képes (metanogén) baktériumok az Archaea domén tagjai (58. ábra). F₄₂₀ koenzim a metán termelés kulcsfontosságú elektron transzfer komponense a metanogén baktériumokban. Az F₄₂₀ bioszintézisének feltételezett útvonala nem ismert, mert egyrészt az útvonalban képzett mutációk letálisak, másrészt a megfelelő molekuláris technikák még nincsenek kidolgozva.

58. ábra Az anaerob iszaphidrolízisben szerepet játszó granulumokat alkotó mikroorganizmusok feladata a lebontó folyamatokban. A vastag nyilak a folyamatok legjellemzőbb irányát jelzik.

A szennyvízben a mikroorganizmusok segítségével granulumok alakulnak ki. A fiatal, kisméretű, fekete granulumok élő mikroorganizmusokat tartalmaznak, kompaktak. A szürke színű granulumok a legnagyobb számban tartalmazzák a sejteket. Sokrétegű szerkezetűek csatornákkal és zárt terekkel. A magot halott vagy éhező sejtek képezik, alacsony aktivitással. A barna színű granulumok a legnagyobbak, ezek laza, amorf szerkezetek nagy csatornákkal. A granulumok felszínén és a csatornákban az aerob, illetve fakultatív anaerob szervezetek, míg a felszín alatti oxigénszegény környezetben az obligát anaerob metanogén szervezetek növekednek. Számos faktor befolyásolja a granulum képződést: a baktériumok jellege, a növekedési ráta, a pusztulási ráta, a bomlási sebesség (Nicolella és munkatársai, 2000).

Alapvető anaerob reaktor típusok

Anaerob félfolyamatos batch reaktor (ASBR)

Az anaerob folyamat egyetlen reaktorban megy végbe. A reaktort folyamatosan működtetik: feltöltik, majd félig leeresztik. A feltöltés során a tartályt biogázzal vagy folyadék recirkulációval kevertetik. A reaktort az előzőleg meghatározott szintre töltik, majd az anaerob folyamatok folytonos vagy megszakított kevertetés mellett mennek végbe. Ezután a kevertetés megszakításával a biomasszát hagyják leülepedni, így kevés szilárd anyag tartalmú felülúszó képződik. Ezt a felülúszót eltávolítják. Újra kevertetni kezdik a szennyvíz bevitellel egy időben. A feleslegben keletkező biomasszát időnként eltávolítják (59. ábra). Ez a technológia jellegzetesen alkalmazható pl. a kólagyártás hulladékának kezelésére, ammónia, cianogén, szulfocián, policiklikus vegyületek, fenol, kinolin, piridin szennyezéssel terhelt vizeknél; söripari szennyvíznél; kasszava tisztítási hulladéknál.

59. ábra ASBR, SGBR és AMBR rendszerű anaerob szennyvíztisztitó reaktorok.

Fixágyas anaerob bioreaktor folyadék recirkuláció nélkül (SGBR)

A reaktor aktív anaerob granulumokkal teljesen feltöltött. A keletkező nagy szemcsesűrűség optimalizálja a mikroorganizmusok és a szennyvíz közötti kontaktust, amely lerövidíti a szerves anyagok és szennyezők konverzióját. A granulumok által előállított gáz biztosítja, hogy a reaktorágy átjárható legyen (59. ábra). Kisebb térfogat, alacsonyabb költségek és nagyobb biogáz képzés jellemző. Az egyetlen mechanikus eszköz a szennyvizet a reaktorba juttatja. Jellegzetesen alkalmazható pl. háziszárnyas vágóhidak szennyvize esetén.

Áramló anaerob iszapágyas reaktor (UASB)

Jellegzetesen alkalmazható szennyvizek: söripari, üdítőipari szennyvíz, desztilláló-ipari és fermentációs ipari szennyvíz, élelmiszeripari szennyvíz, papíripari szennyvíz. A gáz-folyadék és szilárd fázis elválasztása könnyű.

Nyújtott iszapágyas reaktor (EGSB)

Az UASB típusú reaktor változata. Az EGSB előnyei az UASB reaktorral szemben:

(1)   Nagyobb sebességű áramoltatás (4-10 m h⁻¹),

(2)   Nagyobb szervesanyag terhelés (maximum 40 kg KOI m⁻³ nap⁻¹),

(3)   Az iszapágy kiterjesztése illetve mozgatása,

(4)   Kedvezőbb az oldható és híg szennyvizek kezelésére,

(5)   Granuláris aktív iszap jó metanogén aktivitással,

(6)   Jó keverhetőség és jó biogáz termelés.

Anaerob mozgóágyas reaktor (AMBR)

Folyamatosan táplált több egységből álló reaktor, amelyben horizontálisan megfordítható a folyás iránya. A rendszer nem igényel külön gáz-szilárd fázis elkülönítő rendszert és adagoló rendszert. Az effluens reciklizálása nem szükséges, de állandó, lassú kevertetés kell a megfelelő biomassza/szubsztrátum kapcsolathoz. A granuláris biomassza áramlik a rendszerben. A kevésbé granulált biomassza gyorsabban mozog, és végül kimosódik. Az aggregátumok a rendszerben maradnak és méretükben növekednek (59. ábra).

A hulladékok és melléktermékek felhasználási lehetőségei

A meződazdasági, ipari növényi eredetű hulladékok állati takarmány és talajerősítés céljára alkalmazhatók. A kukorica melléktermékek hasznosítása sokrétű. A kukorica glutén jobb takarmány, mint a teljes gabona. A kistermetű, gyorsan növekedő, száraz őrlésű etanol kukorica feldolgozása számos nedves mellékterméket eredményez. A nedves melléktermék kedvező a takarmányozás céljára, de felveti a szállítás és a tárolás kérdését. A fenolsavak, mint a ferulát és a p-kumarát gyakori a természetben, így a kukorica hulladékában is. A Bacillus pumilus víz és szerves oldószer kétfázisú rendszerben vinilguaiakolt képez rajta, ami rendkívül értékes ízesítő, és egyéb értékes aromaanyagok szintézisének alapját képezi. A p-kumarát kemoprotektáns és antioxidáns képzésre használható.

A szójaipari melléktermékek hasznosítása során szintén hasznos anyagokat lehet előállítani. Talajfertilizálásra savhidrolizált szójaolaj, maradék-aminosav fermentációs ipari hulladék a savkedvelő növények számára közvetlenül felhasználható. A szójabab melasz magas flavonoid tartalmú. Ismert izoflavonok: geinstein, daidzein, glicitein, formonetin, genistin, daidzin, szaponin glikozidok. Például a Streptomyces griseus és S. catenulae új vegyületekké tudja alakítani a szójabab geinstein tartalmát.

A bioetanol képzés (Kutasi, 2007) jelentős ipari bioenergia forrás. Forrásai: direkt fermentálható alapanyagok: cukorrépa, cukornád; keményítő tartalmú alapanyagok: kukorica, burgonya, manióka, cellulóz tartalmú anyagok: szalma. Az alapanyagtól függően többféle technológia létezik (60. ábra).

60. ábra A bioetanol gyártási technológiái eltérőek a kiindulási szubsztrátumtól függően: gyors pirrolízis a fermentációs lépésbe integrálva, egyidejű szacharifikáció és fermentáció, híg kénsavas hidrolízis és fermentáció.

A biohidrogén előállítása (61. ábra) is jól ismert folyamat (Tóth, Bulla, Nagy, 2011). A hidrogén gáz termelés biológia folyamatait három kategóriába sorolhatjuk: a víz bio-fotolízise algákkal; a szerves anyag anaerob emésztésének acidogén fázisa alatt sötét-fermentatív hidrogéntermelés; kétfázisú, sötét/foto-fermentatív hidrogéntermelés.

61. ábra A hidrogén termeléshez vezető folyamatok összefoglalása.

Az SCP egysejtfehérje előállítása (lásd Húshelyettesítő mikrobiális fehérje szintén lehetséges szennyvízen. Itt a gombatermesztés és a KOI egyidejű lecsökkentése valósítható meg. Általában Rhizopus és Aspergillus fajok kevertetett levegőztetett rendszerben történő növesztését követően a biomassza szeparáció mikroszűréssel történik. Ez a baktériumokat hagyja eltávozni, de fenntartja a fonalas gombákat. A termelékenység igen jó: 0,29-0,42 g száraztömeg gomba/ g elvett KOI. Mivel a pH 4 körüli, ezért a bakteriális és a fonalas baktériumokkal szembeni kompetíció elhanyagolható. Nagyerősségű szerves hulladékok, koncentrált szennyvizek kezelését aerob élesztő kultúrákkal is el lehet végezni. Candida utilis, Candida quillermondii, Candida tropicalis fajokat gyakran alkalmaznak ilyen jellegű biomassza előállításra. Ez a KOI 75-85 %-ának elvonását jelenti pH 3,5-4 kezelésnél.

Forrásmunkák

Gallert C. and Winter J. Bacterial Metabolism in Wastewater Treatment Systems. In Environmental Biotechnology. Concepts and Applications. Edited by H.-J. Jördening and J. Winter, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005.

Önellenőrzés 10

11. fejezet - Élelmiszerek és allergia, orális vakcinák (Dr. Leiter Éva)

Allergiás reakció

Ugyanazzal az antigénnel való másodszori vagy többszöri találkozás eredményeként alakul ki az allergiás reakció vagy más néven azonnali típusú hiperszenzitivitási reakció. Allergénnek a főként IgE izotípusú antitest termelődését indukáló, azonnali típusú túlérzékenységi reakciót kiváltó antigéneket nevezzük. Az allergén legtöbbször a nyálkahártyán keresztül jut be a szervezetbe. Az allergiát kiváltó anyagok 5-50 kDa móltömegű, szolubilis fehérjék vagy glikoproteinek, melyek nem rendelkeznek semmilyen különleges szerkezeti vagy biokémiai tulajdonsággal. Az antigénnel való találkozás után az allergiás reakció 1-2 percen belül lezajlik. A fejlett országok lakosságának egynegyede allergiás betegségben szenved. Az allergének csak atópiás emberekben okoznak allergiás reakciót, tehát az allergia kialakulását több tényező is okozhatja. Az allergiára való hajlam kialakulásában szerepet játszó tényezők a következők lehetnek:

Az immunrendszer működésének hibái:

(1)   A Th1-Th2 aktiválódásának szabályozása megváltozik.

(2)   Az IgE termelésében zavar lép fel.

(3)   Immunhiányos állapot alakul ki.

(4)   Magas eozinofil granulocita szám.

Genetikai okok:

(1)   Az FcεRI β-láncát kódoló gén (11 q kromoszómán).

(2)   Az IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 és GM-CSF citokineket kódoló gének (5 q kromoszómán).

(3)   Bizonyos MHCII allél-típusok.

Környezeti tényezők:

(1)   Az allergénnel való találkozás körülményei.

(2)   A tolerancia kialakulásának hiánya gyerekkorban, pl. túlzott steril körülmények miatt.

(3)   A normál mikroflóra megváltozása szintén vezethet élelmiszer allergiához, pl. a Bacterioides fragilis poliszacharid A molekulája fokozza a regulatorikus T sejt választ (Vickery és munkatársai, 2011), így ennek a vegyületnek a hiánya allergiához vezethet.

Az allergiás reakció mechanizmusa

A legtöbb esetben a nyálkahártyával borított felületeken keresztül a szervezetbe jutó allergént az antigén prezentáló sejtek a CD4+ T-sejteknek mutatják be, melyek aktiválódnak és Th2 limfocitákká differenciálódnak. Ezek a ’helper’ sejtek közvetlenül, illetve interleukinek termelése révén (IL-4, IL-13) aktiválják a B-sejtek IgE-t termelő plazmasejtté való alakulását. Az allergénre specifikus IgE (amely gyakran poliklonális, mivel az allergénnek több epitópja is van) ezután a szervezetben található hízósejteknek és a vér bazofil granulocitáknak az IgE specifikus FcεRI receptorához kötődik. A szervezetbe újra bekerülő allergén kötődik ezekhez a receptorokhoz, ami aktiválja a hízósejteket és a bazofil granulocitákat és ezek granulumainak ürítéséhez vezet. A felszabaduló mediátorok (pl. hisztamin) a különböző célsejtekre hatva okozzák az allergiás tüneteket, pl. tüsszögés, könnyezés (nyáktermelő mirigyekből), viszketés (szenzoros idegvégződések ingerlése miatt), ödémás duzzanat (kiserek áteresztő képességének fokozása, simaizom kontrakciója), nehézlégzés (bronchusok szűkítése) (62. ábra).

62. ábra Az azonnali túlérzékenységi reakció mechanizmusa.

Hízósejtek FcεRI általi aktiválása

Az allergén a hízósejteket érzékenyítő IgE-vel reagálva keresztköti az FcεRI komplexeket. A receptorkomplex jelátviteli útvonalakat indít el, mely a mediátorok felszabadulásához vezet. A PLCg útvonal (PIP₂-ből IP₃ és DAG keletkezik) az intracelluláris Ca²⁺ felszabadulását indukálja, mely a hízósejtekben található granulumok ürítéséhez (pl. hisztamin) vezet. A MAP-kináz útvonalak aktiválása citokin gének átírását (pl. IL-3, IL-4, IL-5, TNFα) aktiválja. A PLA₂-jelátviteli útvonal a membránban található foszfatidil-kolin bontása révén vérlemezke aktiváló faktor, prosztaglandinok és leukotriének termelését indukálják (63. ábra).

I-es típusú túlérzékenységi reakció késői fázisú reakciója

A 2-8 órával az azonnali reakció után kialakuló, több napig eltartó ún. késői fázisú reakcióban más sejtek és molekulák is részt vesznek. A folyamatot újonnan szintetizált mediátorok (lipidmediátorok) indítják el és IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 és TNF-α termelődik, melyek között kemotaktikus és gyulladáskeltő citokin is található. Az allergiás reakció területéről származó mintákban eozinofil és neutrofil granulociták mutathatók ki. Az eozinofilok által termelt fehérje a ’major basic protein’ (MBP) szövetroncsoló hatású. A szisztémás anafilaxiás reakció halálos kimenetelű lehet, mivel az allergén a vérkeringésbe kerül (pl. rovarcsípés, gyógyszerallergia), ezért az egész szervezet érintett lesz. Ha a beteg a sokkot túléli, kialakulhat csalánkiütés, asztma, tüdővizenyő.

Élelmiszer allergia

Az élelmiszerekkel szemben kialakult reakció kétféle lehet, és attól függően, hogy milyen patofiziológiai mechanizmus játszódik le a szervezetben, beszélhetünk élelmiszer intoleranciáról vagy élelmiszerallergiáról. Az élelmiszer intoleranciát az élelmiszer maga okozza (pl. gyógyszer, toxinok) vagy a szervezet működési zavara (pl. laktáz deficiencia) miatt alakul ki. Nem alakul ki mindig és gyakran dózisfüggő. Az élelmiszer allergia pedig abnormális immunválasz valamilyen élelmiszerre egy érzékeny szervezetben. Minden alkalommal kialakul, ha az allergén jelen van a szervezetben és nagyon gyakran nem dózisfüggő a reakció.

Az allergiás reakció tüneteit már Hippokratész is leírta. Számos élelmiszer okozhat allergiát, pl. tojás, tej, mogyoró, szezámmag, búza, szója, hal és tengeri ételek. Az élelmiszer allergia eltérő a különböző országokban az élelmiszer típusát tekintve. Például, Oroszországban a citrusfélék, csokoládé, alma, hal, paradicsom, tojás; Svédországban a dió, alma, körte, kivi, csonthéjasok, sárgarépa; USA-ban a tej, tojás, mogyoró, szója, hal okoz elsősorban allergiát. A fejlett országokban a gyerekek 6 %-a, míg a felnőttek 3-4 %-a szenved allergiás megbetegedésekben (Mousallem és Burks, 2011).

Az élelmiszerekkel szembeni tolerancia kialakításában a Foxp3+ (regulatorikus) T sejtek (későbbiekben Treg sejtek) játszanak szerepet. A toleranciát a CD103+ dendritikus sejtek iniciálják (a CD103 sejtek proinflammatorikusak), melyek a gasztrointesztinális lamina propriában találhatóak. Ezek veszik fel az antigént és mutatják be az elsődleges nyirokcsomókban a regulatorikus T sejteknek, melyek elvándorolnak a lamina propriába. A lamina propriában található CX₃CR1+ dendritikus sejtek/makrofágok fokozzák az antigén specifikus Treg sejtek expanzióját és ezzel kialakul az élelmiszer tolerancia. Az antigén módosítása cukormolekulákkal lehetővé teszi a dendritikus sejtekhez a SIGN-RI receptoron való kötődést, amely fokozza a toleranciát a Treg sejtek IL-10 termelésén keresztül. Ezen alapulva történhet a jövőben immunterápiás kezelés, persze felmerül a kérdés, hogy ha már kialakult az antigénnel szembeni érzékenység, vajon a Treg sejtek használhatók-e terápiára (Berin és Sicherer, 2011).

Kimutatták, hogy az allergia kialakulása nagyon gyakran azzal magyarázható, hogy az allergén nem a szokásos úton kerül be a szervezetbe, pl. a földimogyoró nem a tápcsatornán, hanem a bőrön keresztül. Nagyon gyakran a feldolgozott élelmiszerek fokozzák az allergiás reakciót, ugyanakkor bizonyos élelmiszerek tartalmazhatnak olyan komponenseket az allergén mellett, melyek gátolják az allergiás reakciót, pl. a szójában található izoflavonok ilyenek, ezért a szója hiába homológ a földimogyoró allergénekkel, nem vált ki olyan erős allergiás reakciót. A földimogyoró közvetlenül a komplement rendszert aktiválja, amely a makrofágok aktivációjához vezet és ez vérlemezke aktiváló faktor felszabadulását eredményezi.

A glikozilált antigének a SIGN-RI receptoron keresztül a dendritikus sejteket a Treg sejtek aktiválására késztetik. Ha ezek az antigének a dendritikus sejtek-SIGN receptorokon vagy ’scavenger’ receptorokon (SR) keresztül kapcsolódnak, akkor Th2 immunválasz fog aktiválódni. Például, a földimogyoró hőkezelése fokozza az allergén fehérjék glikozilációját, ezzel magyarázható, hogy a fejlett országokban, ahol pörkölt földimogyorót fogyasztanak, nagyobb a földimogyoróval szembeni allergia aránya.

A tejben található szfingolipidek közvetlenül az ölő sejteket aktiválják, amely Th2 citokinek, pl. IL-4 és IL-13 felszabadulását eredményezik, ez a folyamat tehát szintén allergiás reakciót indukál (64. ábra) (Berin és Sicherer, 2011).

64. ábra A természetes immunválasz aktiválása élelmiszerallergének által. DC: dendritikus sejt, PAF: vérlemezke aktiváló faktor, iNKT: invariáns természetes ölő sejt.

Az IgE szint az allergiás betegeknél annak ellenére is magas, hogy nincs jelen az allergén, ami azt jelenti, hogy mindig vannak jelen olyan plazmasejtek, melyek az IgE-t folyamatosan termelik. Megfigyelték, hogy azoknál a gyerekeknél, akiknél csökken az IgE szint, kialakul tolerancia.

Az élelmiszer allergia kialakulásának több mechanizmusa is van (65. ábra).

(1)   Hisztamin felszabadulás és vérlemezke aktiváló faktor-felszabadulás a hízósejtekből.

(2)   Immunoglobulin könnyű láncok eddig nem ismert módon okoznak allergiát (pl. kazein allergia).

(3)   NLRP3 (Nod-like receptor) inflammoszómában bekövetkező mutációk, amely fokozott expresszióhoz vagy stabilitáshoz vezet, pl. élelmiszer és aszpirin anafilaxiát okoz (Berin és Sicherer, 2011).

65. ábra Az élelmiszer indukálta anafilaxis immunfolyamatainak háttere. PAF: vérlemezke aktiváló faktor, NLRP3 (Nod-like receptor): inflammoszóma.

A tolerancia kialakításában/kialakulásában fontos szerepe van annak, hogy csecsemőkorban mekkora allergén dózissal találkozunk először. Kisebb dózis ugyanis toleranciához vezet. Ugyanilyen fontos az is, hogy mikor találkozunk először az antigénnel: a túl korai találkozás allergia kialakulásához vezethet. Egereknél igazolták, hogy a születés után 7-10 nappal adva az ovalbumint tolerancia alakult ki, míg ha ez korábban történt, közvetlenül a születés után, az allergiához vezetett; az, hogy embernél mennyi ez az időszak (’window’), egyelőre nem ismert. A gyomor-bél traktus megnövekedett permeabilitása, azaz, ha az epitélium sejtjei nem záródnak kellő módon, szintén fokozza az allergia kialakulását (Vickery és munkatársai, 2011). Nem csak a hízósejtek, hanem a bazofil sejtek is szerepet játszanak az allergiás tünetek kialakulásában.

Az immunválasz lehet:

(1)   IgE-mediált (legtöbb esetben): anafilaxis, ödéma, akut rinitisz, asztma.

(2)   Sejt-mediált, leggyakrabban a gyomor béltraktusban alakul ki: atópiás dermatitisz, nyelőcső és bélgyulladás.

(3)   a kettő keveréke, azaz IgE és sejtekkel kapcsolt immunválasz: pl. kontakt dermatitisz, kolitisz.

Tünetek: a száj körüli terület kipirosodik és megduzzad, de súlyosabb tünetek is kialakulhatnak, ilyenkor az allergén-IgE keresztkötés a hízósejteken simaizom kontrakciót indukálhat, ami hányáshoz vagy hasmenéshez vezet. Az allergén beléphet a véráramba is, mivel a hízósejtek granulumainak ürítése miatt megnő a nyálkahártya permeabilitása. Emiatt kialakulhat asztma, csalánkiütés, vagy ekcéma, súlyosabb esetekben anafilaxiás sokk. Elsősorban csecsemőkorban és gyerekeknél fordul elő, ezért is nagyon fontos az anyatejjel történő etetetés. Az USA-ban évente 200 ember hal meg élelmiszerek okozta anafilaxiás reakcióban. Túlzottan higiénikus körülmények, túl sok antibiotikum használata okozhatja az allergiás reakció kialakulását. Gyakran keresztszenzitivitás alakul ki, pl. tejallergia-szójaallergia. Megoldás lehet az alacsony allergén hatású variáns előállítása vakcináció céljából.

Terápiás lehetőségek

Az egyedüli elfogadott „terápia” az allergén táplálék eliminálása. A legtöbb országban törvények szabályozzák, hogy az élelmiszereken fel kell tüntetni az összetételt, főleg a legfontosabb allergéneket. Gyakran epinefrin injekció van azoknál, akiknél az ételallergia súlyos anafilaxiás sokkot vált ki.

Lehetőségek:

(1)   a deszenzibilizálás kialakítása; ilyenkor IgG típusú ellenanyagok termelődnek, melyek megakadályozzák az allergén kötődését a bazofil sejtekhez és a hízósejtekhez, vagy az allergén-IgG komplex gátolja a B sejtek aktivációját. A deszenzibilizálás során elsősorban Th1 sejtek aktiválódnak, ami nem kedvez az IgE termelődésének. IgE-ellenes antitestek (lásd pl. Omalizumab) adásával is megvalósítható.

(2)   tolerancia kialakítása: a nyálkahártyán keresztül a Th sejtek gátlásával.

(3)   az immunrendszer „eltolása” Th1 irányba (pl. IFNg adásával).

Példák:

(1)   Nyelv alá helyezett allergénnel csökkentették a mogyoró allergiát felnőtt emberekben. Ebben az esetben a Langerhans sejtek veszik fel az allergént és toleranciát alakítanak ki.

(2)   Orális immunterápia alkalmazása az allergén növekvő dózisát adagolva, pl. allergén fehérjéket almaszószban oldanak, és ezt kell elfogyasztani. Alkalmas terápia, pl. tojás, tej és földimogyoró allergia esetén.

(3)   Hővel kezelt tejfehérjék adagolása, pl. muffinnal.

(4)   Epikután immunterápia, pl. tejfehérje allergia esetén.

(5)   Szubkután immunterápia, amelyet szénanátha esetén már sikerrel alkalmaztak. Ezt a módszert használják, pl. földimogyoróval szembeni tolerancia kialakítására.

A deszenzibizálás és később esetlegesen a tolerancia kialakítása révén elkerülhetőek az anafilaxiás reakciók, pl. ha valaki teljesen véletlenül földimogyorót tartalmazó kenyeret fogyaszt. Egy új lehetőség: a galectin-9 mintázatfelismerő receptor indukálása. Ez ugyanis védelmet nyújt az allergiás reakcióval szemben, mivel a Th1 és Treg irányába tolja el az immunválaszt. A galectin-9 közvetlenül tud kötődni az IgE-hez, megakadályozva az IgE bekötődését a receptorához a hízósejtek és granulociták felszínén. A galectin-9 indukálható cukorszármazékok adásával, pl. galakto- és frukto-oligoszacharidokkal (Sziksz és munkatársai, 2012).

Az anyatej szerepe az allergiás betegségek kivédésében nem elhanyagolható. Legalább három hónapig tartó kizárólag anyatejjel történő etetés csökkenti az atópiás dermatitisz kialakulásának kockázatát. Ugyanakkor az anyatej védő hatását nem tudták egyértelműen igazolni asztma, élelmiszer allergia, allergiás rinitisz esetében (Kramer, 2011).

Orális vakcinák

A magasabbrendű növények (dohány, burgonya, paradicsom, banán) kloroplasztjába vagy genomjába integrálhatunk géneket, melyekről bioreaktorban vakcinafehérjék termelődnek, és ezeket orális vagy parenterális úton adják be (Sala és munkatársai, 2003). A gének rekombináns vírusokkal bejuttathatók a növénybe. Eredményes kísérletek: dohányban Streptococcus mutans felszíni fehérje antigén (SpaA) termeltetése, egyéb növényben Hepatitis B felszíni antigén, Escherichia coli enterotoxin, veszettség vírusának glikoproteinjének előállítása. A vakcina szájon át történő beadásával a nyálkahártya IgA szintje és a szérum IgG szint megemelkedik. Az orális vakcinák használhatók autoimmun betegségek kezelésére is, az immuntolerancia kialakítására, sőt olyan epitópok előállítására, melyek toxikusak tumorokra; vagy akár immunglobulinok termelésére (3. táblázat).

3. táblázat Az orális vakcinák növényi sejtekben történő előállításának előnyei.

Orális vakcina előállítási lehetőségei

Dohány, burgonya, paradicsom, banán, kukorica, saláta, csillagfürt alkalmazható termelő szervezetként (4. táblázat). A növény kiválasztásánál fontos, hogy hogyan akarjuk a vakcinát alkalmazni. Például, ha ehető vakcinát akarunk előállítani, akkor olyan növényt kell alkalmaznunk, mely fogyasztható, így nem kell az antigént tisztítani. Dohányban könnyű a genetikai manipuláció, ismert a genomja, könnyű transzformálni, ezért jól használható. Bizonyos esetekben hővel is kezelhető a növény, ha az antigén hőlabilis (pl. E. coli hőlabil enterotoxinja). Állatok esetén takarmánynövényt érdemes kiválasztani a vakcina termeltetésére.

4. táblázat Növényben előállított antigének.

Orális vakcina alkalmazási lehetőségei

(1)   Fertőző betegségek: elsősorban emberi vírusok és baktériumok esetén, de vannak állatokat megbetegítő vírusok elleni vakcinák is, pl. a Newcastle vírus és a száj-és körömfájás vírusa ellen.

(2)   Autoimmun betegségek esetében, pl. artritisz, sclerosis multiplex, I. típusú diabetesz, autoantigének előállítása lehetséges, mellyel tolerancia érhető el.

(3)   Tumorok esetében: csak bizonyos antigének jelennek meg nagyon gyakran a tumorok felszínén, pl. melanóma, mellrák esetében, ezeket az antigéneket kell növényekben előállítani.

Antigén előállítása növényekben

Az antigént kódoló DNS-re és a megfelelő transzformációs rendszerre van szükség (66. ábra). Az idegen DNS vagy a genomba vagy a kloroplaszt genomjába integrálódik. Mind a genom, mind a kloroplaszt DNS-e képes nagyobb idegen DNS szekvenciák befogadására. Lehetőség van arra is, hogy először a vírust transzformáljunk, majd ezzel fertőzzük a növényt.

66. ábra A transzgénikus növények előállításának módszerei.

Technikák:

(1)   Kodonok módosítása, megfelelő növényi promoter, ’leader’ szekvencia (legtöbbször tobacco etch vírus leader), poliadenilációs szignál használata.

(2)   Hordozó (’carrier’) fehérjék alkalmazása, ha kis alegység méretű vakcina termeltetéséről van szó.

(3)   cpDNS-be (’circular chloroplast’ DNA) klónozzuk a kívánt gént, ennek előnye, hogy homológ rekombinációra van lehetőség, így növelhető a rekombináns fehérje termelése

(4)   Növényi vírusok (pozitív egyszálú RNS), pl. lucerna mozaik vírus használata.

(5)   Legtöbbször a vírus kapszid fehérje mellé integrálják az idegen nukleinsavat. Ilyenkor csak a fertőzött növények termelnek rekombináns fehérjét, a virális genom nem integrálódik be a növényi DNS-be. A rekombináns fehérje nem zavarja meg a vírus összeszerelődését.

Az antigén működése a beadás után

A legtöbb fertőző anyag a nyálkahártyán keresztül lép be a szervezetbe, ez IgA típusú immunválaszt indukál. Mivel a növényi sejtfal védő hatású az antigénre nézve, így nem csak nyálkahártyához kötött, hanem szisztémás immunválasz is kialakul, mivel a bélből fel tud szívódni az antigén. Az antigén immunogenitása fokozható a fentebb említett carrier fehérjékkel. Bizonyos esetekben, ha a terápia azt teszi szükségessé, pl. tumorok ellen, akkor ki kell tisztítani a növényből az antigént és injekció formájában beadni.

Biztonság és elfogadottság

Az orális vakcinák biztonságosak, mivel nem tartalmaznak emlős patogéneket, illetve a növényi DNS nem lép kapcsolatba az állati genommal. Biztonságosak, mivel a növényi DNS nem integrálódik az emlős genomba, a növényi vírusok nem fertőzik meg az emlős sejteket. A problémát az idegen gén terjedésének a megakadályozása okozza, mivel a pollen hordozhatja az idegen gént. A rekombináns gén terjedése a természetben pl. öngyilkos gének beépítésével, apomixissel és kloroplaszt transzformációval (lásd még Hímsterilitás) kerülhető el. A másik probléma, hogy gyakran antibiotikum rezisztencia markert használnak a rekombináns növények szelektálására. Ehelyett a rekombináns növényeket meg lehet különböztetni pl. más színt okozó gének beépítésével.

Tisztított antigének esetében gyakran adjuvánsok alkalmazása szükséges. Az adjuvánsokat általában kémiailag hozzákötik az antigénhez vagy a két kódoló gént fúzionáltatják. Ilyen termékek például a következő antigének:

(1)   Kolera toxin B alegység (CTB)

(2)   Hőlabilis E.coli enterotoxin

(3)   Lektinek

(4)   Mukoadhezív anyagok (pl. karboximetil-cellulóz).

Forrásmunkák

Gergely, J., Erdei, A.: Immunbiológia, Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2000.

Berin, M.C., Sicherer, S. (2011) Food allergy: mechanisms and therapeutics. Curr Opin Immunol. 23, 794-800

Sziksz, E., Vannay, A., Haczku, A. (2012) Galectin-9: a suppressor of food allergy? Allergy 67: 293-295.

Önellenőrzés 11

12. fejezet - Immunokémiai eljárások és bioszenzorok az élelmiszeranalitikában (Dr. Leiter Éva)

Az USA-ban az 1900-as évek előtt nem léteztek szabályozások, törvények az élelmiszerek vizsgálatára, beleértve a mikrobák általi kontamináció vizsgálatát is. Az élelmiszerek nagyobb mennyiségben, nagyobb távolságokra történő szállítása azonban növelte a kontamináció veszélyét is, pl. a tej válhatott volna olyan fertőző betegségek terjesztőjévé, mint a diftéria vagy skarlát. Az élelmiszerek tesztelésének bevezetését az olyan lelkiismeretlen termelők is elősegítették, akik pl. a tejet vízzel hígították, a kávéba vagy kakaóba szénport vagy fűrészport raktak, illetve gyakran mérgező bórax vagy formaldehid hozzáadásával akadályozták meg az élelmiszerek romlását. A HACCP rendszer (’Hazard Analysis and Critical Control Points’, veszélyelemzés és kritikus ellenőrzőpontok; lásd HACCP) bevezetése lehetővé tette az élelmiszerek szigorú ellenőrzését.

Az 1950-es években a DNS felfedezésével a molekuláris biológia fejlődése megindult. Az 1970-es években a restrikciós enzimek felfedezésével a DNS klónozási technikák megjelentek. A monoklonális antitestek előállításával lehetővé vált az antigének specifikus (akár egy epitópra történő) detektálása. Eközben óriási fejlődésnek indult a fermentációs technológia. Az 1990-es évektől kezdődően megjelentek a bioszenzorok, DNS próbán és monoklonális antitesten alapuló detektáló rendszerek, rekombináns enzimek. 2000-től pedig a chip- és nanotechnológia felfedezésével lehetővé vált a nagyszámú és kismennyiségű minta detektálása, akár az élelmiszerek tesztelése során is (67. ábra).

67. ábra A biotechnológia fejlődésének története.

Problémák az élelmiszerek kontaminációjának tesztelése során

Általában a mikróbák és az általuk termelt toxinok kimutatása többféle folyamatot és hosszan tartó inkubációt igényel, ezért néhány napig (túl hosszú idő) tart a tesztelés. Számos baktérium a normál flórában is megtalálható, nyers ételekben ez zavarhatja a mérést. Gyakran nagy mennyiségű mintára van szükség a kimutatáshoz (pl. Salmonella esetében 25 g minta a minimum). Ezért több megoldás is nyílt:

(1)   A minták extrakciója és koncentrálása toxin kimutatására.

(2)   A minták dúsítása a patogén mikróbák kimutatására; a dúsítás időigényes, de még a gyorstesztek is igénylik a minták dúsítását.

(3)   ATP-alapú tesztek; kromogén vagy fluorogén szubsztrátot tartalmazó táptalajok használata; toxinokat kimutató gyorstesztek; DNS-alapú tesztek (pl. PCR) alkalmazása.

Gyorstesztek

Miniatürizált biokémiai tesztek

Ezek a tesztek csökkentik a kimutatási időt, a szükséges táptalaj mennyiségét. Gyakran ezek a tesztek alkalmasak automatizált kimutatásra is (pl. Vitek készülék), ez akkor nagyon fontos, ha nagyszámú mintát kell ellenőrizni (kolorimetriás reakción alapuló tesztek, zsírsav termelés kimutatása gázkromatográfiával, szénforrások oxidálásának kimutatása kolorimetriásan). A mintákat általában 18-24 óráig kell inkubálni és 90-99 %-ban megbízhatóak a kapott eredmények. A legtöbb ilyen gyors teszt biokémiai tulajdonságokon alapul. Pl. RapID teszt: Enterobacteriaceae, BactoScan: baktérium kimutatása; API teszt: pl. Enterobacteriaceae, Listeria, Staphylococcus.

Speciális szubsztrátok és táptalajok

Speciális szűrési technikák, pl. hidrofób rácsos membrán teszt (’hydrophobic grid membrane filter’, HGMF), eldobható táptalaj lapok (Petrifilm), kenetvevő tesztek, melyekkel a felszínt vagy a környezetet lehet tesztelni, tartoznak ide. A HGMF nagyobb sejtdenzitást is elbír, ezért a telepképző egység (’colony forming unit’, CFU) meghatározásánál nem szükséges olyan nagyfokú hígítást elkészítése. Kromogén és fluorogén szubsztrátok használata is gyakori, pl. ATP kimutatása luciferáz teszttel az élelmiszerek baktérium tartalmának meghatározására. ATP jelenlétében a luciferint a luciferáz oxiluciferinné alakítja, amely fotonok képződésével jár. A képződő fényt luminométerrel lehet detektálni. Nem szükséges a mintát dúsítani, a módszerrel 10⁴ CFU ml⁻¹ baktérium koncentráció detektálható 5-10 perc alatt. Ezzel természetesen csak összcsíraszám határozható meg, nem alkalmas adott baktérium detektálására. Staphylococcus aureus elkülönítése a többi Staphylococcustól a foszfolipáz C aktivitás kimutatására alkalmas kromogén táptalajon történk. E.coli esetén β-galaktozidáz, β-glükuronidáz kimutatására a következő kromogén szubsztrátok alkalmasak: o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG), 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid (X-Gal), 4-metilumbelliferil-β-D-glükuronid (MUG).

Immunokémiai eljárások

Ide tartoznak a különböző antitest alapú eljárások. A latex agglutinációs teszt antitesttel kötött latex gyöngyökkel vagy kolloidális arany szemcsékkel történik, melyek antigén jelenlétében agglutinálódnak; a módszer nem túlságosan érzékeny (10⁷ CFU ml⁻¹) és tiszta tenyészetet igényel, viszont nagyon gyors. A reverz passzív agglutinációs teszt (’reverse passive latex agglutination’, RPLA) toxinok kimutatására alkalmas; ebben az esetben a toxin szolubilis formában van. A módszert élelmiszerek toxintartalmának kimutatására, illetve tiszta tenyészetek toxintermelésének kimutatására használják. A gél immundiffúziós teszt pl. a Salmonella 1-2 teszt (68. ábra), ahol az L-alakú kamra két részből áll: inokulációs kamra és mozgásképesség vizsgálati kamra, melynek csak a mozgásképesség vizsgálati része tartalmaz a Salmonella flagellumok elleni antitestet; ez a teszt csak az élő, mozgó baktériumot detektálja, ezért kiváló teszt a Salmonellákhoz közeli Shigellak elkülönítésére.

68. ábra Salmonella 1-2 teszt.

Az immunomágneses elválasztáshoz mágneses gyöngyökre kötik ki az antitestet, a hozzákötődő antigénnel ez könnyen elválasztható, nem szükséges inkubáció, a sejtek nem sérülnek. Ilyet használnak pl. Listeria sp., Salmonella sp., enterohemorrhagén típusú E. coli (EHEC) kimutatására élelmiszerekből.

Az ELISA (’enzyme linked immunosorbent assay’) tesztek sokféle típusát ismerjük, a leggyakrabban szendvics ELISA-t használnak, pl. Salmonella-Tek, Listeria-Tek. Az ELISA érzékenysége 10⁴ és 10⁵ CFU ml⁻¹ baktériumokra és néhány ng/ml vagy kevesebb toxinokra vagy fehérjékre. A minták dúsítása vagy extrakciója szükséges, pl. Clostridium botulinum által termelt toxinok kimutatására az ELISA ELCA (’enzyme-linked coagulation assay’) koaguláció-alapú dúsítást használ a toxin-antitest kimutatására. Az automatizált ELISA 45 perc alatt ad eredményt szemben a manuális eljárással, amely néhány óráig eltart.

Az ELFA (’enzyme-linked fluorescence assay’) fluorogén szubsztrátot használ az érzékenység növelésére.

Az immunprecipitáció (69. ábra): az antitest színes latex gyöngyökkel vagy kolloidális arannyal jelölt (a terhességi gyorstesztek is ezen az elven működnek). Az inokulációs kamra latex-kötött detektáló antitestet tartalmaz, míg a teszt kamra ’capture’ antitestet, mindkettő specifikus az antigénre. A kontroll kamrában pedig olyan ’capture’ antitest található, amely a detektáló antitestre specifikus. Így a minta, amikor végigterül a detektáló párnán/lemezen, először a jelölt detektáló antitesttel képez komplexet, majd ez a komplex a tesztkamrában található ’capture’ antitesthez kötődik, amely egy látható precipitációs csíkot képez. Ha ez a komplex eljut a kontroll kamrába, a 2. ’capture’ antitesttel reagál és egy újabb precipitációs csík képződik. Így a teszt akkor lesz pozitív, ha két precipitációs csík jelenik meg. Az immunprecipitációs teszt nagyon egyszerű, nem igényel mosási lépéseket és 10 perc múlva eredményt ad. Élelmiszerekben patogének kimutatására használják.

69. ábra Az immunprecipitáció elve.

DNS alapú tesztek

Bakteriofágokkal

A fágok nagy specifitással kötődnek egy adott baktériumhoz, ezen alapszik ez a teszt. Például a lux gén (Vibrio, Photobacterium fajokból) inzertált bakteriofágokba, mellyel a Salmonella detektálható tojásban (biolumineszcens ’assay’). A lux gén csak akkor íródik át, ha a fág specifikusan megfertőzi a baktériumot. A kibocsátott fényt luminométerrel detektálják, így akár 10 baktériumot is ki lehet mutatni tejben vagy vizeletben egy óra alatt, dúsítás nélkül. A jég nukleációs módszerben (’bacterial ice nucleation diagnostic’, BIND) az ina gén használják; tiszta, kis mennyiségű víz lefagyasztható -40 °C-ig, de ha nem tiszta, akkor csak -2 °C-ig. Sok patogén (Pseudomonas, Erwinia) olyan ina gén által kódolt fehérjéket tartalmaz, mely ezt a jelenséget okozza. Ha az ina gént fágokba klónozzuk, akkor a fágra specifikus patogén kimutatható a fagyásra érzékeny festék indikátorral. A kimutatási határ: 20 CFU ml⁻¹. De használhatunk lízis ’assay’-t is, pl. L. monocytogenes vagy Salmonella detektálására. Az immunomagnetikus ’assay’-ben S. enterica serovar enteritidis detektálására a mágnesrészecskékhez kikötött baktériumok fágtipizálhatók.

DNS próbákkal

Elsősorban riboszomális RNS (rRNS) kimutatása történik, mivel természetes körülmények között ez viszonylag nagy mennyiségben van jelen a baktériumokban és így érzékenyebb lesz a módszer. Például ilyen a GENE-TRAK (70. ábra), mely a DNS hibridizációt és az ELISA (enzim ’immunoassay’) módszert kombinálja.

70. ábra GENE-TRAK teszt. A kulcseleme ennek a tesztnek egy polidATP-vel jelölt ’capture’ próba és egy fluoreszceinnel jelölt detektor próba (A), mindkettő az rRNS bizonyos darabjaira specifikus. A mintában levő rRNS hibridizál a próbákkal, és ezt követően a próba hibridizálódik (B) egy polidT ’dipstick’-hez (pálca). A nem kötődött minták kimoshatók, majd a torma peroxidázzal (’horseradish peroxidase’, HRP) konjugált antifluoreszcein antitesttel az enzimreakcióban keletkező színes termékkel detektálható a bekötődött minta.

Az ACCUPROBE rendszer a célorganizmus rRNS-ével komplementer, kemilumineszcens jelöléssel ellátott, egyszálú DNS próbát alkalmaz. Miután a riboszómális RNS szabaddá válik a mikroorganizmusból, a jelölt DNS-próba bekötődik és egy stabil DNS-RNS hibridet hoz létre. A nemkötődő próbát hidrolízissel távolítják el a mintából. A jelölt DNS-RNS hibridek mérése luminométerrel történik. Ezek a módszerek használhatóak automatizálásra is, nagyszámú minta elemzésére.

Polimeráz láncreakcióval (PCR)

Egy DNS szálat 10⁶-szorosára amplifikálhatunk néhány óra alatt, és egyszerre több, akár 10 gént is detektálhatunk (pl. S. aureus toxin gének, BAX kit Salmonella fajok detektálására). A specificitás elérése miatt belső kontrollt kell használni (pl. 16S rDNS). PCR-rel egyszerre akár több target gén is detektálható nagyon rövid idő alatt. Hátránya lehet, hogy gyakran a nyers minta PCR-t gátló anyagokat tartalmaz (pl. széklet, szérum és vér, vastartalmú minták, magas fehérje és zsírtartalmú minták), vagy ’false’ negatív eredményt kapunk; mindig a megfelelő módon kell DNS-t tisztítani a mintákból. A fehérjében gazdag minták nagyon gyakran proteázokat tartalmaznak, ezek elbontják a polimerázokat, pl. kagyló, lágy sajtok, csirkehús minták esetén.

További módszerek: ligáz láncreakció; 3SR (’self-sustained sequence replication) vagy nukleinsav alapú szekvencia amplifikálás (’nucleic acid sequence-based amplification’; (NASBA) (Wolcott, 1992) (71. ábra).

71. ábra A NASBA (nukleinsav alapú szekvencia amplifikálás) alapelve.

A 3SR lényege, hogy a primerek polimeráz-kötő hellyel rendelkeznek, ahova a reverz transzkriptáz be tud kötődni. Az RNS a ’target’, háromféle enzimet, reverz transzkriptázt, RNázt és T7 RNS polimerázt tartalmaz a reakció. Az RNS-ből a reverz transzkriptáz kettős szálú DNS-t amplifikál olyan primerekkel, melyek T7 promotert tartalmaznak, ide fog tudni bekötődni az RNS polimeráz. A kettős szálú DNS akkor képződik maradéktalanul, ha az RNS-t az RNáz elbontja. A folyamat izotermális (42 °C) körülmények között zajlik és öngeneráló, amíg az enzimek aktivitása nem szűnik meg, illetve a képződő termékek miatt limitált a folyamat.

További DNS alapú eljárások

Pulzáló mezejű gélelektroforézis segítségével lehetőség van nagyobb méretű DNS, akár kromoszóma szeparálására. Ezt alkalmazzák a ’restriction fragment length polymorphism’ (RFLP) vizsgálat során is, amely epidemiológiai vizsgálatoknál, ribotipizálásra alkalmas. A sokféle PCR alapú módszer közül kiemelhető a kvantitatív PCR. A DNS ’chip’-ek: több ezer ’target’ kimutatására alkalmas lehet. Oligonukleotid chipen 10 fg Bacillus anthracis, Campylobacter jejuni és patogén Vibrio fajok DNS-ét mutatják ki. A ’microarray’ teszteket gyakran immunomágneses szeparálással (IMS) kombinálják, ezzel kiszelektálható a vizsgálandó mikróba.

Immunszenzorok vagy bioszenzorok

A bioszenzor biológiai eredetű érzékelő komponenst tartalmaz, pl. antitestet, enzimet, receptor ligandumot. Ez egy átalakítóval van összekapcsolva, mely a biológiai jelet fizikai, vagy kémiai jellé alakítja: pl. fény, hő, piezoelektromos (tömeg) jel, áram, feszültség, melyet digitálisan mérhetünk (72. ábra). Az 1970-es években alkalmazták először a bioszenzorokat. A diagnosztikában a vér glükóz tartalmának mérésére az 1980-as évek óta használnak bioszenzort. Ezek a szenzorok kisméretűek, hordozhatók, nagy érzékenységűek és gyors detektálást biztosítanak. Az un. első generációs szenzorok közvetlenül mérik egy komponens tulajdonságát, míg a másod- és harmadgenerációs szenzorok valamilyen mediátort alkalmaznak.

72. ábra A bioszenzor működési elve.

Bioszenzorok az élelmiszeriparban

Lehetőséget nyújt 10⁶CFU ml⁻¹E. coli detektálására antitest alapú piezoelektromos kristállyal, de hasonló elven alapul az a bioszenzor, mellyel 10⁴ CFU ml⁻¹Salmonella koncentráció kimutatható. Az eldobható biolumineszcens bioszenzor, amely baktérium kontamináció meghatározására alkalmas élelmiszerekből, a következő felépítésű: mintavevő; kamra, ahol az intracelluláris ATP kivonása zajlik; és egy mikrocső, melyben az ATP elreagál a luciferin-luciferáz reagenssel, amely fényt bocsájt ki. 10³-10⁸ CFU ml⁻¹ baktérium kimutatására alkalmas.

Sajnos élelmiszerek tesztelése nem mindig pontos, mert az alkotóelemek zavarják a mérést, de ha a bioszenzort immunomágneses szeparálással (IMS) egészítik ki, növelhető a mérés érzékenysége. Egy IMS-elektrokemilumineszcens szenzor egy óra alatt 10², 10³ CFU ml⁻¹E. coli vagy Salmonella entericaserovartyphimurium pufferbenvagy 2*102 CFU ml⁻¹ sejt detektálására képes tejben, gyümölcslevekben, felszíni vizekben, vagy darált húsokban. Illékony anyagok detektálására is alkalmaznak bioszenzorokat („elektronikus orr”), ahol a kimutatásra kerülő anyag egy membránhoz kötődik és színváltozást idéz elő. Toxinok kimutatásra alkalmas bioszenzorok is vannak; a toxinokra specifikus gangliozid receptorokat tartalmazza a szenzor diacetilénsav polimerbe ágyazva; ha toxin van a mintában a kékszínű membrán pirosra változik.

A multitoxin bioszenzor ’surface plasmon rezonance’ (SPR) alapon működik, a kötött toxin detektálása tömegspektrometriával történik. Ilyen technikával a Staphylococcus enterotoxin B 1 ng ml⁻¹ koncentrációban mutatható ki tejben, gombában, de ilyen módon kimutatható a toxikus sokk szindróma toxin-1 is. A Salmonella typhimurium szárnyasokból történő gyors detektálása szintén SPR-rel lehetséges, érzékenysége 10⁶ CFU ml⁻¹. Ezt az élelmiszer feldolgozása alatt használják. Az SPR lényege: a polarizált fényt átvezetik egy prizmán, melyen megtörik a fény. A prizma egy aranyrétegen van, melynek a másik felszínére az antigént kötik ki, erről a fény visszaverődik egy szenzorba. A beeső fény egy része elnyelődik, amely töltés hullámok formájában jelenik meg (’surface plasmons’). A visszaverődő fény szöge megváltozik a felszín változásától függően, így akkor is, ha az antigénhez antitest kötődik. A változás mértéke arányos a bekötődő antitest mennyiségével. Ez alkalmazható pl. E. coli detektálásra zöldségekben, pl. saláta, rukkola, sárgarépa.

A potenciometriás bioszenzorra példa az E. coli kimutatására alkalmas szenzor, ahol az E. coli elleni antitestet egy üveglemezre kötik, a jelenlevő E. coli-t pedig a hozzákötődő, ureázzal jelölt másodlagos antitesttel detektálják. Az urea bontásából származó ammónia a pH-t növeli, ezt mutatják ki. A vizsgálat kb. 1-2 óráig tart és megbízható, 10 CFU ml-1 érzékenységű.

A RAPTOR bioszenzor száloptikás szenzort tartalmaz, amellyel 50 CFU ml-1 S. entericaserovartyphimurium detektálható palánta öntözővízből. A CANARY (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risk and Yields) bioszenzor olyan B limfocitákat használ, melyek aquorint expresszálnak. Az aquorin Ca²⁺-szenzitív biolumineszcens fehérje, melyet csalánozók termelnek. Az antigénre specifikus ellenanyagot a sejtmembránon keresztkötve a sejtben megnő a Ca²⁺-szint, amely fénykibocsátáshoz vezet. Például 10³ CFU ml-1 E.coli kimutatása darát marhában 3 perc alatt lehetséges.

A nano-bioszenzorok, nanocsövek nanométeres szinten jelentkező kölcsönhatáson alapuló rendszerek. A nanocső működési elve: szelektív molekuláris felismerésrealkalmas biomolekulát rögzítünk a nanocsövek belső falához kovalens kötéssel. Az immobilizált biomolekula szelektív kölcsönhatásba lép a vizsgált minta célkomponensével. A képződő, pl. antigén-antitest komplex, vagy a DNS szálak esetében kialakult kettős szál megváltoztatja a nanocső átmérőjét és/vagy a belső felület elektromos töltését. A fellépő változás befolyásolja a nanocső átjárhatóságát különböző ionok számára és így kvalitatív és kvantitatív információt szolgáltat a vizsgált komponensről.

A Lab-on-a-chip olyan miniatürizált eszköz (mm²-től néhány cm²-ig), amely több laboratóriumi vizsgálat elvégzésére alkalmas. Pikoliteres mennyiségekből tud adott antigént, mikróbát meghatározni. A chipek fotolitográfiával, dombornyomással, karcolással, galvanizálással készülhetnek. Hordozhatók, rossz feltételek között (pl. fejlődő országokban, ahol nincsenek megfelelő laboratóriumi körülmények) is használhatók; jelenleg elsősorban az orvostudományban kezdenek teret hódítani, de alkalmasak lehet biofegyverek kimutatására akár élelmiszerekből is.

A tesztek előnyei és korlátai

Szükséges a minták dúsítása. A tesztek nagyon gyorsak, általában néhány óra alatt eredményt adnak, de az ezt megelőző dúsítás néhány napig is eltarthat. Azonban a dúsításnak előnyei is vannak: a tesztet gátló inhibítorok kihígulnak, a célsejtek száma elegendő számot ér el, illetve az élő és elpusztult sejtek között is differenciálunk, valamint a sérült sejtek regenerációja is megtörténik dúsítás során. A gyorstesztek esetén a pozitív eredményt standard mikrobiológiai módszerekkel meg kell erősíteni. Ma már van néhány olyan teszt is, amely nem igényel megerősítést. Illetve nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy antitesttel történő teszteknél előfordulhat keresztreaktivitás, valamint a minta keresztfertőződhet a pozitív kontrollal is.

Bizonyos esetekben a megfelelően megválasztott teszt is fontos, mivel az élelmiszerek összetétele meghatározza, melyik teszt működik jól. Például egy élelmiszer komponens zavarja az antigén-antitest kötést, de a DNS teszteket nem és fordítva. Illetve a kontamináló mikróbát egy adott teszt alacsonyabb mennyiségben detektálja, mint egy másik, ezért összehasonlító vizsgálatokra mindenképpen szükség van.

DNS alapú tesztek esetén meghatározható, hogy egy adott toxin génje megtalálható a mikróba genomjában, tehát potenciálisan toxinogén, de lehet, hogy az adott gén nem íródik át. Emellett elpusztult sejtekből is tudunk adott gént amplifikálni PCR-rel és a kapott eredmény nem jelenti azt, hogy egy adott mikróba virulens, élő formában van jelen a mintában. Ezért ebben az esetben például fontos a minta dúsítása, illetve mRNS meghatározása. A leggazdaságosabb tesztek egyszerre több faktort is meg tudnak határozni, például kvantitatív PCR tesztekben egyszerre több gén expressziója detektálható. Egyre több olyan bioszenzort gyártanak, melyekkel egyszerre több toxin vagy többféle baktérium mutatható ki párhuzamosan. A DNS chipekkel pedig egyszerre több ezer gén expressziója vizsgálható. Az újonnan bevezetendő tesztek többlépcsős validálási folyamaton esnek át, mielőtt forgalomba kerülnének.

A ’false’ pozitív teszteket mindig megerősítik, de nem zárhatók ki a ’false’ negatív eredmények sem és ez utóbbi esetben nagyobb a kockázat. Emiatt fontos, hogy a tesztek érzékenysége nagyobb legyen. Illetve kérdéses az is, hogy a jóval kisebb patogén- vagy toxinszint mekkora egészségügyi kockázattal jár.

Forrásmunkák

Doyle, M.P. and Beuchat,L.R. (Eds.) Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers, 3rd edition, Asm Press, Washington, 2007.

Önellenőrzés 12